一种用于灭菌效果监测的生物指示剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于芽孢萌发生长的培养基和用该培养基制备的生物指示剂及他们相应的制备方法。本发明通过特定的培养基，使芽孢萌发产酸时间更快，生物指示剂阅读器检测的响应值更高，响应时间更短，总体上使芽孢萌发检测结果较目前市场成熟生物制剂更快，更准确，具备推广应用价值。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种用于灭菌效果监测的生物指示剂及其制备方法。

背景技术

灭菌是指采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等，灭菌的彻底程度受微生物对灭菌方式的抵抗力、灭菌时间与灭菌方式强度的制约。由于灭菌是获得纯培养的必要条件，现在很多行业领域，如食品工业、医药领域、农业种植都会使用到灭菌技术，灭菌的效果直接关系到行业的质量安全，生产效益。

生物指示剂是一类特殊的活微生物制品，可用于确认灭菌设备的性能，灭菌程序的验证，生产过程灭菌效果的监控等。目前普遍使用的生物指示剂存在检测时间长，降低了涉及灭菌工艺的行业工作效率。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于芽孢萌发生长的培养基，它是由如下重量百分比的原料制备而成：

胰酪蛋白胨0.5～1.5％，脑心浸出液肉汤0.5～1.5％，果糖0.2～0.4％，葡萄糖0.1～0.3％，氯化钾0.05～0.15％，磷酸盐0.05～0.15％，吐温80 0.05～0.2％，丙氨酸0.3～0.7％，赖氨酸0.05～0.15％，缬氨酸0.05～0.15％，2,6-吡啶二羧酸0.17～0.25％，CaCl

进一步地，它是由如下重量百分比的原料制备而成：

胰酪蛋白胨1％，脑心浸出液肉汤培养基1％，果糖0.3％，葡萄糖0.2％，氯化钾0.1％，磷酸盐0.1％，吐温80 0.1％，丙氨酸0.5％，赖氨酸0.1％，缬氨酸0.1％，2,6-吡啶二羧酸0.21％，CaCl

更进一步地，所述磷酸盐为磷酸氢二钾；所述丙氨酸为L-丙氨酸；所述赖氨酸为L-赖氨酸；所述缬氨酸为L-缬氨酸。

本发明还提供了一种生物指示剂，它包括芽孢和前述培养基；所述培养基与芽孢的体积菌落数配比为0.7mL：1×10

进一步地，所述培养基与芽孢的体积菌落数配比为0.7mL：1×10

更进一步地，所述芽孢为嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus的休眠体。

更进一步地，所述芽孢附着在载体上；所述载体为纸片，规格为0.5～1×1～3cm。

更进一步地，所述纸片为特卫强纸，其规格为0.5×2cm。

本发明还提供了一种前述培养基的制备方法，它包括如下步骤：

(1)按配比称取原料；

(2)取4-MUG，用二甲亚砜溶解得4-MUG溶液；取L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸，加配方量5％的水溶解，得氨基酸溶液；取剩余原料，加配方量95％的水溶解，调节pH值至7.4-7.8，灭菌，得培养基母液；

(3)将步骤2)氨基酸溶液与4-MUG溶液，混合，过滤除菌，再与步骤2)培养基母液混合，即得培养基。

进一步地，所述水为蒸馏水。

本发明还提供了一种前述生物指示剂的制备方法，它包括以下步骤：

a、取芽孢，附着于载体上，得菌片；

b、将步骤a的菌片与前述培养基分别置于同一生物指示剂容器中，即得。

进一步地，所述芽孢单面附着于载体上；所述载体为纸片，规格为0.5～1×1～3cm，优选，特卫强纸，规格0.5×2cm；所述培养基与芽孢的体积菌落数配比为0.7mL：1×10

本发明最后提供了一种前述的生物指示剂在制备监测生物灭菌效果的试剂中的用途。

进一步地，所述试剂是监测化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和/或过滤除菌的试剂，优选湿热灭菌。

进一步地，所述湿热灭菌为沸水、蒸气和/或蒸气加压灭菌，优选蒸气加压灭菌。

本发明所述脑心浸出液肉汤是用于培养营养苛求菌的培养基，其配方组成为：

本发明用于生物灭菌效果监测的生物指示剂，通过特定的培养基，使芽孢萌发产酸时间更快，生物指示剂阅读器检测的响应值更高，响应时间更短，总体上使芽孢萌发检测结果较目前市场成熟生物制剂更快，更准确，具备推广应用价值。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1自制菌片

图2检测培养基响应曲线

图3菌体芽孢萌发结果

具体实施方式

实施例1本发明用于芽孢萌发生长的培养基的制备

培养基配方：胰酪蛋白胨10g，脑心浸出液肉汤培养基10g，果糖3g，葡萄糖2g，氯化钾1g，磷酸氢二钾1g，吐温80 1g，L-丙氨酸5g，L-赖氨酸1g，L-缬氨酸1g，2,6-吡啶二羧酸2.1g，CaCl

制备方法

1)按配比称取4-MUG200mg，用0.5mL二甲亚砜溶解，得4-MUG溶液；按配比称取L-丙氨酸，L-赖氨酸和L-缬氨酸，加50mL水溶解，得氨基酸溶液；

2)取剩余原料，加蒸馏水950mL溶解，121℃灭菌20min，得培养基母液。

3)在洁净处，将氨基酸溶液与4-MUG溶液混合，并通过除菌滤膜过滤除菌，加入到培养基母液中，即得用于芽孢萌发生长的培养基。

实施例2本发明用于芽孢萌发生长的培养基的制备

培养基配方：胰酪蛋白胨5g，脑心浸出液肉汤5g，果糖2g，葡萄糖2g，氯化钾0.5g，磷酸氢二钾0.5g，吐温800.5g，L-丙氨酸3g，L-赖氨酸0.5g，L-缬氨酸1g，2,6-吡啶二羧酸1.7g，CaCl

制备方法

1)按配比称取4-MUG，用0.5mL二甲亚砜溶解，得4-MUG溶液；按配比称取L-丙氨酸，L-赖氨酸和L-缬氨酸，加50mL水溶解，得氨基酸溶液；

2)取剩余原料，加蒸馏水950mL溶解，121℃灭菌20min，得培养基母液。

3)在洁净处，将氨基酸溶液与4-MUG溶液混合，并通过除菌滤膜过滤除菌，加入到培养基母液中，即得用于芽孢萌发生长的培养基。

实施例3本发明用于芽孢萌发生长的培养基的制备

培养基配方：胰酪蛋白胨15g，脑心浸出液肉汤15g，果糖4g，葡萄糖3g，氯化钾1.5g，磷酸氢二钾1g，吐温80 2g，L-丙氨酸7g，L-赖氨酸1.5g，L-缬氨酸1.5g，2,6-吡啶二羧酸2.5g，CaCl

制备方法

1)按配比称取4-MUG，用0.5mL二甲亚砜溶解，得4-MUG溶液；按配比称取L-丙氨酸，L-赖氨酸和L-缬氨酸，加50mL水溶解，得氨基酸溶液；

2)取剩余原料，加蒸馏水950mL溶解，121℃灭菌20min，得培养基母液。

3)在洁净处，将氨基酸溶液与4-MUG溶液混合，并通过除菌滤膜过滤除菌，加入到培养基母液中，即得用于芽孢萌发生长的培养基。

实施例4本发明生物指示剂的制备

a、取1×10

b、将步骤a菌片与0.7mL实施例1制备的培养基分别置于同一生物指示剂容器中，其中菌片附着有芽孢的一面朝向生物指示剂容器的管壁，并固定于生物指示剂容器中，即得。

实施例5本发明生物指示剂的制备

a、取1×10

b、将步骤a菌片与0.7mL实施例1制备的培养基分别置于同一生物指示剂容器中，其中菌片附着有芽孢的一面朝向生物指示剂容器的管壁，并固定于生物指示剂容器中，即得。

以下通过试验例来说明本发明的有益效果。

试验例1本发明灭菌生物指示剂效果评价

一、方法

1、检测培养基响应效果对比

通过与市售标准菌片、自制菌片进行验证，上机检测菌片与检测培养基的荧光信号响应，探究检测培养基对芽孢的响应结果。

(1)按设定培养基成分配制检测培养基。

(2)组1：市售标准指示剂1支，使用时，将装有检测培养基的玻璃小管夹破，使菌片与检测培养基接触，再将小管插入检测仪小孔进行检测；

组2：取出市售标准指示剂中的检测培养基，替换为自制检测培养基0.7mL，震摇指示剂小管，上机检测；

组3：装有自制菌片的小管中加入0.7mL自制检测培养基，震摇后上机检测；

其中，菌片的制作方法为：将从中国典型培养物保藏中心购买的嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus(命名为嗜热脂肪芽孢杆菌6X1320)活化、增值，发酵，收集芽孢，取含1×10

(3)导出生物灭菌指示剂响应曲线，对比市售标准指示剂与自制检测培养基指示剂响应曲线。

2、检测培养基对芽孢的萌发效能探究

①菌体产酸效果探究：待指示剂检测仪温度恒定在58℃，在检测小管中加入0.7mL的萌发培培养基与少许芽孢液，震摇检测小管插入检测仪小孔进行培养，每隔20min观察观察一次小管中培养基颜色变化，记录开始变黄和完全变黄的时长。

②萌发效果探究：加入0.7mL的萌发培养基至检测小管中，吸取少量芽孢液于小管中，加以混匀。每隔15min通过染色观察培养基中芽孢的萌发状况(菌体产生时间)。

3、灭菌生物指示剂菌片响应效果对比

实验通过将培养得到芽孢液加至纸片上，探究自制菌片的响应状况。

(1)菌片的制作：将1×10

(2)灭菌生物指示剂响应效果比较：按照市售标准指示剂、自制菌片+自制检测培养基、自制菌片+棉塞+市售标准培养基、自制菌片+棉塞+自制培养基，进行分组比较。，其中棉塞是将菌片固定于检测小管底部的部件，检测时，将菌片与检测培养基接触，放入阅读器上机检测；

(3)导出灭菌生物指示剂响应曲线，标准指示剂响应曲线与实验组响应曲线进行对比，对比各组响应状况，确证菌片的响应效果。

二、结果与分析

1、检测培养基响应效果对比

根据前期试验数据结果确定了本发明检测培养基的成分配比具体为：

胰酪蛋白胨10g，脑心浸出液肉汤培养基10g，果糖3g，葡萄糖2g，氯化钾1g，磷酸氢二钾1g，L-丙氨酸5g，L-赖氨酸1g，L-缬氨酸1g，吐温80 1g，2,6-吡啶二羧酸2.1g，CaCl

本发明检测培养基与市售标准指示剂中的检测培养基响应效果对比结果见表1和图2。

表1检测培养基响应状况

从表1和图2可见：本发明检测培养基响应效果较好，其中自制菌片+自制检测培养基的信号响应要稍优于自制检测培养基+市售标准指示剂菌片。通过对比市售标准指示剂与自制检测培养+市售指示剂菌片的信号响应结果显示，自制培养基要优于市售指示剂的检测培养基。

2、检测培养基对芽孢的萌发效能探究

将少量的嗜热脂肪芽孢杆菌6X1320的芽孢液加至装有0.7mL检测培养基的小管中，经生物灭菌指示剂阅读器检测，结果见表2和图3。

表2检测培养基对芽孢萌发效能参数(min)

从表2及图3可见检测培养基荧光响应：3-6min达峰；30min后开始出现菌体，120min-140min后大部分变为菌体；60min开始变色，160min-180min后完全变黄，由此可见，检测培养基在荧光信号响应速度较快，萌发效果较优；

3.生物指示剂菌片响应效果对比

生物指示剂菌片的响应效果结果见表3

表3菌片响应结果

从表3可见，市售标准指示剂实验结果虽然在30min内显阳性，但整体响应值较低，曲线斜率小；自制菌片响应值高，响应效果好。值得一提的是，本发明所制菌片，在常温放置90天之后信号响应依旧未发生改变(在0min或3min达峰)。

结论：①加棉塞组的响应值要高于未加棉塞组，故使用棉塞对菌片进行固定能提高生物灭菌指示剂的响应值。②自制检测培养基响应效果较市售标准指示剂的检测培养基响应效果更好，能达到实践需求。

综上，本发明用于芽孢萌发生长的培养基，使芽孢萌发产酸时间更快，用其制备的生物指示剂，在生物指示剂阅读器上，检测响应值更高，响应时间更短，总体上使芽孢萌发检测结果较目前市场成熟生物指示剂更快，更准确，具备推广应用价值。