一种多通道均向牵张应力体外细胞培养装置及工作方法

摘要

本发明提供了一种多通道均向牵张应力体外细胞培养装置及工作方法，包括一种多通道均向牵张应力体外细胞培养装置，包括细胞牵张应力加载装置以及与其连接的多通道培养基板。通过本发明的技术方案，可以方便快速的进行设备的初始化和设置，并且能实时显示设备的运行状况和反馈消息，有效的处理采集的噪声数据，能够精确的控制装置在硅胶膜上的形变大小和频率，满足更多应力加载需求，采用了性能良好的微型计算机树莓派4B作为主控，并且将系统和控制单元分离，使得程序运行更为流畅，数据处理更快，降低了电磁信号的的干扰，从而整个装置的运行更为稳定，尤其是在长时间运行的情况下。

说明书

技术领域

本发明涉及实验仪器技术领域，具体而言，特别涉及一种多通道均向牵张应力体外细胞培养装置及工作方法。

背景技术

细胞力学作为组织工程学的重要组成部分，也是生物力学的一个前沿研究方向。细胞作为生命活动的基本单位，主要由生物大分子构成。人体及动物体内细胞的生长、增殖、分化、凋亡等生物学过程，细胞的生物学表达都与细胞的力学因素的有着直接联系，但由于无法直接对复杂环境的体内细胞进行研究，因而对离体细胞培养和观察是研究细胞力学的重要手段。细胞个体微小，无法肉眼观察，在细胞力学的研究中无法直接地应用常规的力学加载方法，因此研发一种给体外培养的细胞施加机械应力的加载装置对于探究生物体细胞的生长活动规律有着重大意义。

通过模拟体内细胞应力环境，研究细胞特性的实验最早由Glucksmann(Studieson bone mechanics in vitro. I. Influence of pressure on orientation ofstructure.AnatomicalRecord，1939；73：39-56)进行：在肋间肌基质上对鸡胚的胫骨内膜细胞进行培养，将肌肉的萎缩带动肋骨互相靠近时产生的压力作用到培养的细胞上。近年来，更多的体外细胞应力装置被研发出来，目前现有的体外应力装置主要通过离心力加载、压力传导加载、流变学加载以及基底形变加载等方式来实现，其中基底形变加载方式在实验中被越来越广泛的使用，其工作原理就是利用装置真空室内和外界环境的压力差，使培养板上放置的基底材料（一般为硅胶膜）产生拉伸，从而带动生长在基底材料上的细胞进行有规律受力的过程。目前使用广泛、商品化的Flexcell细胞拉伸加载仪器装置(CyclicStretch Enhances Gap Junctional Communication Between Osteoblastic Cells(2)：218-28，1998.)、Petriperm弹力膜培养系统即为基底形变加载方式

现有技术中，对装置的控制都是通过键盘，人机交互能力弱，无法直观的对装置进行控制，设置的参数也无法直观的显示；现有的技术通过压力传感器获得培养室内的压力变化转换成电压信号，通过信号调理电路进行放大，其中会产生较大的噪声以及误差；以及在现有的技术中，硬件的处理性能较差导致装置的整体反应速度较慢，并且在功能上进行有效的拓展时存在困难和不便。针对这些缺点，本专利中新增了HDMI触摸显示屏作为人机交互模块，通过PyQt5制作简单的操作控制界面，使得操作员在使用装置的时候能够得到良好的反馈，以及对装置的运行阶段有清晰的掌握；在处理噪声及误差方面，采用算法降噪，程序开始前首先进行气压环境的自适应调节，对运行数据进行拟合回归，找到装置在当前环境以及参数设置的条件下所达到的最优解，之后会以此最优解对装置进行控制，从而减少噪声以及压力传感器产生的误差对装置运行过程造成的影响。针对装置使用的商品化六孔培养板，对培养板提供的形变率-压力的对应关系进行了曲线拟合，可以精确的控制装置在硅胶膜上的形变大小和频率。同时，采用了性能良好的微型计算机树莓派4B作为主控，使得程序运行更为流畅，数据处理更快，从而整个装置的运行更为稳定，尤其是在长时间运行的情况下。最后，例如申请号为201110377269.8、201922462096.4、200910216647.7，针对目前采用基底形变加载方式的相关装置，现有技术在控制真空室气压变化往往只是单一的控制负压。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，实现组织体外机械应力加载功能，设计了一种给体外培养的细胞施加均向牵张应力的加载装置，可以提供时间长、周期性可控、形变率精确的牵张应力，牵张应力将直接作用到该装置的硅胶膜上，带动附着的细胞一起运动，从而达到对培养的体外细胞进行研究和观察的目标。本发明提供了一种多通道均向牵张应力体外细胞培养装置及工作方法，本装置利用直流调速器和真空泵同时作用于真空室，实现一种数字可调控的压力加载方式，也为类似商业化Flexcell设备的不同的应力加载波形提供基础支持。

本发明是通过如下技术方案实现的：一种多通道均向牵张应力体外细胞培养装置，包括细胞牵张应力加载装置以及通过硅胶管与其连接的多通道培养基板，其中，细胞牵张应力加载装置包括长方体外壳，长方体外壳的一侧内壁上固定安装有微型电脑、继电器、单片机控制模块、直流调速器，单片机控制模块与微型电脑控制连接，长方体外壳的上部设置有人机交互模块，人机交互模块与微型电脑控制连接，长方体外壳的内部右侧安装有电源，长方体外壳的内底面中部平行装有3台真空室，每台真空室的左侧依次连接安装数据采集模块和流量控制器，每台真空室的右侧依次连接安装有2台电磁阀和2台真空泵，真空室顶部设置有空气压力传感器，单片机控制模块分别与真空泵、直流调速器以及电磁阀控制连接，其中，直流调速器与真空泵相连接，真空泵和真空室之间通过电磁阀相连接，电磁阀受与微型电脑连接的继电器控制连接，数据采集模块分别与微型电脑和空气压力传感器通讯连接，电源分别与微型电脑、继电器、单片机控制模块、直流调速器、真空泵、电磁阀、空气压力传感器、数据采集模块、流量控制器和人机交互模块电性连接，长方体外壳外壁上设置有开关；

多通道培养基板分为3个细胞培养基板，每个细胞培养基板上放置4个六孔BioFlex细胞培养板并且内部采用管状结构连通，六孔BioFlex细胞培养板的底部通过密封圈密封，细胞培养基板与六孔BioFlex细胞培养板之间放置1个加载柱，加载柱上有六个基柱，六孔BioFlex细胞培养板上方放置加压块加强密封，细胞培养基板的上表面一端设置有两个硅胶管连接口，硅胶管连接口处安装有连接丝，其中一个硅胶管连接口装有密封阀，另一个硅胶管连接口通过通道与细胞牵张应力加载装置内的其中一台真空室相连通，每个通道通过流量控制器组成相互独立的密闭环境。

作为优选方案，微型电脑采用树莓派Linux内核系统，型号为4b+。

作为优选方案，单片机控制模块采用MSP430系列单片机。

作为优选方案，人机交互模块采用HDMI触摸显示屏，包括显示系统界面、系统设定和操作控制功能。

作为优选方案，数据采集模块采用PCF8591AD/DA转换模块。

作为优选方案，加压块的重量为1kg。

一种多通道均向牵张应力体外细胞培养装置的工作方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤（1）：在开始前，微型电脑完成程序和算法设计，包括界面编程、算法控制以及执行逻辑，实现和其他模块间的信息传递；

步骤（2）：在程序开始时，需要使用者通过人机交互模块进行加载时长(t)、加载频率(f)、加载周期(r)以及形变大小(s)、应力持续时间(t

步骤（3）：程序按照设定的参数首先进行自适应调节，解决的数据采集过程中存在噪声的影响，流程如下：

步骤（3.1）：读取实时压强P、计算对应压强值P

步骤（3.2）：设置计数器idx←0，n←0；

步骤（3.3）：若当前压强P为异常值，则去除，否则n←n+1，并将P和idx存储到X、Y列表中；

步骤（3.4）：如果实时压强值达到当前设定，将列表X的均值、列表Y的均值更新到x_m和y_m中，并计算斜率的临时变量a1和a2的值，

步骤（3.5）：计算当前需要拟合直线的斜率k和截距b，其中k←a1/a2，b←y_m–k*x_m

步骤（3.6）：将k和b存储到K、B列表中，并将计数器idx自增1，idx←idx+1

步骤（3.7）：计算本次误差

步骤（3.8）：若误差e<0.01（实验设定值），则获得监督函数

步骤（3.9）：根据步骤（3.8）获得的监督函数，判断实时压强P，若不为异常，id←id+1（初始值为0），将P存入列表P2中，否则，重复执行步骤（3.9）；

步骤（3.10）：通过比较P

步骤（4）：步骤（3.1）中的计算对应压强值P0，通过拟合六孔BioFlex细胞培养板上硅胶膜受到的压力值和六孔BioFlex细胞培养板上硅胶膜的形变率之间的对应关系得到，关系式为：s=0.0014p

步骤（5）：完成自适应调节后，通过监督函数p(x)处理噪声数据；

步骤（6）：根据设定的加载周期r，为了方便论述，我们假设在某一通道上设置为持续加力12h，间隔12h，设置频率为2Hz，硅胶膜形变率设置为15%；

步骤（6.1）：开始工作后，微型电脑给单片机发送执行指令，单片机给直流调速器发送控制指令，负压真空泵开始工作，此时培养基版内部形成真空环境，内外产生压力差，为培养在培养板上的细胞提供应力；

步骤（6.2）：数据采集模块主要负责实时读取不同通道的真空压力，由PCF8591AD/DA转换模块连接空气压力传感器，并将模拟信号转换成为离散的数字信号，由微型电脑读取；

步骤（6.3）：当数据采集模块监测到s到达设定值时，则单片机控制模块给直流调速器发送控制指令，真空泵开始工作，将培养基版内部的真空环境维持在一个动态平衡的状态；

步骤（6.4）：t0时间执行完成后，单片机控制模块给电磁阀组发送指令，流量控制器打开，真空室立即和外界连通，内外气压相同，培养板上的细胞受力消失，此时细胞完成一个应力加载循环；

步骤（6.5）：在完成一个应力加载周期后，程序自动中断，然后开始下一个加载周期。

本发明由于采用了以上技术方案，与现有技术相比使其具有以下有益效果：

1.本装置通过设计制作人机交互模块，可以方便快速的进行设备的初始化和设置，并且能实时显示设备的运行状况和反馈消息。

2.增加的自适应调节程序可以有效的处理采集的噪声数据。

3.该装置对培养板硅胶膜的形变率和压力关系在BioFlex六孔培养板上进行了曲线拟合，能够精确的控制装置在硅胶膜上的形变大小和频率。

4.装置使用的直流调速器，正负压真空泵以及流量控制器的编程和设计使得压力加载过程具有可调节性，满足更多应力加载需求。

5.装置采用了性能良好的微型计算机树莓派4B作为主控，并且将系统和控制单元分离，使得程序运行更为流畅，数据处理更快，降低了电磁信号的的干扰，从而整个装置的运行更为稳定，尤其是在长时间运行的情况下。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明的结构示意图；

图2为细胞牵张应力加载装置的内部结构示意图；

图3为细胞培养基板的结构示意图；

图4为本发明的模块连接示意图；

图5为拟合的函数曲线及实际测量值示意图；

其中，图1至图3中附图标记与部件之间的对应关系为：

1多通道培养基板，1-1细胞培养基板，1-2连接丝，1-3密封阀，1-4六孔BioFlex细胞培养板，1-5加载柱，1-6加压块，1-7密封圈，1-8硅胶管连接口；

2细胞牵张应力加载装置，2-1微型电脑，2-2继电器，2-3单片机控制模块，2-4直流调速器，2-5电源，2-6真空泵，2-7电磁阀，2-8空气压力传感器，2-9真空室，2-10数据采集模块，2-11流量控制器，2-12人机交互模块，2-13外壳，2-14开关。

3硅胶管。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

下面结合图1至图3对本发明的实施例的多通道均向牵张应力体外细胞培养装置及工作方法进行具体说明。

如图1所示，本发明提出了一种多通道均向牵张应力体外细胞培养装置，包括细胞牵张应力加载装置2以及通过硅胶管3与其连接的多通道培养基板1，多通道培养基板1和细胞牵张应力加载装置2通过硅胶管连接，可实现三个通道同时工作。其中，如图2所示，细胞牵张应力加载装置2包括长方体外壳2-13，长方体外壳2-13的一侧内壁上固定安装有微型电脑2-1、继电器2-2、单片机控制模块2-3、直流调速器2-4，微型电脑2-1采用树莓派Linux内核系统，型号为4b+。单片机控制模块2-3与微型电脑2-1控制连接，单片机控制模块2-3采用MSP430系列单片机。长方体外壳2-13的上部设置有人机交互模块2-12，人机交互模块2-12与微型电脑2-1控制连接，人机交互模块2-12采用HDMI触摸显示屏，包括显示系统界面、系统设定和操作控制功能，用于和树莓派的信息和命令传递。长方体外壳2-13的内部右侧安装有电源2-5，用于为整个装置提供电力。长方体外壳2-13的内底面中部平行装有3台真空室2-9，每台真空室2-9的左侧依次连接安装数据采集模块2-10和流量控制器2-11，数据采集模块2-10采用PCF8591AD/DA转换模块。每台真空室2-9的右侧依次连接安装有2台电磁阀2-7和2台真空泵2-6，真空室2-9顶部设置有空气压力传感器2-8，单片机控制模块2-3分别与真空泵2-6、直流调速器2-4以及电磁阀2-7控制连接，其中，直流调速器2-4与真空泵2-6相连接，真空泵2-6和真空室2-9之间通过电磁阀2-7相连接，电磁阀2-7受与微型电脑2-1连接的继电器2-2控制连接，数据采集模块2-10分别与微型电脑2-1和空气压力传感器2-8通讯连接，电源2-5分别与微型电脑2-1、继电器2-2、单片机控制模块2-3、直流调速器2-4、真空泵2-6、电磁阀2-7、空气压力传感器2-8、数据采集模块2-10、流量控制器2-11和人机交互模块2-12电性连接，长方体外壳2-13外壁上设置有开关2-14；

多通道培养基板1分为3个细胞培养基板1-1，如图3所示，每个细胞培养基板1-1上放置4个六孔BioFlex细胞培养板1-4并且内部采用管状结构连通，用于培养不同类型的细胞，对于实验中不使用的通道可以使用宽透明胶带密封处理。六孔BioFlex细胞培养板1-4的底部通过密封圈1-7密封，细胞培养基板1-1与六孔BioFlex细胞培养板1-4之间放置1个加载柱1-5，加载柱1-5上有六个基柱，使得硅胶膜在向下拉伸时阻断向下的应力，仅提供水平方向的应变力。六孔BioFlex细胞培养板1-4上方放置加压块1-6加强密封，加压块1-6的重量为1kg，和硅胶密封圈的作用相同，均可实现加强密封。细胞培养基板1-1的上表面一端设置有两个硅胶管连接口1-8，硅胶管连接口1-8处安装有连接丝1-2，其中一个硅胶管连接口1-8装有密封阀1-3，另一个硅胶管连接口1-8通过通道与细胞牵张应力加载装置2内的其中一台真空室2-9相连通，每个通道通过流量控制器2-11组成相互独立的密闭环境。六孔BioFlex细胞培养板为易耗材料，和加载柱、细胞培养基板同时购于FlexCell公司。本专利设计的多通道均向牵张力的体外细胞培养装置优点在于软件界面操作简单，控制算法精确，根据使用的BilFlex商品化培养板对真空室内的压力和硅胶膜的形变率进行了曲线拟合，系统稳定可靠，可以快速的拓展到相关的生物医学研究领域，例如对骨细胞、骨骼肌细胞以及血管平滑肌等细胞的培养。

一种多通道均向牵张应力体外细胞培养装置的工作方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤（1）：在开始前，微型电脑完成程序和算法设计，包括界面编程、算法控制以及执行逻辑，实现和其他模块间的信息传递；

步骤（2）：在程序开始时，需要使用者通过人机交互模块进行加载时长(t)、加载频率(f)、加载周期(r)以及形变大小(s)、应力持续时间(t

步骤（3）：程序按照设定的参数首先进行自适应调节，解决的数据采集过程中存在噪声的影响，流程如下：

步骤（3.1）：读取实时压强P、计算对应压强值P

步骤（3.2）：设置计数器idx←0，n←0；

步骤（3.3）：若当前压强P为异常值，则去除，否则n←n+1，并将P和idx存储到X、Y列表中；

步骤（3.4）：如果实时压强值达到当前设定，将列表X的均值、列表Y的均值更新到x_m和y_m中，并计算斜率的临时变量a1和a2的值，

步骤（3.5）：计算当前需要拟合直线的斜率k和截距b，其中k←a1/a2，b←y_m–k*x_m

步骤（3.6）：将k和b存储到K、B列表中，并将计数器idx自增1，idx←idx+1；

步骤（3.7）：计算本次误差

步骤（3.8）：若误差e<0.01（实验设定值），则获得监督函数

步骤（3.9）：根据步骤（3.8）获得的监督函数，判断实时压强P，若不为异常，id←id+1（初始值为0），将P存入列表P2中，否则，重复执行步骤（3.9）；

步骤（3.10）：通过比较P

步骤（4）：步骤（3.1）中的计算对应压强值P0，通过拟合六孔BioFlex细胞培养板上硅胶膜受到的压力值和六孔BioFlex细胞培养板上硅胶膜的形变率之间的对应关系得到，关系式为：s=0.0014p

步骤（5）：完成自适应调节后，通过监督函数p(x)处理噪声数据；

步骤（6）：根据设定的加载周期r，为了方便论述，我们假设在某一通道上设置为持续加力12h，间隔12h，设置频率为2Hz，硅胶膜形变率设置为15%；

步骤（6.1）：开始工作后，微型电脑给单片机发送执行指令，单片机给直流调速器发送控制指令，负压真空泵开始工作，此时培养基版内部形成真空环境，内外产生压力差，为培养在培养板上的细胞提供应力；

步骤（6.2）：数据采集模块主要负责实时读取不同通道的真空压力，由PCF8591AD/DA转换模块连接空气压力传感器，并将模拟信号转换成为离散的数字信号，由微型电脑读取；

步骤（6.3）：当数据采集模块监测到s到达设定值时，则单片机控制模块给直流调速器发送控制指令，真空泵开始工作，将培养基版内部的真空环境维持在一个动态平衡的状态；

步骤（6.4）：t0时间执行完成后，单片机控制模块给电磁阀组发送指令，流量控制器打开，真空室立即和外界连通，内外气压相同，培养板上的细胞受力消失，此时细胞完成一个应力加载循环，其他通道在进行实验时，除了设定的参数存在差异外，执行过程与本步骤相同，因此不再进行描述；

步骤（6.5）：在完成一个应力加载周期后，程序自动中断，然后开始下一个加载周期。

在本发明的描述中，术语“多个”则指两个或两个以上，除非另有明确的限定，术语“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制；术语“连接”、“安装”、“固定”等均应做广义理解，例如，“连接”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。