包含抗间皮素抗体、抗CD3抗体或抗EGFR抗体的融合蛋白、包含所述融合蛋白的双特异性或三特异性抗体，及其用途

摘要

本发明涉及：包含抗间皮素抗体、抗CD3抗体或抗EGFR抗体的片段的融合蛋白；对间皮素和CD3具有特异性的双特异性抗体；对间皮素、CD3和EGFR具有特异性的三特异性抗体；及其用途。根据本发明的双特异性或三特异性抗体可以以高产率和以高纯度进行制备，以及具有优异的肿瘤杀伤和生长抑制作用，并因此可有效地用于癌症治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及包含抗间皮素抗体、抗CD3抗体或抗EGFR抗体的融合蛋白；以及对间皮素和CD3具有特异性的双特异性抗体，以及对间皮素、CD3和EGFR具有特异性的三特异性抗体；及其用途。

背景技术

在抗癌治疗中，单克隆抗体作为第一癌症免疫治疗，不仅在实体癌中而且在血癌中均显示出优异的作用；然而，其仍具有限制性。在这方面，引入了这样的技术：其中对抗体的Fc区进行改造以提高抗体的抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cytotoxicity，ADCC)作用，或者其中对双特异性或三特异性抗体进行开发以使得单一抗体可接近多种靶标。

双特异性抗体是可同时与两种不同抗体结合的抗体，并且可被改造以使得免疫细胞(例如T细胞)仅对特定靶细胞(例如癌细胞)具有毒性并且对其他正常细胞无毒性。这样的双特异性抗体可表现出最大的癌症治疗作用和最小的副作用。因此，开发了数种双特异性抗体形式，并且报道了其适用于T细胞介导的免疫治疗。

然而，存在的问题是在产生双特异性抗体的过程期间共表达时，不同特异性的抗体重链和轻链的错配导致许多非功能性副产物。因此，为了解决该问题，需要开发用于以临床上足够的量和纯度产生期望的多特异性抗体构建体的技术。

发明内容

技术问题

作为进行深入研究以解决现有双特异性抗体的问题的结果，本发明人开发了融合蛋白，其中抗体的重链和轻链通过接头连接并因此作为单链包含在内，以及包含所述融合蛋白的双特异性或三特异性抗体；并且发现这些融合蛋白和抗体解决了错配的问题，并对肿瘤细胞具有高杀伤作用，从而完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供包含抗间皮素抗体、抗CD3抗体或抗EGFR抗体的融合蛋白，以及包含所述融合蛋白的双特异性或三特异性抗体，以及用于使用前述来治疗癌症的方法。

技术方案

为了解决上述问题，在本发明的一个方面中，提供了单链形式的第一融合蛋白，其包含与间皮素特异性结合的抗体和与CD3特异性结合的抗体。

在本发明的另一个方面中，提供了单链形式的第二融合蛋白，其包含与间皮素特异性结合的抗体。

在本发明的又一个方面中，提供了单链形式的第三融合蛋白，其包含与EGFR特异性结合的抗体。

在本发明的又一个方面中，提供了双特异性抗体，其包含第一融合蛋白和第二融合蛋白。

在本发明的又一个方面中，提供了三特异性抗体，其包含第一融合蛋白和第三融合蛋白。

在本发明的又一个方面中，提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包含所述融合蛋白、双特异性抗体或三特异性抗体作为活性成分。

在本发明的又一个方面中，提供了所述融合蛋白、双特异性抗体或三特异性抗体的用途。

在本发明的又一个方面中，提供了用于治疗癌症的方法，其包括向个体施用治疗有效量的用于治疗癌症的药物组合物的步骤。

有益效果

本发明的融合蛋白和包含所述融合蛋白的双特异性抗体或三特异性抗体可以以高产率和纯度来产生，并且由于其优异的肿瘤杀伤和生长抑制作用可有效地用于癌症治疗。

附图说明

图1示出了抗MSLN/抗CD3双特异性抗体(在下文中称为HMI323/HMI323-A15)的示例性示意图。

图2示出了抗EGFR/抗MSLN/抗CD3三特异性抗体(在下文中称为西妥昔单抗(Cetuximab)/HMI323-A15)的示例性示意图。

图3示出了通过对HMI323/HMI323-A15进行尺寸排阻色谱而获得的结果。

图4示出了通过对HMI323/HMI323-A15进行SDS-PAGE而获得的结果。

图5示出了通过对西妥昔单抗/HMI323-A15进行尺寸排阻色谱而获得的结果。

图6示出了通过对西妥昔单抗/HMI323-A15进行SDS-PAGE而获得的结果。

图7示出了通过用荧光激活细胞分选仪(fluorescence activated cell sorter，FACS)测量HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15与H226癌细胞系的结合能力而获得的结果。

图8示出了通过用FACS测量HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15与AsPC-1癌细胞系的结合能力而获得的结果。

图9示出了通过用FACS测量HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15与Jurkat细胞系的结合能力而获得的结果。

图10示出了通过将PBMC和H226癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在24小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图11示出了通过将PBMC和AsPC-1癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在24小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图12示出了通过将PBMC和H226癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在48小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图13示出了通过将PBMC和AsPC-1癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在48小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图14示出了通过将PBMC和H226癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝20∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在48小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图15示出了通过将PBMC和AsPC-1癌细胞系的混合物(以PBMC∶靶细胞＝20∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在48小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图16示出了通过将T细胞和H226癌细胞系的混合物(以T细胞∶靶细胞＝5∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在24小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图17示出了通过将T细胞和H226癌细胞系的混合物(以T细胞∶靶细胞＝5∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在48小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图18示出了通过将T细胞和H226癌细胞系的混合物(以T细胞∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在24小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图19示出了通过将T细胞和H226癌细胞系的混合物(以T细胞∶靶细胞＝10∶1的比率)用HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15进行处理，并随后在48小时之后观察细胞死亡而获得的结果。

图20示出了通过在具有H226异种移植物的NOG小鼠模型中鉴定HMI323/HMI323-A15和西妥昔单抗/HMI323-A15的抗癌作用而获得的结果。

图21示出了通过在具有H226异种移植物的NOG小鼠模型中就肿瘤抑制作用(％)方面将HMI323/HMI323-A15和西妥昔单抗/HMI323-A15与对照进行比较，来鉴定HMI323/HMI323-A15和西妥昔单抗/HMI323-A15的抗癌作用的结果。

图22示出了通过在具有H226异种移植物的NOG小鼠模型中观察免疫T细胞浸润到肿瘤组织中，来鉴定HMI323/HMI323-A15和西妥昔单抗/HMI323-A15的抗癌作用的结果。

图23示出了通过在具有AsPC-1异种移植物的NOG小鼠模型中观察肿瘤尺寸(mm

图24示出了通过在具有AsPC-1异种移植物的NOG小鼠模型中就肿瘤抑制作用(％)方面将HMI323/HMI323-A15和西妥昔单抗/HMI323-A15与对照进行比较，来鉴定HMI323/HMI323-A15和西妥昔单抗/HMI323-A15的抗癌作用的结果。

图25示出了通过在具有AsPC-1异种移植物的NOG小鼠模型中观察免疫T细胞浸润到肿瘤组织中，来鉴定HMI323/HMI323-A15和西妥昔单抗/HMI323-A15的抗癌作用的结果。

图26示出了通过在小鼠血清中分析西妥昔单抗/HMI323-A15的药代动力学(

图27示出了通过在小鼠血清中分析HMI323/HMI323-A15的药代动力学(PK)而获得的结果。

用于实施本发明的最佳方式

在本发明的一个方面中，提供了具有以下结构式1的第一融合蛋白：

[结构式1]

N′-A-B-L1-C-D-L2-E-F-L3-G-H-L4-I-C′

其中N’是该融合蛋白的N端，

C’是该融合蛋白的C端，

A是与间皮素特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：25的轻链CDR1、SEQ ID NO：26的轻链CDR2和SEQ ID NO：27的轻链CDR3，

B是所述抗体的轻链恒定结构域，

C是与间皮素特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：28的重链CDR1、SEQ ID NO：29的重链CDR2和SEQ ID NO：30的重链CDR3，

D是所述抗体的重链恒定结构域中的CH1结构域，

E是与CD3特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：31的轻链CDR1、SEQ ID NO：32的轻链CDR2和SEQ ID NO：33的轻链CDR3，

F是所述抗体的轻链恒定结构域，

G是与CD3特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：34的重链CDR1、SEQ ID NO：35的重链CDR2和SEQ ID NO：36的重链CDR3，

H是所述抗体的重链恒定结构域中的CH1结构域，

I是Fc区或其变体，并且

L1、L2、L3和L4中的每一个均是肽接头。

在本发明中，L1、L2、L3和L4中的每一个可以是由1至50个氨基酸组成的肽接头。

在本发明中，L1和L3中的每一个可以是由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成的肽接头。

在本发明中，L2可以是由SEQ ID NO：44的氨基酸序列组成的肽接头。

在本发明中，L4可以是由SEQ ID NO：45的氨基酸序列组成的肽接头。

在本发明中，L4可以是抗体的铰链区。

在本发明中，A可以是与间皮素特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，B可以是IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体(优选与间皮素特异性结合的抗体)的轻链恒定结构域，所述结构域由SEQ ID NO：46的氨基酸序列组成，或者由与SEQ IDNO：46的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，C可以是与间皮素特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，D可以是IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体(优选与间皮素特异性结合的抗体)的重链恒定结构域中的CH1结构域，所述结构域由SEQ ID NO：47的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，E可以是与CD3特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，F可以是IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体(优选与CD3特异性结合的抗体)的轻链恒定结构域，所述结构域由SEQ ID NO：46的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：46的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，G可以是与CD3特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，H可以是IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体(优选与CD3特异性结合的抗体)的重链恒定结构域中的CH1结构域，所述结构域由SEQ ID NO：47的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，I可以是IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的Fc区或其变体，所述区域或变体由SEQ ID NO：48的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：48的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。另外，I可通过在抗体重链恒定结构域中CH3结构域的一些氨基酸处进行替换来获得。即，SEQ ID NO：48的氨基酸序列可经历替换(Y119C、K130E和K179W)以在抗体重链恒定结构域中的CH3结构域中形成节结构；以及SEQID NO：48的氨基酸序列可经历替换(Q117R、S124C、D169V和F175T)以在其中形成孔结构。

在本发明中，第一融合蛋白可由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成，或者由与SEQ IDNO：1的氨基酸序列具有至少90％、至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明的一个方面中，提供了具有以下结构式2的第二融合蛋白：

[结构式2]

N′-A-B-L1-C-D-L5-J-C′

其中N’是该融合蛋白的N端，

C’是该融合蛋白的C端，

A是与间皮素特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：25的轻链CDR1、SEQ ID NO：26的轻链CDR2和SEQ ID NO：27的轻链CDR3，

B是所述抗体的轻链恒定结构域，

C是与间皮素特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：28的重链CDR1、SEQ ID NO：29的重链CDR2和SEQ ID NO：30的重链CDR3，

D是所述抗体的重链恒定结构域中的CH1结构域，

J是Fc区或其片段，并且

L1和L5中的每一个均是肽接头。

在本发明中，L1和L5中的每一个可以是由1至50个氨基酸组成的肽接头。

在本发明中，L1可以是由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成的肽接头。

在本发明中，L5可以是由SEQ ID NO：45的氨基酸序列组成的肽接头。

在本发明中，L5可以是抗体的铰链区。

在本发明中，第二融合蛋白可由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成，或者由与SEQ IDNO：3的氨基酸序列具有至少90％、至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

J可以是IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的Fc区或其变体，所述区域或变体由SEQ IDNO：48的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：48的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。另外，J可通过在抗体重链恒定结构域中CH3结构域的一些氨基酸处进行替换来获得。即，SEQ ID NO：48的氨基酸序列可经历替换(Y119C、K130E和K179W)以在抗体重链恒定结构域中的CH3结构域中形成节结构；以及SEQ ID NO：48的氨基酸序列可经历替换(Q117R、S124C、D169V和F175T)以在其中形成孔结构。

在本发明的一个方面中，提供了具有以下结构式3的第三融合蛋白：

[结构式3]

N′-K-M-L6-N-O-L7-P-C′

其中N’是该融合蛋白的N端，

C’是该融合蛋白的C端，

K是与EGFR特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：37的轻链CDR1、SEQ ID NO：38的轻链CDR2和SEQ ID NO：39的轻链CDR3，

M是所述抗体的轻链恒定结构域，

N是与EGFR特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域包含SEQ ID NO：40的重链CDR1、SEQ ID NO：41的重链CDR2和SEQ ID NO：42的重链CDR3，

O是所述抗体的重链恒定结构域中的CH1结构域，

P是Fc区或其片段，并且

L6和L7中的每一个均是肽接头。

在本发明中，L6和L7中的每一个可以是由1至50个氨基酸组成的肽接头。

在本发明中，L6可以是由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成的肽接头。

在本发明中，L7可以是由SEQ ID NO：45的氨基酸序列组成的肽接头。

在本发明中，L7可以是抗体的铰链区。

在本发明中，第三融合蛋白可由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。

在本发明中，K是与EGFR特异性结合的抗体的轻链可变结构域，所述结构域由SEQID NO：17的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：17的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，M可以是IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体(优选与EGFR特异性结合的抗体)的轻链恒定结构域，所述结构域由SEQ ID NO：46的氨基酸序列组成，或者由与SEQ IDNO：46的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，N是与EGFR特异性结合的抗体的重链可变结构域，所述结构域由SEQID NO：19的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：19的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

在本发明中，O可以是IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体(优选与EGFR特异性结合的抗体)的重链恒定结构域中的CH1结构域，所述结构域由SEQ ID NO：47的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：47的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

J可以是IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的Fc区或其变体，所述区域或变体由SEQ IDNO：48的氨基酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：48的氨基酸序列具有至少95％并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。另外，I可通过在IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的重链恒定结构域中CH3结构域的一些氨基酸处进行替换来获得。即，SEQ ID NO：48的氨基酸序列可经历替换(Y119C、K130E和K179W)以在抗体重链恒定结构域中的CH3结构域中形成节结构；以及SEQ ID NO：48的氨基酸序列可经历替换(Q117R、S124C、D169V和F175T)以在其中形成孔结构。

在本发明中，第三融合蛋白可由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成，或者由与SEQ IDNO：5的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、并且优选至少99％同源性的氨基酸序列组成。

本文中使用的术语“间皮素(mesothelin，MSLN)”意指包括野生型MSLN及其变体、同种型和旁系同源物(paralog)，其存在于动物，优选人和猴中。另外，术语“人MSLN”是指人来源MSLN。间皮素是40kDa的细胞表面糖蛋白，其存在于正常间皮细胞上并在数种人肿瘤中过表达，所述人肿瘤包括间皮瘤、卵巢腺癌和胰腺腺癌。已表明间皮素在存在白介素3的情况下发挥巨核细胞集落形成活性。间皮素是这样的肿瘤分化抗原，其在正常成人组织(例如间皮)中以低水平存在，并在广泛多种人肿瘤中异常过表达，所述人肿瘤包括间皮瘤，卵巢癌，胰腺癌，宫颈、头颈、外阴、肺和食管的鳞状细胞癌，肺腺癌，子宫内膜癌，双相滑膜肉瘤，结缔组织增生性小圆细胞肿瘤和胃腺癌。

本文中使用的术语“CD3”意指包括野生型CD3及其变体、同种型和旁系同源物，其存在于动物，优选人和猴中。另外，术语“人CD3”是指人来源CD3。作为存在于T细胞表面上的抗原分子的CD3与T细胞抗原受体缔合，并因此充当信号传导系统，从而使T细胞活化。

本文中使用的术语“EGFR”是指作为表皮生长因子受体的膜蛋白，以及还称为ErbB-1或HER1。另外，术语“人EGFR”是指人来源EGFR。

本文中使用的术语“抗体”是指与特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白(Ig)分子，即充当特异性识别抗原的受体的蛋白质分子。抗体作为涵盖完整抗体和抗体片段的概念使用。

本文中使用的术语“重链”意指包括全长重链及其片段二者，其中全长重链包含足以赋予抗原特异性的可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。

本文中使用的术语“轻链”意指包括全长轻链及其片段二者，其中全长轻链包含足以赋予抗原特异性的可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。

本文中使用的术语“CDR”是指作为抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的一部分的互补决定区。

本文中使用的术语“Fc”是指免疫球蛋白的C端区域，该区域是由重链恒定结构域中仅CH2和CH3组成的功能性结构单元之一。Fc没有结合抗原的能力。然而，Fc表现出补体结合活性等，并且具有恒定的氨基酸序列。

本文中使用的术语“铰链区”是指存在于重链的CH1与CH2之间的肽。铰链区具有高度柔性的结构，其中存在一个或更多个半胱氨酸残基，以使得两条重链通过二硫键彼此连接。

在本发明中，铰链区可包含1至3个半胱氨酸残基，例如1、2或3个半胱氨酸残基。

另外，在本发明中，提供了编码上述融合蛋白的多核苷酸。

在本发明中，编码第一融合蛋白的DNA可由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，并且最优选至少99％同源性的核苷酸序列组成。

在本发明中，编码第二融合蛋白的DNA可由SEQ ID NO：4的核苷酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：4的核苷酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，并且最优选至少99％同源性的核苷酸序列组成。

在本发明中，编码第三融合蛋白的DNA可由SEQ ID NO：6的核苷酸序列组成，或者由与SEQ ID NO：6的核苷酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，并且最优选至少99％同源性的核苷酸序列组成。

另外，在本发明中，提供了包含上述融合蛋白编码多核苷酸的表达载体。

另外，在本发明中，提供了通过引入表达载体而转染的宿主细胞。

另外，在本发明中，提供了用于产生融合蛋白的方法，其包括培养宿主细胞的步骤。

在本发明的另一个方面中，提供了双特异性抗体，其包含第一融合蛋白和第二融合蛋白。

本文中使用的术语“双特异性抗体”是指经改造以识别两种不同抗原的单一抗体。

本发明的双特异性抗体同时包含抗MSLN抗体和抗CD3抗体，并因此可与表达MSLN的癌细胞和T细胞特异性地结合，以使得通过诱导免疫细胞活化来引起表达MSLN的癌细胞的增殖抑制或死亡。

在本发明中，为了提供单一抗体，即双特异性抗体，通过将第一融合蛋白与第二融合蛋白结合，每种融合蛋白可在重链恒定结构域中的一些氨基酸残基处发生替换。即，第一融合蛋白和第二融合蛋白的Fc区可通过二硫键或节进孔(knob-into-hole)结构(其中节进孔结构是优选的)彼此连接，以形成双特异性抗体。

本文中使用的术语“节进孔结构”是指通过以下获得的结构：在两个不同Ig重链各自的CH3结构域中诱导突变，以使得在一个Ig重链的CH3结构域中诱导节结构而在另一个Ig重链的CH3结构域中诱导孔结构，以及允许两个结构域形成异二聚体。

通常来说，在形成节结构的氨基酸残基中，用具有小侧链的疏水性氨基酸残基替换具有大侧链的疏水性氨基酸残基；以及在形成孔结构的氨基酸残基中，用具有大侧链的疏水性氨基酸残基替换具有小侧链的疏水性氨基酸残基。然而，本发明不限于此。以这种方式，在其中诱导各个抗体以形成节结构和孔结构的情况下，异二聚体可比同二聚体更容易地形成。

在本发明中，双特异性抗体可包含在第一融合蛋白的I中的节修饰和在第二融合蛋白的J中的孔修饰。或者，双特异性抗体可包含在第一融合蛋白的I中的孔修饰和在第二融合蛋白的J中的节修饰。

在本发明中，双特异性抗体可以是2+1 IgG的形式，并且可由通过以下获得的两条单链组成：用接头将构成抗MSLN或抗CD3 Fab片段的重链和轻链彼此连接以使得各个片段作为单链来表达，以及用肽接头将作为单链的抗MSLN片段和抗CD3 Fab片段彼此连接。

在本发明的另一个方面中，提供了三特异性抗体，其包含第一融合蛋白和第三融合蛋白。

本文中使用的术语“三特异性抗体”是指经改造以识别三种不同抗原的单一抗体。

本发明的三特异性抗体同时包含抗EGFR抗体、抗MSLN抗体和抗CD3抗体，并因此可与表达EGFR或MSLN的癌细胞和T细胞特异性地结合，以使得通过诱导免疫细胞活化来引起表达EGFR或MSLN的癌细胞的增殖抑制或死亡。

在本发明中，为了提供单一抗体，即三特异性抗体，通过将第一融合蛋白与第三融合蛋白结合，每种融合蛋白可在重链恒定结构域中的一些氨基酸残基处发生替换。即，第一融合蛋白和第三融合蛋白的Fc区可通过二硫键或节进孔结构(其中节进孔结构是优选的)彼此连接，以形成三特异性抗体。

在本发明中，三特异性抗体可包含在第一融合蛋白的I中的节修饰和在第三融合蛋白的P中的孔修饰。或者，三特异性抗体可包含在第一融合蛋白的I中的孔修饰和在第三融合蛋白的P中的节修饰。

在本发明中，三特异性抗体可以是2+1 IgG的形式，并且可由通过以下获得的两条单链组成：用接头将构成抗EGFR Fab片段的重链和轻链彼此连接以使得该片段作为单链来表达，用接头将构成抗MSLN或抗CD3 Fab片段的重链和轻链彼此连接以使得各个片段作为单链来表达，以及用肽接头将作为单链的抗MSLN片段和抗CD3 Fab片段彼此连接。

在本发明的又一个方面中，提供了用于治疗癌症的药物组合物，其包含第一融合蛋白、第二融合蛋白、第三融合蛋白、双特异性抗体或三特异性抗体作为活性成分；以及用于在个体中治疗癌症的方法，其包括向个体施用治疗有效量的药物组合物的步骤。

药物组合物可还包含可药用载体。作为可药用载体，黏合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、色素、矫味剂等可用于经口施用；缓冲剂、防腐剂、疼痛减轻剂、增溶剂、等张剂、稳定剂等可用于注射用混合物；以及基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等可用于表面施用。

药物组合物的制剂可通过与如上所述的可药用载体混合以多种方式进行制备。例如，对于经口施用，可将药物组合物以片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式进行配制。对于注射，可将药物组合物以单位剂量安瓿或多剂型的形式进行配制。

药物组合物可以以药物有效量来施用以治疗癌细胞或其转移或者抑制癌症生长。有效量可变化，这取决于多种因素，例如癌症类型、患者的年龄、体重、症状的性质和严重程度、目前治疗的类型、治疗数目、剂型和施用途径，并且可由相应领域的专家容易地确定。

药物组合物可与上述药理学或生理学组分一起或先后施用，以及也可与另外的常规治疗剂组合施用，在这种情况下，药物组合物可与常规治疗剂先后或同时施用。这样的施用可以是单次施用或多次施用。考虑到所有以上因素，重要的是施用为最小量并且允许在无不良作用的情况下获得最大作用的量，并且这样的量可由本领域技术人员容易地确定。

在本发明中，癌症可包括但不限于本领域中已知的任何癌。

在本发明的又一个方面中，提供了第一融合蛋白、第二融合蛋白、第三融合蛋白、双特异性抗体或三特异性抗体用于制造用于在有此需要的个体中治疗癌症的药物的用途。

具体实施方式

在下文中，提供了一些优选的实施例以帮助理解本发明。然而，以下实施例仅是为了更容易理解本发明而给出，并且本发明的范围不限于此。

实施例1.抗MSLN/抗CD3双特异性抗体和抗EGFR/抗MSLN/抗CD3三特异性抗体的产生

实施例1.1.MSLN、CD3或EGFR特异性抗体的产生

为了选择MSLN特异性抗体，用重组人MSLN对小鼠进行免疫接种，并随后从中提取B细胞以克隆多种抗体基因。使用噬菌体展示，将这些基因用于制备抗体文库，并进行与重组人MSLN结合的抗体的克隆。最后，进行抗体人源化以获得由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的HMI323克隆，该氨基酸序列通过由SEQ ID NO：4的核苷酸序列组成的基因来编码。

为了选择对人和猴CD3具有特异性的抗体，将小鼠SP34抗体人源化，并选择以多种亲和力与CD3结合的抗体。其中，获得了由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成的克隆A07、由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的克隆A15以及由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的克隆E15，并且这些氨基酸序列分别通过由SEQ ID NO：22、12和24的核苷酸序列组成的基因来编码。

对于EGFR特异性抗体，使用作为用于结直肠癌的治疗剂的西妥昔单抗。所述抗体由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成，并且该氨基酸序列通过由SEQ ID NO：6的核苷酸序列组成的基因来编码。

实施例1.2.用于抗体表达的载体的转染

实施例1.2.1.用于抗体表达的载体的构建

如图1中所示，如下以这样的方式构建载体，即进行抗MSLN抗体(HMI323)和通过将抗CD3 Fab(A15)与抗MSLN Fab(HMI323)连接而获得的抗体的共表达，以使得具有节进孔结构的双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)表达。

使用In-fusion HD(Takara，Mountain View，CA，USA)，将用于抗MSLN(HMI323)抗体序列的DNA(SEQ ID NO：4)或用于通过将抗CD3 Fab(A15)与抗MSLN Fab(HMI323)连接而获得的抗体序列的DNA(SEQ ID NO：2)插入到每个pCI载体(Promega，Madison，WI，USA)中，并随后用其对大肠杆菌(E.coli)感受态细胞在42℃下进行热休克转化，持续45秒。将转化体平板接种在包含羧苄西林(carbenicillin)的LB板上，并在37℃下在培养箱中将其培养14小时。在培养之后，将培养在板上的转化体菌落接种到2ml包含羧苄西林的LB培养基中，并在37℃下在摇动培养箱中将其培养16小时。然后，从经培养的转化体中提取质粒，并且其测序显示出用于抗体表达的基因被克隆到载体中。

如图2中所示，如下以这样的方式构建载体，即进行抗EGFR抗体(西妥昔单抗)和通过将抗CD3 Fab(A15)与抗MSLN Fab(HMI323)连接而获得的抗体的共表达，以使得具有节进孔结构的三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)表达。

使用In-fusion HD(Takara，Mountain View，CA，USA)，将用于抗EGFR(西妥昔单抗)抗体序列的DNA(SEQ ID NO：6)或用于通过将抗CD3 Fab(A15)与抗MSLN Fab(HMI323)连接而获得的抗体序列的DNA(SEQ ID NO：2)插入到每个pCI载体(Promega，Madison，WI，USA)中，并随后用其对大肠杆菌感受态细胞在42℃下进行热休克转化，持续45秒。将转化体平板接种在包含羧苄西林的LB板上，并在37℃下在培养箱中将其培养14小时。在培养之后，将培养在板上的转化体菌落接种到2ml包含羧苄西林的LB培养基中，并在37℃下在摇动培养箱中将其培养16小时。然后，从经培养的转化体中提取质粒，并且其测序显示出用于抗体表达的基因被克隆到载体中。

实施例1.2.2.将用于抗体表达的载体转染到宿主细胞中

在24小时之前，将密度为2.0×10

使用Opti-MEM I

在125±10rpm下在摇动培养箱中于37℃和8％CO

实施例2.抗MSLN/抗CD3双特异性抗体和抗EGFR/抗MSLN/抗CD3三特异性抗体的纯化

实施例2.1.使用亲和色谱进行纯化

对于使用蛋白A与抗体之间的特异性相互作用来仅分离抗体的实验，将培养溶液以4000rpm离心30分钟，并用0.22μm瓶顶过滤器(bottle top filter)进行过滤以制备从其中去除细胞碎片的上清液。然后，将装有5ml Mabselect PrismA树脂(GE Healthcare)的柱与

在洗涤之后，在流过IgG洗脱缓冲液(Pierce)的同时，将其中UV 280nm值上升的部分以5ml逐份收集在包含5ml结合缓冲液(Pierce)的管中，并立即中和洗脱物。使用Zeba旋转脱盐柱(Thermo Fisher Scientific)用PBS对经中和的洗脱物进行缓冲液更换。

实施例2.2.使用尺寸排阻色谱(SEC)进行纯化

对于使用按尺寸分离的纯化方法从分离的抗体中仅分离200kDa的靶抗体的实验，将Superdex 200 SEC柱(GE Healthcare)与

通过这样做，获得了如表1中所示的结果。

[表1]

实施例3.抗体对MSLN、CD3和EGFR的亲和力的测量

使用Octet系统，分别测量了双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)和三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)对人MSLN、人CD3和人EGFR的亲和力。

具体地，在1X动力学缓冲液中以20μg/ml制备重组人MSLN、CD3和EGFR，并将其以200μl/孔平板接种于96孔板中。使经平板接种的MSLN、CD3和EGFR固定化在氨基丙基硅烷(Aminopropylsilane，APS)传感器(目录号18-5045，Fortebio)上。在10X动力学缓冲液中以100、50、25、12.5和6.25nM制备双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)和三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)，并将其以200μl/孔的浓度进行平板接种。分析每种抗体与固定化在传感器上的重组人MSLN(表2)、人CD3(表3)和人EGFR(表4)中的每一种之间的相互作用以计算抗原-抗体亲和力。结果分别如表2至4中所示。

[表2]

[表3]

[表4]

从如表2至4中所示的测量结果发现，双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)和三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)对人MSLN、人CD3和人EGFR表现出优异的亲和力。

实施例4.抗体对MSLN、EGFR和CD3表达细胞的亲和力的分析

使用流式细胞术鉴定双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)或三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)对特定细胞系是否表现出亲和力。

具体地，准备管，每管包含100μl的FACS缓冲液(2％FBS/鞘缓冲液(sheathbuffer))，向其中以0.5×10

接下来，将每管用0.2μg能够与一抗特异性结合的经荧光染料标记的二抗(经PE标记的抗人IgG)在100μl FACS缓冲液中进行处理。然后，切断光30分钟并在4℃下进行孵育。随后，向其中添加200μl的FACS缓冲液，并以2,000rpm在4℃下进行离心3分钟；并随后去除上清液以获得样品。

向样品添加200μl的BD Cytofix

[表5]

作为分析的结果，如图7至9中所示，发现双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)和三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)二者均与三种类型的细胞系结合。用作无关对照的阴性对照抗体不与三种类型的细胞系中的任一种结合。

实施例5.在存在PBMC的情况下抗体针对肿瘤细胞系的细胞杀伤效力的评价

实施例5.1.靶细胞系的构建

将两种类型的MSLN+肿瘤细胞(H226、AsPC-1)用

实施例5.2.靶细胞系的制备

用1×胰蛋白酶-EDTA溶液收获细胞，并将其以1,200rpm在4℃下离心5分钟。随后，去除上清液并在cRPMI(RPMI，A10491-01+10％FBS+55μMβ-ME)中进行重悬。然后，对细胞数目进行定量。制备各自的细胞系悬浮液，将其以10,000个细胞/孔添加至96孔板，并将板在CO

实施例5.3.外周血单个核细胞的制备

将冷冻保存的外周血单个核细胞(PBMC)在水浴中在37℃下快速解冻，并随后将其转移至50ml锥形管。向其中逐滴添加解冻的培养基(RPMI，11875-093+10％FBS+55μMβ-ME)，并在摇动下进行混合。然后，通过在1,200rpm下在4℃下进行离心10分钟来去除上清液，并在cRPMI中进行重悬。然后，对细胞数目进行定量。

实施例5.4.外周血单个核细胞和抗体的平板接种

将靶细胞平板接种在孔中。在24小时之后，将双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)和三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)中的每一种用cRPMI进行稀释，并随后从20nM开始稀释1/5(浓度范围为0.26pM至20nM)。然后，将PBMC以PBMC∶靶细胞＝20∶1或10∶1的比率进行制备，悬浮在cRPMI中，并随后添加至孔。

实施例5.5.使用IncuCyteS3进行实时细胞测量和分析

在CO

[表6]

[表7]

作为评价的结果，如图10至15中所示，鉴定了双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)和三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)针对两种类型的表达MSLN和EGFR的癌细胞系(H226、AsPC-1)的细胞杀伤作用在PBMC∶靶细胞＝20∶1或10∶1的条件下以剂量依赖性方式表现。另外，通过将无关Ab与CD3抗体连接获得的双特异性抗体(无关/CD3)不诱导细胞死亡。

实施例6.在存在T细胞的情况下抗体针对MSLN+肿瘤细胞系的细胞杀伤效力的评价

实施例6.1.靶细胞系的构建

将两种类型的MSLN+肿瘤细胞(H226、AsPC-1)用

实施例6.2.靶细胞系的制备

用1×胰蛋白酶-EDTA溶液收获细胞，并将其以1,200rpm在4℃下离心5分钟。随后，去除上清液并在cRPMI(RPMI，A10491-01+10％FBS+55μMβ-ME)中进行重悬。然后，对细胞数目进行定量。制备各自的细胞系悬浮液，将其以10,000个细胞/孔添加至96孔板，并将板在CO

实施例6.3.增殖T细胞的制备

将冷冻保存的外周血单个核细胞(PBMC)在水浴中在37℃下快速解冻，并随后将其转移至50ml锥形管。向其中逐滴添加解冻的培养基(RPMI，11875-093+10％FBS+55μMβ-ME)，并在摇动下进行混合。然后，通过以1,200rpm在4℃下进行离心10分钟来去除上清液，并悬浮在MACS培养基(PBS+0.5％FBS+2mM EDTA)中。根据细胞数目向其中添加CD3微珠，并在4℃下进行染色15分钟。使用LS柱仅分离CD3 T细胞。将分离的CD3 T细胞悬浮在X-VIVO中。然后，向其中添加αCD3/28

实施例6.4.T细胞和抗体的平板接种

将靶细胞平板接种在孔中。在24小时之后，将双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)和三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)中的每一种用cRPMI进行稀释，并随后从20nM开始稀释1/5(浓度范围为0.26pM至20nM)。然后，最终以T细胞∶靶细胞＝10∶1或5∶1的比率制备增殖的T细胞，将其悬浮在cRPMI中，并随后添加至孔。

实施例6.5.使用IncuCyteS3进行实时细胞测量和分析

在CO

[表8]

[表9]

作为评价的结果，如图16至19中所示，鉴定了双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)和三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)对两种类型的表达MSLN和EGFR的癌细胞系(H226、AsPC-1)的细胞杀伤作用在T细胞∶靶细胞＝10∶1或5∶1的条件下以剂量依赖性方式表现。另外，通过将无关Ab与CD3抗体连接获得的双特异性抗体(无关/CD3)不诱导细胞死亡。

实施例7.抗体在小鼠中的肿瘤生长抑制效力的分析

为了检查作为T细胞接合抗体而处于开发中的双特异性抗体(HMI323/HMI323-A15)和三特异性抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15)是否具有肿瘤生长抑制效力，将这些抗体施用于肿瘤移植小鼠模型。

实施例7.1.细胞系异种移植模型的建立

将带入到动物室中的小鼠在实验开始之前有约一周的适应期。将H226肿瘤细胞系(1×10

实施例7.2.抗体施用

从注射T细胞之后第2天开始，将PBS或抗体(HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15)以3mg/kg的浓度每周两次进行腹膜内施用(总共4次)。

实施例7.3.肿瘤尺寸的测量

从分组当天至终点，每周两次测量肿瘤尺寸(肿瘤体积(mm

实施例7.4.肿瘤生长率(RTV％)、相对肿瘤生长率(T/C％)和肿瘤生长抑制率(抑制作用)的计算

使用V1/V0方法计算肿瘤生长率(相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)％)。V1意指在测量实验作用时的时间点的体积，并且V0意指在实验开始时的时间点的体积。各组的相对肿瘤生长率(T/C％)是通过各组的平均肿瘤生长率除以PBS组的平均肿瘤生长率(其中平均肿瘤生长率在进行测量时的时间点获得)，并随后将所得值乘以100而获得的值；以及肿瘤生长抑制率(抑制作用)作为100减去相对肿瘤生长率来计算。对于统计学分析，使用单因素ANOVA或双因素ANOVA，这取决于实验类型，并且其中p值小于0.05的情况被确定为在统计学上显著。

实施例7.5.免疫组织化学

在用抗体(HMI323/HMI323-A15或西妥昔单抗/HMI323-A15)对肿瘤生长小鼠进行处理之后一周，将肿瘤样品从其中取出并用福尔马林固定。此后，将样品进行石蜡浸润并包埋，并随后使用切片机以获得石蜡切片。将石蜡切片进行脱石蜡、水合和洗涤；并随后用人CD3(抗CD3，Abcam)或人CD8(抗CD8，Abcam)进行染色。将组织切片用Mayer苏木精(Dako)进行复染并在Olympus BX51显微镜下进行观察。

实施例7.6.实验末期及结果

通过颈脱位或CO

免疫组织化学染色显示，与在PBS组中相比，在抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15或HMI323/HMI323-A15)施用组中，免疫T细胞(染为深色)浸润到肿瘤组织中更高(图22)。如下表10中所示，对于西妥昔单抗/HMI323-A15(其是与间皮素、EGFR和CD3结合的抗体)，从肿瘤异种移植之后第20天表现出100％的肿瘤生长抑制作用，以及对于HMI323/HMI323-A15(其是与间皮素和CD3结合的抗体)，从肿瘤异种移植之后第25天表现出100％的肿瘤生长抑制作用。

[表10]

另外，对于用相对于H226具有相对低表达水平的间皮素的胰腺癌细胞系AsPC-1进行异种移植的小鼠模型，在其中将西妥昔单抗/HMI323-A15或HMI323/HMI323-A15抗体以3mg/kg的浓度总共4次腹膜内施用至小鼠中的情况下，与PBS施用组相比，所有抗体施用组类似地显示出优异的肿瘤生长抑制效力(图23和24)。

免疫组织化学染色还显示，与在PBS组中相比，在抗体(西妥昔单抗/HMI323-A15或HMI323/HMI323-A15)施用组中，免疫T细胞(染为深色)浸润到肿瘤组织中更高(图25)。如下表11中所示，对于西妥昔单抗/HMI323-A15(其是与间皮素、EGFR和CD3结合的抗体)，从肿瘤异种移植之后第20天表现出100％的肿瘤生长抑制作用，以及对于HMI323/HMI323-A15(其是与间皮素和CD3结合的抗体)，从肿瘤异种移植之后第28天表现出100％的肿瘤生长抑制作用。

[表11]

实施例8.抗体在小鼠中的PK分析

为了获得作为T细胞接合抗体而处于开发中的西妥昔单抗/HMI323-A15或HMI323/HMI323-A15的药代动力学(PK)数据，分析了抗体在小鼠血清中的PK参数。

实施例8.1.受试溶液(小鼠血清)的获得

将西妥昔单抗/HMI323-A15或HMI323/HMI323-A15抗体以3mg/kg的浓度注射到小鼠尾静脉中。在注射抗体之后5分钟、1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、120小时、168小时、240小时、336小时、504小时和672小时进行从眶下丛的血液收集。在每组中从3只或更多只动物中收集100μL血液。使血液在室温下凝固约20至30分钟，并随后以10,000rpm离心10分钟以分离血清。

实施例8.2.ELISA测定

将抗人Fab(50ng/100μL/孔)添加至板，并允许反应在4℃下过夜进行。然后，将剩余的溶液完全去除。以200μL/孔向其中添加1％BSA/PBS溶液，并允许反应在室温下进行1小时。然后，将剩余的溶液完全去除。使用1％血清/1％BSA/PBS溶液将标准溶液(标准抗体)调节至1μg/mL，并随后通过将其稀释1/2来制备。受试溶液通过用1％BSA/PBS溶液稀释100倍来制备。

将制备的标准溶液和受试溶液各100μL分配到每个浓度的两个孔中，并允许反应在室温下进行1小时。在反应之后，通过每孔分配300μL的PBST(0.05％吐温20)溶液进行洗涤，总共3次。将抗人Fc-HRP用1％BSA/PBST溶液稀释5000倍，并随后将其100μL分配到每孔中。允许反应在室温下进行1小时。在反应之后，通过每孔分配300μL的PBST(0.05％吐温20)溶液进行洗涤，总共3次。将TMB过氧化物酶底物溶液置于室温，然后进行实验，并将其100μL分配到每孔中。允许反应在室温下进行30分钟。将100μL的TMB终止溶液分配到每孔中，为了更好地混合进行轻轻摇动，并随后在450nm波长处测量吸光度。

将西妥昔单抗/HMI323-A15(其是与间皮素、EGFR和CD3结合的抗体)或HMI323/HMI323-A15(其是与间皮素和CD3结合的抗体)以3mg/kg的剂量注射到裸鼠尾静脉中。然后，在注射之后5分钟、1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、168小时、240小时、336小时、504小时和672小时收集血液，并通过ELISA技术对小鼠血清中的抗体浓度进行定量。结果示于图26和27中。

基于ELISA结果分析PK参数。作为结果，鉴定了西妥昔单抗/HMI323-A15抗体的半衰期为约207.94小时，以及HMI323/HMI323-A15抗体的半衰期为约202.58小时(表12和13)。这些半衰期落在以IgG形式的常见双特异性抗体的半衰期范围内。另外，通过曲线下面积(AUC)外推而获得的值为20％或更低，并因此确保了计算出的PK参数的可靠性。

西妥昔单抗/HMI323-A15的PK参数结果如下表12中所示，以及HMI323/HMI323-A15的PK参数结果如表13中所示。

[表12]

[表13]