一种基于单基因校正的高通量斑点杂交端粒长度检测方法

摘要

本发明公开了一种检测端粒长度的方法及其应用，属于生物检测技术领域。通过样本变性处理、点样、固定、预杂交、内参探针杂交、第一次洗膜、封闭、抗体孵育、第二次洗膜、显色、曝光、洗脱内参探针和杂交端粒探针，达到通量大、准确性高、样本量低和成本低的技术效果。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测端粒长度的探针及其应用。

背景技术

端粒(英文名：Telomere)是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，端粒短重复序列与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。

现有技术中检测端粒长度的方法很多，包括：金标准Southern Blot方法、荧光FISH方法和q-PCR方法等，但也存在相应的缺点：

Southern Blot方法：Southern Blot方法为业界金标准，但一板胶最多上样16个样本，根据时间安排一批最多处理3张膜，此方法处理样本时需酶切过夜，转膜过夜，三天时间最多可做48个样本的检测，且需要DNA量至少1ug，甚至更多，否则结果背景高；

荧光FISH方法：耗时长，两天以上，批量操作性少，每次只能做10个以内的样本，且FACS设备成本高；

q-PCR方法：实验室间结果变异较大，与southern blot方法之间的相关性低。

因此，如何提供一种简单、快速、准确的端粒长度检测方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种检测端粒长度的探针及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测端粒长度的方法，包括以下步骤：

样本变性处理：

取10-500ng的样本DNA，加入0.1-1M NaOH 300ul，混匀后置于37℃水浴锅中，震荡5-60min后，每管加入缓冲液300ul，混匀，得待点样液；

优选的，所述缓冲液为柠檬酸钠缓冲液；

更优选的，所述柠檬酸钠缓冲液的浓度为2-10x；

优选的，样本DNA浓度为90ng；

点样：

从下到上按底座→胶垫→滤纸→尼龙膜→点样板进行组装，用待点样液点样，通过压力将待点样液移动到尼龙膜上；

优选的，所述压力为抽真空；

固定：

转移完毕后，取出尼龙膜进行固定；

优选的，所述固定为置于多功能交联仪(HL-2000HybriLinkerTM)中固定；

预杂交：

将固定后的尼龙膜用SSC室温润洗2次，加入5-30ml预杂交液，42℃条件下反应20-60min；

优选的，所述预杂交液为罗氏试剂盒中预杂交液，货号：11796895001；

优选的，所述润洗在杂交管中进行；

优选的，所述预杂交的反应装置为杂交炉；

内参探针杂交：

预杂交反应结束后，将预杂交液回收，加入5-30ml单基因内参探针杂交液，42℃条件下，10-14h；

优选的，所述单基因内参探针杂交液包括：所述预杂交液：探针＝ml：2ul；

优选的，所述内参探针杂交的反应装置为杂交炉；

第一次洗膜：

内参探针杂交完成后，洗液I室温洗涤2次，每次3-15min；洗液II室温洗涤2次，每次3-15min；Washingbuffer室温洗涤1次，3-15min；

优选的，所述Washingbuffer为1M马来酸100mL，3M氯化钠50mL，吐温3mL，去离子水847mL；

优选的，所述洗液I包括：2-10倍浓度的柠檬酸钠缓冲液、0.1-1％SDS；

优选的，所述洗液II为十分之一浓度的洗液I；

封闭：

第一次洗膜后，加入Blocking 5-30mL，室温封闭20-60min；

优选的，所述Blocking来自于罗氏试剂盒，货号为11096176001；

抗体孵育：

封闭后，加入5-30mL抗体孵育液室温孵育1-10h；

所述抗体孵育液为Blocking液体+DIG抗体；

第二次洗膜：

抗体孵育后，Washingbuffer室温洗涤2次，每次3-15min；Detectionbuffer室温洗涤1次，3-15min；

优选的，所述Detectionbuffer为氯化钠5.85g,Tris-HCL 12.11g,去离子水溶解后定容至1L；

显色：

第二次洗膜后，取显色液室温显色3-15min；

优选的，所述显色液CDstarReady-to-use；

更优选的，所述CDstarReady-to-use为0.5-3ml；

更优选的，所述CDstarReady-to-use被detection稀释为10-20ml；

优选的，显色液为罗氏产品，货号：12041677001；

曝光：

显色后，将膜进行曝光，记录结果；

优选的，所述曝光置于化学发光显色仪中进行；

洗脱内参探针：

双蒸水冲洗尼龙膜1-5min；0.1-0.5M的NaOH+0.1-0.5％的SDS 37℃洗膜2次，每次10-30min；2-6倍浓度的柠檬酸钠缓冲液浸泡尼龙膜5-15min；

杂交端粒探针：

洗脱内参探针后，将尼龙膜加入5-30ml端粒探针杂交液，42℃条件下10-14h；

优选的，所述端粒探针杂交液为预杂交液：端粒探针＝ml：1-2ul；

优选的，尼龙膜和端粒探针交液杂置于杂交管中反应；

优选的，在杂交炉中进行42℃反应；

重复第一次洗膜-曝光步骤一次。

优选的，内参探针序列如下：

ACCATTTTGATTGGCGATTTTCTTTTTAGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGTAAAGAGTCGTCGATATGCTTTTTGGTAGCTTGCATGCTCAAGTTGGTAGAATGGATGCGTTTGGTATCATTGGTGATAGCTGACAGTGGGTTGAGATTGTCTTCTGTGCTTTCGTCTGTCCTATCTTCAATCTTTCCCTGCCTATGGTGGTGGTACCTTTCTGTTTTTAACCTGGCTATAAATTACCAGATAAACCCATTCACTGATTTGTAACTCCTTTCAGTCATGCTCTAACTGTAAATGAAGGCTTAAACTGAAGTAGAACAGTTACAAGGTTTTACTTGGCAGAACATCTTGCAAGGTAGATGTCTAAGAAGATTTTTTTTTCTTTTTTTAAGACAGAGTTTCGCTCTTGTTTCCCAGGCTGGGGTGCAATGGTGTGATCTTGGCTCAGCGCAACCTCTGCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCATGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCATGCGCCACCACACCTGGCTAATTTTGTATTTTTAGTAGAGGCGGGGTTTCACCATATTGTCCAGACTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCTTGCCCAGCCTAAGAAGATTTTTTGAGGGAGGTAGGTGGACTTGGAGAAGGTCACTACTTGAAGAGATTTTTGGAAATGATGTATTTTTCTTCTCTATATTCCTTCCCTTAATTAACTCTGTTTGTTAGATGTGCAAA

综上所述，本发明公开了一种检测端粒长度的探针及其应用。通过探针配合和检测方法：样本变性处理、点样、固定、预杂交、内参探针杂交、第一次洗膜、封闭、抗体孵育、第二次洗膜、显色、曝光、洗脱内参探针和杂交端粒探针，达到通量大、准确性高、样本量低和成本低的技术效果。

本申请具有下列有益效果：

通量大：该斑点杂交方法：一张膜96个孔，每个样本3个复孔，可测32个样本，而一张膜点样的时间为30-60min，一天根据时间安排可上样至少8张膜，按此计算故三天内即可检测256个样本，且后两天洗膜过程也可穿插进行另一批样本的检测；

测定准确：由内参基因进行校正，可校正DNA样本浓度测定不准确及点样和抽滤过程过程产生的不可避免的等等误差；

需要DNA样本少：该斑点杂交方法每个样本做三个复孔，仅需60-90ngDNA；仅需常规杂交试剂，成本不高；

成本低：该方法无需特殊设备，仅需常规杂交试剂，成本低。

附图说明

图1：做斑点杂交技术的结果示例；A为原始结果图，B为ImageJ软件分析图。

图2：上样量DNA与内参探针杂交后的信号值的标准曲线；A为原始数据从左到右依次为10ng、20ng、30ng、40ng和50ng；B为其信号转换成的坐标图，横坐标为上样的DNA质量，纵坐标为由ImageJ软件分析得到的斑点强度信号值；

图3：端粒探针杂交后的标准曲线；A为原始数据从左到右依次为10ng、20ng、30ng、40ng和50ng；B为其信号转换成的坐标图，横坐标为DNA质量，纵坐标为由ImageJ软件分析得到的斑点强度信号值；

图4：本申请方法得到的相对端粒长度与金标准(Southern Blot)方法得到的端粒长度结果的线性相关分析；横坐标为本申请方法得到的端粒长度，纵坐标为Southern Blot方法得到的端粒长度。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

内参探针序列如下：

ACCATTTTGATTGGCGATTTTCTTTTTAGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGTAAAGAGTCGTCGATATGCTTTTTGGTAGCTTGCATGCTCAAGTTGGTAGAATGGATGCGTTTGGTATCATTGGTGATAGCTGACAGTGGGTTGAGATTGTCTTCTGTGCTTTCGTCTGTCCTATCTTCAATCTTTCCCTGCCTATGGTGGTGGTACCTTTCTGTTTTTAACCTGGCTATAAATTACCAGATAAACCCATTCACTGATTTGTAACTCCTTTCAGTCATGCTCTAACTGTAAATGAAGGCTTAAACTGAAGTAGAACAGTTACAAGGTTTTACTTGGCAGAACATCTTGCAAGGTAGATGTCTAAGAAGATTTTTTTTTCTTTTTTTAAGACAGAGTTTCGCTCTTGTTTCCCAGGCTGGGGTGCAATGGTGTGATCTTGGCTCAGCGCAACCTCTGCCTCCTGGGTTCAAGTGATTCTCATGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCATGCGCCACCACACCTGGCTAATTTTGTATTTTTAGTAGAGGCGGGGTTTCACCATATTGTCCAGACTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCTTGCCCAGCCTAAGAAGATTTTTTGAGGGAGGTAGGTGGACTTGGAGAAGGTCACTACTTGAAGAGATTTTTGGAAATGATGTATTTTTCTTCTCTATATTCCTTCCCTTAATTAACTCTGTTTGTTAGATGTGCAAA

实施例1

取37份人血液DNA样本，分成两份，一份用于本申请监测方法，具体如下：

1.探针制备

(1)端粒探针5’端进行DIG标记，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(2)单基因内参探针使用罗氏公司试剂盒PCRDIGProbeSynthesisKit(Cat.No.11636090910)参照试剂盒protocol进行标记。

2.样本DNA浓度测定

3.样本变性处理

每个样本取90ng(三个复孔，每个复孔只需30ng)于EP管中，加入0.1-1MNaOH300ul，混匀后置于37℃水浴锅中，震荡5-60min后，每管加入2-10倍浓度的柠檬酸钠缓冲液300ul，混匀，待点样。

4.点样

将滤纸和尼龙膜置于SSC中浸泡2-30min；将BIO-DOT仪器按照从下到上“底座→胶垫→滤纸→尼龙膜→点样板”的顺序进行组装，组装完毕并测漏无误后，按照相应顺序进行点样，用真空泵将样本抽滤到尼龙膜上。

5.固定：点样完毕后，取出尼龙膜置于多功能交联仪(HL-2000HybriLinkerTM)中进行固定。

6.预杂交：将尼龙膜置于杂交管中，SSC室温润洗2次，加入5-30ml预杂交液，置于杂交炉中42℃条件下，20-60min；所述预杂交液为罗氏试剂盒中预杂交液，货号：11796895001。

7.内参探针杂交：将预杂交液回收，加入5-30ml单基因内参探针杂交液，杂交炉中42℃条件下10-14h，所述单基因内参探针杂交液包括：所述预杂交液：探针＝ml：2ul。

8.洗膜：

洗液I室温洗涤2次，每次3-15min；所述洗液I包括：2-10倍浓度的柠檬酸钠缓冲液、0.1-1％SDS。

洗液II室温洗涤2次，每次3-15min；所述洗液II为十分之一浓度的洗液I。

Washingbuffer室温洗涤1次，3-15min。

9.封闭：加入Blocking5-30mL，室温封闭20-60min，所述Blocking来自于罗氏试剂盒，货号为11096176001。

抗体孵育：加入5-30mL抗体孵育液室温孵育1-10h；所述抗体孵育液为Blocking液体+DIG抗体。

10.洗膜：

Washingbuffer室温洗涤2次，每次3-15min；Detectionbuffer室温洗涤1次，3-15min。

11.显色：取0.5-3ml CDstarReady-to-use显色液室温显色3-15min；显色液为罗氏产品，货号：12041677001。

12.曝光：将膜置于化学发光显色仪中进行曝光，保存结果。

13.洗脱内参探针：

双蒸水冲洗尼龙膜1-5min；0.1-0.5M的NaOH+0.1-0.5％的SDS 37℃洗膜2次，每次10-30min；2-6倍浓度的柠檬酸钠缓冲液浸泡尼龙膜5-15min；

14.杂交端粒探针：将尼龙膜置于杂交管中加入5-30ml端粒探针杂交液，杂交炉中42℃条件下10-14h；所述端粒探针杂交液为预杂交液：端粒探针＝ml：1-2ul。

15.重复步骤8-13一次。记录本端粒信号值与单基因内参信号值，结果如图2、图3所示。

对比例1

取37人血液DNA样本，分成两份，另一份用于端粒长度测定金标准Sout hern blot方法测。并记录检测结果。

结果分析：

同一样本端粒信号值(图2)与单基因内参信号值(图3)与上样量之间线性良好。

37份人血液DNA样本，斑点杂交方法(dot blot)测定结果与端粒长度测定金标准Southern blot方法测定结果之间具有良好的相关性(r>0.7，如图4)。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。