一种提高甘薯病毒脱毒率的生物制剂及其应用

摘要

本发明涉及农药领域，特别是涉及一种提高甘薯病毒脱毒率的生物制剂及其应用。本发明提供了一种包括正丁醇溶液和利巴韦林溶液的生物制剂，所述正丁醇溶液和利巴韦林溶液分别独立包装，且结合本发明所述生物制剂在甘薯中的使用方法，能够显著提高甘薯病毒脱毒率。

说明书

技术领域

本发明涉及农药领域，特别是涉及一种提高甘薯病毒脱毒率的生物制剂及其应用。

背景技术

甘薯作为世界重要粮食作物之一。目前，在我国种植面积位居世界第一。但由于甘薯病毒病的普遍存在，严重影响了甘薯品质和产量，限制了甘薯生产的发展。并且甘薯作为无性繁殖作物，通过秧苗、薯块和茎蔓进行繁殖。在生产栽培过程中易受病毒感染，一旦被侵染就很难去除。现已报道的常见甘薯病毒就有甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potatochlorotic stunt virus，SPCSV)、甘薯羽状斑驳病毒(Sweetpotato feathery mottlevirus，SPFMV)、甘薯卷叶病毒(Sweet potato leaf curl virus，SPLCV)和甘薯脉花叶病毒(Sweet potato vein mosaic virus，SPVMV)等19种。SPCSV和SPFMV、SPLCV为我国甘薯主栽区常见的病毒。目前，尚无防治甘薯病毒病的特殊药剂以及高抗病毒病的甘薯品种。利用茎尖分离获得甘薯脱毒苗仍然是防治甘薯病毒病的有效方法。但是，近年来侵染甘薯的病毒种类较多，且存在单独侵染、复合侵染等情况，因此，甘薯的脱毒技术仍然面临较大的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种提高甘薯病毒脱毒率的生物制剂及其应用，所述生物制剂能够显著提高甘薯病毒脱毒率。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种提高甘薯病毒脱毒率的生物制剂，所述生物制剂的有效成分包括独立包装正丁醇溶液和利巴韦林溶液。

优选的，所述正丁醇溶液中正丁醇的质量百分含量为0.2％～0.4％。

优选的，所述利巴韦林溶液的浓度为30～40mg/L。

本发明提供了上述生物制剂在提高甘薯病毒脱毒率中的应用。

优选的，所述病毒包括甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯卷叶病毒。

本发明提供了一种提高甘薯病毒脱毒率的方法，包括以下步骤：

在甘薯苗的叶面喷施3～5次上述生物制剂中的正丁醇溶液后，再喷施5～9次上述生物制剂中的利巴韦林溶液。

优选的，所述正丁醇溶液的喷施频率为2～3d/次，每次喷施时保证叶片湿透但不形成流水。

优选的，所述利巴韦林溶液的喷施频率为2～3d/次，每次喷施时保证叶片湿透但不形成流水。

有益效果：本发明提供了一种包括正丁醇溶液和利巴韦林溶液的生物制剂，且所述正丁醇溶液和利巴韦林溶液分别独立包装。本发明所述生物制剂中正丁醇溶液是磷脂酶D的抑制剂，能够通过外源施加正丁醇抑制磷脂酶D的活性，并减少磷脂酸的产生，从而减少病毒复制所需的脂质分子，使病毒处于钝化状态；利巴韦林溶液对多种植物病毒有明显的抑制作用，通过与病毒的外壳蛋白氨基酸残基发生靶向结合，破坏病毒蛋白粒子的组装，减少病毒对植物的侵染危害；本发明将两者结合使用，可从多方面协同抑制病毒分子的复制和扩增，如病毒粒子的复制、外壳蛋白的组装等，从而更有效的抑制病毒的产生，同时提高植物的病毒脱除率。在本发明具体实施例中，对所述生物制剂进行了模拟实验，利用此技术甘薯病毒脱除率达到88.89％，显著提高了30.07％～63.89％。

具体实施方式

如无特殊要求，本发明所述试剂均为本领域技术人员常规购买所得。

本发明提供了一种提高甘薯病毒脱毒率的生物制剂，所述生物制剂的有效成分包括独立包装正丁醇溶液和利巴韦林溶液。本发明所述正丁醇溶液中正丁醇的质量百分含量优选为0.2％～0.4％，更优选为0.4％；所述正丁醇溶液中的溶剂优选为乙醇；所述乙醇的体积百分含量为100％；所述正丁醇优选购自于上海生工；所述利巴韦林溶液的浓度为30～40mg/L，更优选为40mg/L；所述利巴韦林溶液中的溶剂优选为水；所述利巴韦林优选购自于美国ChemeGen。

本发明所述生物制剂能够从病毒粒子的复制、外壳蛋白的组装等方面来协同抑制病毒分子的复制和扩增，更有效的抑制病毒的产生、从而提高植物的病毒脱除率，可见本发明所述生物制剂能够著提高甘薯病毒脱毒率。

本发明提供了上述生物制剂在提高甘薯病毒脱毒率中的应用。在本发明中，所述病毒优选包括甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯卷叶病毒。采用本发明所述生物制剂脱毒率达到88.89％，显著提高了30.07％～63.89％。

本发明提供了一种提高甘薯病毒脱毒率的方法，包括以下步骤：

在甘薯苗的叶面喷施3～5次上述生物制剂中的正丁醇溶液后，再喷施5～9次上述生物制剂中的利巴韦林溶液。

本发明优选在甘薯苗的叶面喷施4次上述生物制剂中的正丁醇溶液后，再喷施5～9次上述生物制剂中的利巴韦林溶液，最优选为6～8次。在本发明中，所述正丁醇溶液的喷施频率优选为2～3d/次，每次喷施时优选保证叶片湿透但不形成流水；所述正丁醇溶液处理的时间优选为9～10d，更优选为10d；所述利巴韦林溶液的喷施频率优选为2～3d/次，每次喷施优选时保证叶片湿透但不形成流水；所述巴韦林溶液的处理时间优选为10～27d，更优选为15～25d，最优选为18～23d。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种提高甘薯病毒脱毒率的生物制剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将含有病毒(甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯卷叶病毒)的薯块进行盆栽隔离种植，每盆4～5块。

15～22天长出幼芽后，喷施正丁醇溶液进行喷施植株叶面，2～3天喷施一次，共处理10天，每五天取样一次，取样后用解剖镜进行茎尖剥离。

小组设置：

对照组：水；

1组：0.2％的正丁醇溶液；

2组：0.4％的正丁醇溶液。

茎尖离体培养后，进行茎尖离体培养，选取茎尖顶端2cm左右的茎段，剪掉较大的叶片，用清水冲洗4～5遍，将其转移至75％酒精中，浸泡1min，然后用0.4％的次氯酸钠浸泡15min，期间轻轻摇动数次。蒸馏水或灭菌水冲洗4～5遍后，滤干水分在解剖镜下剥取最顶端的分生组织，放在MS再生培养基上，再生成苗。

待其成苗后，选取茎尖离体再生植株叶片，采用植物基因组/RNA提取(天根生化科技)试剂盒提取再生植株基因组DNA和RNA作为模板，对SPLCV、SPCSV病毒进行实时定量PCR病毒检测(参考乔奇等撰写的《中国甘薯病毒种类的血清学和分子检测》)，分别统计脱毒苗、病毒苗数，检测结果如表1所示。

表1病毒苗正丁醇处理后茎尖离体再生检测情况

由表1记载的可知，空白组、1组和2组含SPLCV病毒的百分比分别为70.83％、70％、44.26％；空白组、1组和2组含SPCSV病毒的百分比分别为4.17％、10％、15.33％；空白组、1组和2组脱毒率分别为25％、20％、40.41％。可见，本试验中前期未经正丁醇溶液处理(对照组)，利用单一的茎尖离体培养，脱毒率达到25％；喷施0.2％的正丁醇溶液后，脱毒率为20％，有所降低，病毒苗有所增加；喷施0.4％的正丁醇溶液后，单一的茎尖离体培养脱毒率达到40.41％。

实施例2

将含有病毒(甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯卷叶病毒)材料的薯块进行盆栽隔离种植，每盆4～5块。

15～22天长出幼芽后，喷施利巴韦林制剂喷施植株叶面。

小组设置：

对照组：水；

1组：喷施10mg/L的利巴韦林溶剂；

2组：喷施20mg/L的利巴韦林溶剂；

3组：喷施30mg/L的利巴韦林溶剂；

4组：喷施40mg/L的利巴韦林溶剂。

茎尖离体培养后，进行茎尖离体培养，培养方法同应用例1，对成苗SPLCV、SPCSV病毒检测，检测方法同应用例1，检测结果见表2。

表2植株检测情况

由表2记载的可知，1～3组，即喷施10mg/L、20mg/L、30mg/L及40mg/L利巴韦林后脱毒率分别为20％、30％、30.3％、28.57％。可见单独喷施利巴韦林最高脱毒率可达到30.3％。

实施例3

将含有病毒(甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯卷叶病毒)的薯块进行盆栽隔离种植，每盆4～5块。

15～22天长出幼芽后，喷施正丁醇溶液进行喷施植株叶面，2～3天喷施一次，共处理10天。

再喷施利巴韦林制剂喷施植株叶面。

小组设置：

对照组：0.2％的正丁醇溶液；

1组：0.2％的正丁醇溶液+10mg/L的利巴韦林溶液；

2组：0.2％的正丁醇溶液+20mg/L的利巴韦林溶液；

3组：0.2％的正丁醇溶液+30mg/L的利巴韦林溶液；

4组：0.2％的正丁醇溶液+40mg/L的利巴韦林溶液。

茎尖离体培养后，进行茎尖离体培养，培养方法同应用例1，对成苗SPLCV、SPCSV病毒检测，检测方法同应用例1，检测结果见表3。

表3植株检测情况

由表3记载的可知，对照组的脱毒率为22.22％，喷施10mg/L、20mg/L、30mg/L及40mg/L利巴韦林后脱毒率分别为58.33％、71.43％、33.33％。可见，经0.2％正丁醇溶液后，喷施不同浓度利巴韦林溶液，仅20～30mg/L的利巴韦林溶液脱毒效果稍好，最高脱毒率达到63.26％，其他均不明显。

实施例4

将含有病毒(甘薯褪绿矮化病毒、甘薯羽状斑驳病毒和甘薯卷叶病毒)的薯块进行盆栽隔离种植，每盆4～5块。

15～22天长出幼芽后，喷施正丁醇溶液进行喷施植株叶面，2～3天喷施一次，共处理10天。

再喷施利巴韦林制剂喷施植株叶面。

小组设置：

对照组：0.4％的正丁醇溶液；

1组：0.4％的正丁醇溶液+10mg/L的利巴韦林溶液；

2组：0.4％的正丁醇溶液+20mg/L的利巴韦林溶液；

3组：0.4％的正丁醇溶液+30mg/L的利巴韦林溶液；

4组：0.4％的正丁醇溶液+40mg/L的利巴韦林溶液；

5组：0.4％的正丁醇溶液+5mg/L的大黄素甲醚；

6组：0.4％的正丁醇溶液+10mg/L的大黄素甲醚。

茎尖离体培养后，进行茎尖离体培养，培养方法同应用例1，对成苗SPLCV、SPCSV病毒检测，检测方法同应用例1，检测结果见表4。

表4植株检测情况

由表4记载的可知不同浓度的正丁醇溶液和利巴韦林溶的配比筛选结果，空白组的脱毒率为53.34％，1～3组，即喷施10mg/L、20mg/L、30mg/L及40mg/L利巴韦林溶液后脱毒率分别为40％、58.82％、65.34％、88.89％，5组和6组，即喷施5mg/L、10mg/L大黄素甲醚脱毒率为45.45％、25％；可见，经0.4％正丁醇溶液后，喷施不同浓度利巴韦林溶液，喷施30～40mg/L的利巴韦林溶液脱毒效果较好，最高脱毒率达到88.89％，相比于对照组、1组、2组、5组和6组，脱毒率提高了36.04％～255.56％，脱毒效果显著优于其他组合，由上述可知，正丁醇溶液和利巴韦林溶液具有协同作用，从病毒复制和修饰合成角度来抑制病毒的合成，从而达到脱除病毒的目的。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。