一种小儿化痰止咳颗粒中三种生物碱的同时测定方法

摘要

本发明涉及一种小儿化痰止咳颗粒中三种生物碱的同时测定方法。其特征：首次采用HPLC法，以普通的等度洗脱、反相色谱柱，体积比为1.5～2.5∶12.5～11∶86～86.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；205nm为检测波长；同时测定了小儿化痰止咳颗粒中盐酸麻黄碱、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱的含量，结束了吐根生物碱类一直无HPLC测定方法和小儿化痰止咳颗粒无定量测定指标的历史。发明方法只需用甲醇超声样品后，吸取一定量续滤液，氧化铝柱除杂，即可进样测定。三种生物碱波峰分离良好，基线平稳，30分钟检测完毕。实现了简便、快捷、科学、规范、一测多评的质控目标，确保了小儿化痰止咳颗粒用药的安全、有效。

说明书

技术领域

本发明涉及一种小儿化痰止咳颗粒中三种生物碱的同时测定方法。

背景技术

小儿化痰止咳颗粒为部颁标准第九册收载的品种，标准号：WS₃-B-1691-94。由桔 梗流浸膏10ml、桑白皮流浸膏15ml、吐根流浸膏3ml、盐酸麻黄碱0.375g组成。具有祛 痰镇咳之功效，为小儿用药。用于小儿咳嗽，支气管炎。全国拥有本制剂的生产厂家数 十家，目前有3种规格。其制备方法是：按处方量，将桔梗流浸膏、桑白皮流浸膏、吐 根流浸膏和盐酸麻黄碱的水溶液，枸橼酸0.208g与枸橼酸钠2.08g的水溶液，依次加入 糖粉中，混匀，制成颗粒，干燥，喷入食用香精的乙醇溶液适量，混匀，制成600g，规 格是每袋装3g；或制成800g，规格是每袋装4g；或制成1000g，规格是每袋装5g，即得。 虽然规格不同，但每袋所含的药材量是相同的。

因为是小儿用药，除盐酸麻黄碱含量稍高一些外，其他三味流浸膏含量都很低微。 即每袋含桔梗流浸膏0.05ml、桑白皮流浸膏0.075ml、吐根流浸膏0.015ml、盐酸麻黄碱 1.875mg。所以原标准只收载了盐酸麻黄碱和吐根的薄层鉴别，无任何定量测定指标，无 法准确控制小儿用药的安全有效。以至于市场上出现了生产厂家不同，样品的含量相差 较大，盐酸麻黄碱在处方投料量的78～104％；盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱之和在理论投 料量的55～89％，高低相差较大，都达不到理论量。之所以出现该情况，原因是原料药 吐根药材和吐根浸膏的含量都是通过酸碱滴定，以吐根碱计的总碱含量，其准确性难以 保证，致使制剂的含量出现了较大偏差，无法准确检测小儿用药的质量。

查阅文献得知，麻黄碱和吐根所含的吐根酚碱与吐根碱都是化痰止咳的有效成分， 但后者又具较大的毒性，所以在吐根浸膏和吐根酊剂中是控制上、下限度的。但其含量 测定方法，不论是中国的法定标准、还是美国药典、或欧洲药典收载的，都是采用传统 的酸碱滴定法，测定总碱含量。且方法繁琐、费时、污染环境、准确性欠佳。到目前为 止，还未查阅到任何有关采用HPLC法测定吐根酚碱与吐根碱的报道。

在上述背景情况下，为简便、快捷、科学、规范、多指标控制小儿用药的质量，发 明了小儿化痰止咳颗粒中盐酸麻黄碱、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱同时测定方法。

发明内容

首次采用普通的等度洗脱，以体积比为1.5～2.5∶12.5～11∶86～86.5的乙腈- 甲醇-0.1％磷酸为流动相，在205±2nm处，同时测定了小儿化痰止咳颗粒中盐酸麻黄碱、 盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱含量。方法简便、快捷，易于普及掌握。在三种不同的色谱 柱上，三种成分的定量色谱图，各波峰分离良好，基线平稳，在30分钟内出峰完毕。

通过方法学考察，盐酸麻黄碱进样量在0.07936～0.7936μg，与峰面积呈良好的线 性关系，回归方程为：Y＝2329175.7X-2226，γ＝0.999999(见表1、图1)；盐酸吐根酚碱 进样量在0.02223～0.33345μg，与峰面积呈良好的线性关系，回归方程为：Y＝5360896X +1642，γ＝0.99997(见表2、图2)；盐酸吐根碱进样量在0.0321～0.321μg，与峰面积呈 良好的线性关系，回归方程为：Y＝6856886.5X-18354，γ＝0.99997(见表3、图3)。采用 加样回收实验，结果表明：盐酸麻黄碱的平均回收率为99.56％(n＝9)，RSD为0.79％(见 表4)；盐酸吐根酚碱的平均回收率为97.91％(n＝9)，RSD为1.54％(见表5)；盐酸吐根碱 的平均回收率为98.99％(n＝9)，RSD为2.15％(见表6)。精密度(见表7)、稳定性(见表 8)、重复性(见表9)、专属性(见图4、5、6)与柱耐用性(见表10、图7、8、9)实验 均符合方法学要求。适用于小儿化痰止咳颗粒中盐酸麻黄碱、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根 碱的同时定量测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

1.色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验以体积比为1～2∶ 12.5～11∶86～86.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为205nm； 理论板数按吐根碱峰计算应不低于1200；

2.对照品溶液的制备取盐酸麻黄碱、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品适量， 精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成原液，再取原液，加流动相制成每1ml含盐酸麻 黄碱50μg、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱分别为4μg的溶液，即得；

3.供试品溶液的制备取本品适量，研细，称取1/2个包装量，精密称定，置 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，以功率250W，频率40kHz超声处 理15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液 15ml，置水浴上蒸干，用60％甲醇3ml，少量多次定量转移至装有100-120目中性氧化铝 1.5g的内径1cm的中性氧化铝柱上，并洗脱至10ml的量瓶中至约9ml，加1滴磷酸， 用60％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液， 即得；

4.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相 色谱仪，测定三种生物碱的含量。

本发明的原理如下：

利用麻黄碱、吐根酚碱和吐根碱在205nm都呈现最大吸收峰(见图10、11、12)， 以此为检测波长，该三种生物碱的进样量在一定范围内，分别与其峰面积呈现良好的线 性关系，而用于定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)首次采用HPLC法，以普通的等度洗脱、反相色谱柱，体积比为1.5～2.5∶ 12.5～11∶86～86.5的乙腈-甲醇-0.1％磷酸为流动相；205nm为检测波长，同时测定了 小儿化痰止咳颗粒中盐酸麻黄碱、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱的含量。探讨的流动相比 例，使三种生物碱的定量色谱图，在三种不同的色谱柱上，在30分钟出峰完毕，各波峰 分离良好。实现了简便、快捷、科学、规范、多指标控制小儿化痰止咳颗粒质量的愿望。 保证了小儿用药的安全有效。

(2)利用麻黄碱、吐根酚碱和吐根碱在离子体和分子体状态下，都可溶于甲醇的 特性，以甲醇为提取溶剂，不但阻止了大量蔗糖的溶解提取，而且滤过速度快，杂质成 分少，样品经中性氧化铝柱纯化后，色谱柱上呈现的三个主峰，分别是麻黄碱、吐根酚 碱和吐根碱，非测定成分波峰很少，有效提高了测定方法的重现性与色谱柱的耐用性。

(3)目前生物碱的高效液相测定，其流动相多是缓冲盐体系，甚至在缓冲盐中还 要添加十二烷基硫酸钠或三乙胺等，溶质增多，比重增大，压力增高，稍不注意就会损 伤仪器和色谱柱，所以中国药典一部附录VI D高效液相色谱法项下规定“应尽可能少用 含有缓冲盐的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲盐的流动相”。本发明 正是避开了缓冲盐体系，采用普通的酸性流动相，同时测定了麻黄碱、吐根酚碱和吐根 碱三种生物碱，为首次报道。

(4)本制剂中吐根酚碱和吐根碱的定量测定为半微量测定，尽管如此，发明的测 定方法完成一批样品的三成分测定，按平行2份样品计算，前处理时间仅1小时，溶剂 35ml。与目前的生物碱测定相比，节约有机溶剂数百毫升、时间数小时，体现了方法的 新颖性、创新性与实用性。

(5)本发明方法的问世，不但有效控制了小儿化痰止咳颗粒质量，结束了吐根酚 碱和吐根碱一直无高效液相测定方法的历史现状，而且为吐根药材、吐根浸膏、吐根酊 剂等其他复方制剂提供了准确、快速测定的新途径，具表帅与示范作用。

附图说明

图1盐酸麻黄碱线性关系图

图2盐酸吐根酚碱线性关系图

图3盐酸吐根碱线性关系图

图4三种生物碱对照品HPLC色谱图

图5为小儿化痰止咳颗粒HPLC色谱图

图6为小儿化痰止咳颗粒空白样品HPLC色谱图

图7耐用性试验-岛津ODS-SP柱(4.6×150mm)的样品HPLC色谱图

图8耐用性试验-迪马dimonsil柱(4.6×150mm)的样品HPLC色谱图

图9耐用性试验-岛津ODS-VP柱(4.6×150mm)的样品HPLC色谱图

图10盐酸麻黄碱光谱扫描图

图11盐酸吐根酚碱光谱扫描图

图12盐酸吐根碱光谱扫描图

图1、图2、图3中纵坐标为峰面积；横坐标为进样量(μg)

图4～图9中，1为盐酸麻黄碱峰，2为盐酸吐根酚碱峰，3为盐酸吐根碱峰

本发明具体实施方式

实施例1

1.色谱条件与系统适用性试验 以体积比为1.5∶12.5∶86的乙腈-甲醇-0.1％ 磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为205nm；理论板数按吐根碱峰计算应不低于1200；

2.对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品适量， 精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成原液，再取原液，加流动相制成每1ml含盐酸麻 黄碱50μg、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱分别为4μg的溶液，即得；

3.供试品溶液的制备 取本品适量，研细，称取每袋装3g的1/2包装量，即 1.5g样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，以功 率250W，频率40kHz超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇 匀，滤过，精密量取续滤液15ml，置水浴上蒸干，用60％甲醇3ml，少量多次定量转移至 装有100-120目中性氧化铝1.5g的内径1cm的中性氧化铝柱上，并洗脱至10ml的量 瓶中至约9ml，加1滴磷酸，用60％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤 过，取续滤液作为供试品溶液，即得；

4.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪， 测定了3批每袋装3g的样品含量，结果见表11。

实施例2

1.色谱条件与系统适用性试验 以体积比为2∶11.5∶86.5的乙腈-甲醇-0.1％ 磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为205nm；理论板数按吐根碱峰计算应不低于1200；

2.对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品适量， 精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成原液，再取原液，加流动相制成每1ml含盐酸麻 黄碱50μg、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱分别为4μg的溶液，即得；

3.供试品溶液的制备取本品适量，研细，称取每袋装4g的1/2包装量，即2.0 g样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，以功率250W， 频率40kHz超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过， 精密量取续滤液15ml，置水浴上蒸干，用60％甲醇3ml，少量多次定量转移至装有100-120 目中性氧化铝1.5g的内径1cm的中性氧化铝柱上，并洗脱至10ml的量瓶中至约9ml， 加1滴磷酸，用60％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为 供试品溶液，即得；

4.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪， 测定测定了4批每袋装4g的样品含量，结果见表11。

实施例3

1.色谱条件与系统适用性试验 以体积比为1.0∶12.5～11∶86.5的乙腈-甲醇 -0.1％磷酸为流动相；柱温：40℃；检测波长为205nm；理论板数按吐根碱峰计算应不低 于1200；

2.对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱对照品适量， 精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成原液，再取原液，加流动相制成每1ml含盐酸麻 黄碱50μg、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱分别为4μg的溶液，即得；

3.供试品溶液的制备取本品适量，研细，称取每袋装5g的1/2包装量，即2.5g 样品，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，以功率250W， 频率40kHz超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过， 精密量取续滤液15ml，置水浴上蒸干，用60％甲醇3ml，少量多次定量转移至装有100-120 目中性氧化铝1.5g的内径1cm的中性氧化铝柱上，并洗脱至10ml的量瓶中至约9ml， 加1滴磷酸，用60％的甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为 供试品溶液，即得；

4.测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪， 测定测定了4批每袋装5g的样品含量，结果见表11。

表1盐酸麻黄碱进样量与峰面积

表2盐酸吐根酚碱进样量与峰面积

表3盐酸吐根碱进样量与峰面积

表4样品中盐酸麻黄碱的回收率试验结果

表5样品中盐酸吐根酚碱的回收率试验结果

表6样品中盐酸吐根碱的回收率试验结果

表7精密度实验结果(峰面积)

表8稳定性实验结果(峰面积)

表9重复性试验结果(mg/g)

表10不同色谱柱测定的同一样品含量(mg/g)

表11样品中盐酸麻黄碱、盐酸吐根酚碱和盐酸吐根碱含量测定结果