一种清金化痰汤生物限值测定方法

摘要

本发明公开了一种清金化痰汤生物限值测定方法，属于药物分析检测技术领域，步骤如下：步骤1、配制清金化痰汤水提物冻干粉溶液和LPS溶液，培养RAW264.7巨噬细胞；步骤2、监测RAW264.7巨噬细胞接种密度与孵育时间的关系；步骤3、监测清金化痰汤水提物冻干粉溶液对RAW264.7细胞活力的影响；步骤4、测定基于RAW264.7巨噬细胞分泌功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物活性限值；步骤5、测定基于RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物活性限值；步骤6、数据处理；本发明通过建立关联其功效及药理作用的生物活性测定方法，对清金化痰汤的质量控制具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析检测技术领域，具体地，涉及一种清金化痰汤生物限值测定方法。

背景技术

清金化痰汤来源于明代叶文龄所著的《医学统旨》，由黄芩、栀子、贝母、桑白皮、瓜蒌仁、橘红、桔梗、麦冬、知母、茯苓、甘草11味药物组成，其清热润肺、化痰止咳的功效显著，是《古代经典名方目录(第一批)》100首经典名方之一。为充分保证和发挥其临床疗效，建立科学全面的质量控制方法具有重要意义。常用的中药质控方法包括药材的外观形状鉴别、化学定性鉴别、指标成分检测、化学指纹图谱等。但由于中药化学成分复杂，应用单一的质控方法难以全面控制其质量并反映临床疗效。生物活性测定是指结合中药及其制剂的功能主治或毒副作用，寻找在生物体上的适宜反应，从而更加全面有效地评价和控制中药质量，完善中药质量评价体系，保证药物临床使用的安全有效。近年来已经有不少研究报道了将生物活性测定应用于对中药生物效应评价的研究，且水蛭生物活性测定已作为质量控制方法之一被药典收载，将生物活性测定应用于中药质量控制领域已经成为一种趋势。

因清金化痰汤组方及所含化学成分复杂，通过文献检索发现，关于清金化痰汤物质基准及质量控制的研究报道鲜少，因此建立关联其功效及药理作用的生物活性测定方法，对清金化痰汤的质量控制具有重要意义。

本发明结合清金化痰汤抗炎及免疫调节的药理作用，建立了基于RAW264.7巨噬细胞吞噬及分泌功能的生物限值测定方法，用于清金化痰汤的质量控制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种清金化痰生物限制测定方法。

本发明需要解决的技术问题为：

因清金化痰汤组方及所含化学成分复杂，通过文献检索发现，关于清金化痰汤物质基准及质量控制的研究报道鲜少，因此建立关联其功效及药理作用的生物活性测定方法，对清金化痰汤的质量控制具有重要意义。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种清金化痰汤生物限值测定方法，具体包括如下步骤：

步骤1、配制清金化痰汤水提物冻干粉溶液和LPS溶液，培养RAW264.7巨噬细胞；

步骤2、监测RAW264.7巨噬细胞接种密度与孵育时间的关系；

步骤3、监测清金化痰汤水提物冻干粉溶液对RAW264.7细胞活力的影响；

步骤4、测定基于RAW264.7巨噬细胞分泌功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物活性限值；

步骤5、测定基于RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物活性限值；

步骤6、数据处理，利用IBM SPSS Statistics 19.0统计软件对实验数据进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P<0.05为有统计学意义。

其中，步骤4具体包括以下步骤：

步骤A1、测试清金化痰汤水提物冻干粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6含量的影响

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为3×10

步骤A2、测定清金化痰汤水提物冻干粉的的限值剂量

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为3×10

步骤A3、进行重复性和方法适用性验证

重复性：取各批次的清金化痰汤水提物冻干粉，使终质量浓度为500μg·mL

方法适用性：取各批次清金化痰汤水提物冻干粉作用于RAW264.7巨噬细胞后，测定其对1μg·mL

进一步地，所述清金化痰汤水提物冻干粉溶液配制的具体步骤如下：

精密称取各批次清金化痰汤水提物冻干粉，加入DMEM完全培养基溶解，使用0.22μm微孔滤膜过滤，配制为1.0g·L

进一步地，所述LPS溶液配制的具体步骤如下：

将LPS粉末和PBS缓冲液按照1mg：1mL混合均匀，然后用0.22μm微孔滤膜过滤，配制为1g·L

进一步地，培养RAW264.7巨噬细胞的步骤如下：将RAW264.7巨噬细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，置于37℃，5％CO

进一步地，步骤2的具体方法为：

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为1×10

进一步地，步骤3的具体方法为：

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为3×10

进一步地，步骤5所述的测定基于RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物活性限值，具体步骤如下：

步骤B1、清金化痰汤水提物冻干粉限值剂量的测定

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为3×10

步骤B2、重复性监测

取一组清金化痰汤水提物冻干粉溶液使终质量浓度为500μg·mL

步骤B3、中间精密度监测

同实验室不同实验人员采用500μg·mL

步骤B4、方法适用性监测

按照步骤B1的方法，将待检批次作用于RAW264.7巨噬细胞后，测定其吞噬指数，并对实验结果进行评价。

进一步地，步骤3试验结果表明清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度为62.5～250μg·mL

进一步地，步骤4试验结果表明清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度≥125μg·mL

进一步地，步骤5试验结果表明清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度≥500μg·mL

进一步地，清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度≥125μg·mL

本发明的有益效果：

本发明结合清金化痰汤抗炎的生物活性，建立了LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，通过监测清金化痰汤对RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-1β、IL-6含量的影响，发现125、250、500μg·mL

此外，根据已有研究表明清金化痰汤可通过免疫调节的药理作用改善患者的临床症状，本发明针对清金化痰汤免疫调节的药理活性，建立了基于巨噬细胞吞噬功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物限值测定方法，结果表明，当清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度为62.5～250μg/mL时，对巨噬细胞的增殖具有明显的促进作用，且当质量浓度为125μg/mL时，其促增殖作用最强，当浓度为500ug/mL时，对巨噬细胞既无明显毒性也无明显促增殖作用，但在此剂量下对其吞噬功能具有明显的促进作用，其吞噬指数为111％～121％，针对清金化痰汤水提物冻干粉对巨噬细胞吞噬功能影响的分析表明，清金化痰汤水提物冻干粉对巨噬细胞吞噬功能的促进作用可表现为促进巨噬细胞的吞噬能力从而提高其吞噬指数，在本发明研究中，为了增加方法的可靠性和保证实验结果的重复性，选择500μg/mL的质量浓度作为限值剂量，吞噬指数大于111％，可判断为质量合格；

综上，本发明结合清金化痰汤抗炎及免疫调节的药理活性，建立了RAW264.7巨噬细胞炎症及中性红吞噬的生物效应模型，以清金化痰汤水提物冻干粉对RAW264.7巨噬细胞分泌炎症因子IL-6的抑制能力和对中性红的吞噬能力为评价指标，作为清金化痰汤水提物冻干粉生物评价方法，当任意指标合格即可判断其质量合格，且该实验方法简单易行，可快速直观地评价药物的生物活性，重现性和精密度较好，可对现有的质量评价体系进行补充和完善，通过多种评价方法的整合，保证清金化痰汤临床使用的安全有效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中监测RAW264.7巨噬细胞接种密度与孵育时间关系测定结果的折线图。

图2为本发明中各批次清金化痰汤水提物冻干粉对RAW264.7细胞活力的影响柱状图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

由图1-2所示，一种清金化痰汤生物限值测定方法，具体包括如下步骤：

步骤1、配制清金化痰汤水提物冻干粉溶液和LPS溶液，培养RAW264.7巨噬细胞；

其中，清金化痰汤水提物冻干粉溶液配制过程如下：将天津药物研究院有限公司提供的19112606、19112607、19112608、19112609、19112610批次的清金化痰汤水提物冻干粉分别加入到DMEM完全培养基溶解，使用0.22μm微孔滤膜过滤，配制为1.0g·L

LPS溶液的制备过程如下：

将25mg的LPS粉末加入25mg的PBS中完全溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，配制为1g·L

吞噬细胞的培养过程如下：

将RAW264.7巨噬细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，置于37℃，5％CO

步骤2、监测RAW264.7巨噬细胞接种密度与孵育时间的关系；

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为1×10

结合显微观察，当细胞密度为3×10

步骤3、监测清金化痰汤水提物冻干粉溶液对RAW264.7细胞活力的影响；

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为3×10

测试结果如图2所示，其中A代表批次19112607，B代表批次19112608，C代表批次19112609；

由图2可以看出，当质量浓度在62.5～500μg·mL

步骤4、测定基于RAW264.7巨噬细胞分泌功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物活性限值；

步骤A1、测试清金化痰汤水提物冻干粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IL-1β、IL-6含量的影响

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为3×10

表1清金化痰汤对RAW264.7巨噬细胞IL-1β、IL-6含量的影响(

注：与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与LPS模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

由表1实验结果可知，终质量浓度为62.5、125、250、500μg·mL

步骤A2、测定清金化痰汤水提物冻干粉的的限值剂量

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为3×10

表2清金化痰汤水提物冻干粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6含量的影响(

注：与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与LPS模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

由表2可以看出，当清金化痰汤水提物冻干粉终质量浓度为500μg·mL

步骤A3、进行重复性和方法适用性验证

重复性：分别取终质量浓度为500μg·mL

表3清金化痰汤水提物冻干粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6含量的影响(

综合19112607批次制剂多次试验结果，125μg·mL

方法适用性：取19112607、19112610两个批次的清金化痰汤水提物冻干粉，使终质量浓度为500μg·mL

表4清金化痰汤水提物冻干粉对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞分泌IL-6含量的影响(

注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01

由表4可以看出，批次19112606和19112610对1μg·mL

步骤5、测定基于RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的清金化痰汤水提物冻干粉生物活性限值；

步骤B1、清金化痰汤水提物冻干粉限值剂量的测定

取对数生长期RAW264.7巨噬细胞，调整细胞悬液浓度为3×10

表5清金化痰汤水提物冻干粉和LPS对巨噬细胞吞噬功能的效应(

由表5可知，终质量浓度为500μg·mL

步骤B2、重复性监测

取19112607组清金化痰汤水提物冻干粉溶液使终质量浓度为500μg·mL

表6清金化痰汤水提物冻干粉对巨噬细胞吞噬功能的效应(

结果显示其吞噬指数为124.77％±4.06％，RSD值为3.25％，重复性良好。

步骤B3、中间精密度监测

同实验室不同实验人员采用500μg·mL

表7清金化痰汤水提物冻干粉对RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的效应(

由表7可知，吞噬指数为126.00％±6.32％，RSD值为5.02％，表明本方法精密度较好；

步骤B4、方法适用性监测

按照步骤B1的方法，19112610批次作用于RAW264.7巨噬细胞后，测定其吞噬指数，结果如表8所示，

表8清金化痰汤水提物冻干粉对RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的效应(

由表8可以看出，19112610批次作用于RAW264.7巨噬细胞后其吞噬指数为123.18％±2.86％，且RSD值为2.32％，判断合格；

步骤6、数据处理，利用IBM SPSS Statistics 19.0统计软件对实验数据进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P<0.05为有统计学意义。

综上所述，清金化痰汤水提物冻干粉质量浓度≥125μg·mL

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。