一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法

摘要

本发明公开了一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法，其依次包括有如下步骤：(1)预制待测样品，(2)待测样品处理，(3)检测测定和(4)计算。有益效果：本发明方法所检测的结果准确；同时本发明公开的方法不使用化学药品，无污染，环保又健康，且操作简便、耗时短、成本低，适合工业化大批量样品检测。

说明书

技术领域：

本发明专利涉及一种海藻糖含量的检测方法，具体涉及一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法。

背景技术：

海藻糖是两分子葡萄糖以α，α-1，1糖苷键连接的非还原性糖，是一种典型应激代谢物，能稳定生物膜、蛋白质等生物大分子，能以极低乃至停止新陈代谢的形式保护干燥脱水后的生物体，且不损害生命物质。海藻糖在食品、保健品、医药、精细化工、化妆品及农业科学等行业有广泛的应用。氨基酸是食物蛋白质的重要组成，在能量供应、氧化应激、营养代谢、信号通路调节及免疫响应等过程中发挥重要作用，被广泛应用于食品、医药、化妆品、饲料等行业。在氨基酸的发酵过程中，发酵液中会有副产物海藻糖产生，及时、准确的检测发酵液中海藻糖的含量，可以帮助分析判断菌体不同代谢途径通量的变化特点，对工艺优化、调整有重要意义。

目前海藻糖的检测方法有很多种，比如薄层色谱法、层析法、高效液相色谱法、气相色谱法、蒽酮比色法等。专利CN201811157755.7中公布了一种测定生物基质中海藻糖浓度的检测方法，采用液相色谱质谱法结合柱后泵入辅助试剂实现浓度测定，此方法成本高，不适用于工业化大批量样品监测；专利CN201010139042.5中公布了一种卤虫卵中海藻糖含量的检测方法，采用层析法测定，但是方法操作繁琐，且极易污染环境；专利CN201110063907.9中公布了一种活性污泥海藻糖含量的测定方法中，采用蒽酮比色法测定，此法受样液的颜色影响，准确度低；专利CN201610335587.0中公布了一种快速定量单个微孢子虫孢子海藻糖浓度的方法，采用单细胞拉曼光谱技术和激光镊子相结合定量分析单个微孢子虫孢子的海藻糖浓度，此法成本高。以上所公开的海藻糖检测方法均存在着各种问题，不适合用来在工业化水平下，实现大批量氨基酸发酵液中海藻糖含量及时、准确的检测。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种检测结果准确，无污染，操作简便的一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法。

本发明的目的由如下技术方案实施：一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法，其依次包括有如下步骤：(1)预制待测样品，(2)待测样品处理，(3)检测测定和(4)计算；

其中：

步骤(1)预制待测样品：将氨基酸发酵液置于转速为4000-10000r/min的离心机中，离心5-10min，得到上清液；

步骤(2)待测样品处理：取步骤(1)中的所述上清液1.5-2.0mL作为待测样品1；取与所述待测样品1等量的步骤(1)中的所述上清液，接着加入5-10μL酶活力值为30-50U/mL的海藻糖酶液混匀，然后在温度为35-40℃的水浴锅中水浴20-30min，每间隔10-15min摇匀一次，每次摇匀时间为20-30秒，最后自然冷却得到待测样品2；将所述上清液替换成等量的蒸馏水，其余步骤与制备所述待测样品2的步骤相同，得到待测样品3；

步骤(3)检测测定：分别检测出步骤(2)中的所述待测样品1的葡萄糖浓度值C1，所述待测样品2的葡萄糖浓度值C2和所述待测样品3的葡萄糖浓度值C3；

步骤(4)计算：基于将步骤(3)中得到的C1、C2和C3数据，计算氨基酸发酵液中海藻糖的含量，记为C，计算公式如下C＝(C2-C1-C3)×a中，其中a为葡萄糖及海藻糖分子量间的换算系数，a＝0.95。

进一步的，在步骤(2)和步骤(3)之间，还包括以下步骤：将步骤(2)中的所述待测样品1、所述待测样品2和所述待测样品3分别采用SBA-40C生物传感仪测定其葡萄糖浓度；为了保证SBA-40C生物传感仪所检测的结果的精准度，需要对所述待测样品1、所述待测样品2和所述待测样品3进行稀释，以保证所测得的葡萄糖浓度值控制在1.0g/L以内；因此得到所述待测样品1的稀释倍数n

进一步的，步骤(4)中的所述换算系数的计算方法为：海藻糖在海藻糖酶的作用下水解成葡萄糖，其化学反应式为：C

本发明的优点：本发明提供了一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法，依据海藻糖酶的专一性、特异性，能将1分子海藻糖水解成为2分子的葡萄糖，再通过测定葡萄糖的含量，利用物质守恒定律，得出葡萄糖及海藻糖分子量间的换算系数0.95，即可通过公式算出海藻糖含量，由于氨基酸发酵液中含有杂质、色素，利用酶法测定可以避开杂质、色素因素干扰，使所检测的结果准确；同时本发明公开的方法不使用化学药品，无污染，环保又健康，且操作简便、耗时短、成本低，适合工业化大批量样品检测。

具体实施方式：

下面将通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法，其依次包括有如下步骤：(1)预制待测样品，(2)待测样品处理，(3)检测测定和(4)计算；

其中：

步骤(1)预制待测样品：将氨基酸发酵液置于转速为10000r/min的离心机中，离心5min，得到上清液；

步骤(2)待测样品处理：取步骤(1)中的所述上清液1.5mL作为待测样品1；取与所述待测样品1等量的步骤(1)中的所述上清液，接着加入5μL酶活力值为50U/mL的海藻糖酶液混匀，然后在温度为40℃的水浴锅中水浴30min，每间隔10min摇匀一次，每次摇匀时间为30秒，最后自然冷却得到待测样品2；将所述上清液替换成等量的蒸馏水，其余步骤与制备所述待测样品2的步骤相同，得到待测样品3；

步骤(3)检测测定：将步骤(2)中的所述待测样品1、所述待测样品2和所述待测样品3分别采用SBA-40C生物传感仪测定其葡萄糖浓度；为了保证SBA-40C生物传感仪所检测的结果的精准度，需要对所述待测样品1、所述待测样品2和所述待测样品3进行稀释，以保证所测得的葡萄糖浓度值控制在1.0g/L以内；因此得到所述待测样品1的稀释倍数n

步骤(4)计算：基于将步骤(3)中得到的C1、C2和C3数据，计算氨基酸发酵液中海藻糖的含量，记为C，计算公式如下C＝(C2-C1-C3)×a中，其中a为葡萄糖及海藻糖分子量间的换算系数，a＝0.95；所述换算系数的计算方法为：海藻糖在海藻糖酶的作用下水解成葡萄糖，其化学反应式为：C

本发明所述方法依据海藻糖酶的专一性、特异性，能将1分子海藻糖水解成为2分子的葡萄糖，再通过测定葡萄糖的含量，利用物质守恒定律，得出葡萄糖及海藻糖分子量间的换算系数0.95，即可通过公式算出海藻糖含量；由于氨基酸发酵液中含有杂质、色素，利用酶法测定可以避开杂质、色素因素干扰，使所检测的结果准确；同时本发明公开的方法不使用化学药品，无污染，环保又健康，且操作简便、耗时短、成本低，适合工业化大批量样品检测。

实施例2：一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法，其依次包括有如下步骤：(1)预制待测样品，(2)待测样品处理，(3)检测测定和(4)计算；

其中：

步骤(1)预制待测样品：将氨基酸发酵液置于转速为4000r/min的离心机中，离心10min，得到上清液；

步骤(2)待测样品处理：取步骤(1)中的所述上清液2.0mL作为待测样品1；取与所述待测样品1等量的步骤(1)中的所述上清液，接着加入10μL酶活力值为30U/mL的海藻糖酶液混匀，然后在温度为35℃的水浴锅中水浴20min，每间隔15min摇匀一次，每次摇匀时间为20秒，最后自然冷却得到待测样品2；将所述上清液替换成等量的蒸馏水，其余步骤与制备所述待测样品2的步骤相同，得到待测样品3；

步骤(3)检测测定：将步骤(2)中的所述待测样品1、所述待测样品2和所述待测样品3分别采用SBA-40C生物传感仪测定其葡萄糖浓度；为了保证SBA-40C生物传感仪所检测的结果的精准度，需要对所述待测样品1、所述待测样品2和所述待测样品3进行稀释，以保证所测得的葡萄糖浓度值控制在1.0g/L以内；因此得到所述待测样品1的稀释倍数n

步骤(4)计算：基于将步骤(3)中得到的C1、C2和C3数据，计算氨基酸发酵液中海藻糖的含量，记为C，计算公式如下C＝(C2-C1-C3)×a中，其中a为葡萄糖及海藻糖分子量间的换算系数，a＝0.95；所述换算系数的计算方法为：海藻糖在海藻糖酶的作用下水解成葡萄糖，其化学反应式为：C

本发明所述方法依据海藻糖酶的专一性、特异性，能将1分子海藻糖水解成为2分子的葡萄糖，再通过测定葡萄糖的含量，利用物质守恒定律，得出葡萄糖及海藻糖分子量间的换算系数0.95，即可通过公式算出海藻糖含量；由于氨基酸发酵液中含有杂质、色素，利用酶法测定可以避开杂质、色素因素干扰，使所检测的结果准确；同时本发明公开的方法不使用化学药品，无污染，环保又健康，且操作简便、耗时短、成本低，适合工业化大批量样品检测。

实施例3：一种氨基酸发酵液中海藻糖含量的检测方法，其依次包括有如下步骤：(1)预制待测样品，(2)待测样品处理，(3)检测测定和(4)计算；

其中：

步骤(1)预制待测样品：将氨基酸发酵液置于转速为7000r/min的离心机中，离心7min，得到上清液；

步骤(2)待测样品处理：取步骤(1)中的所述上清液1.7mL作为待测样品1；取与所述待测样品1等量的步骤(1)中的所述上清液，接着加入7μL酶活力值为40U/mL的海藻糖酶液混匀，然后在温度为37℃的水浴锅中水浴25min，每间隔13min摇匀一次，每次摇匀时间为25秒，最后自然冷却得到待测样品2；将所述上清液替换成等量的蒸馏水，其余步骤与制备所述待测样品2的步骤相同，得到待测样品3；

步骤(3)检测测定：将步骤(2)中的所述待测样品1、所述待测样品2和所述待测样品3分别采用SBA-40C生物传感仪测定其葡萄糖浓度；为了保证SBA-40C生物传感仪所检测的结果的精准度，需要对所述待测样品1、所述待测样品2和所述待测样品3进行稀释，以保证所测得的葡萄糖浓度值控制在1.0g/L以内；因此得到所述待测样品1的稀释倍数n

步骤(4)计算：基于将步骤(3)中得到的C1、C2和C3数据，计算氨基酸发酵液中海藻糖的含量，记为C，计算公式如下C＝(C2-C1-C3)×a中，其中a为葡萄糖及海藻糖分子量间的换算系数，a＝0.95；所述换算系数的计算方法为：海藻糖在海藻糖酶的作用下水解成葡萄糖，其化学反应式为：C

本发明所述方法依据海藻糖酶的专一性、特异性，能将1分子海藻糖水解成为2分子的葡萄糖，再通过测定葡萄糖的含量，利用物质守恒定律，得出葡萄糖及海藻糖分子量间的换算系数0.95，即可通过公式算出海藻糖含量；由于氨基酸发酵液中含有杂质、色素，利用酶法测定可以避开杂质、色素因素干扰，使所检测的结果准确；同时本发明公开的方法不使用化学药品，无污染，环保又健康，且操作简便、耗时短、成本低，适合工业化大批量样品检测。

实验1：

对比例1：采用传统的高效液相色谱法来测定谷氨酸发酵液中海藻糖含量；色谱柱为Bio-Rad-AminexHPX-87H，以0.5％冰乙酸为流动相，示差折光检测器，流速0.55mL/min，柱温60℃，采用此色谱条件对海藻糖进行分离测定；先通过测定0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0g/L不同浓度的海藻糖标准溶液，制作出标准曲线；然后将谷氨酸发酵液试样进行稀释，使其海藻糖浓度稀释到1.0g/L以内，然后在通过上述色谱条件对试样的海藻糖进行分离测定，得出试样的峰面积，最后将试样的峰面积带入标准曲线中计算出谷氨酸发酵液试样中的海藻糖含量，重复操作上述检测方法3次，得到3个海藻糖含量值。

对比例2：将对比例1中的谷氨酸发酵液采用本发明实施例1的方法进行海藻糖含量测定，重复上述检测方法3次，得到3个海藻糖含量值。

将对比例2第1次所测的海藻糖含量值与对比例1第1次所测的海藻糖含量值做差值，将对比例2第2次所测的海藻糖含量值与对比例1第2次所测的海藻糖含量值做差值；将对比例2第3次所测的海藻糖含量值与对比例1第3次所测的海藻糖含量值做差值。

具体检测结果见下表1：

表1谷氨酸发酵液中海藻糖含量对比表，单位：g/L

实验2：

对比例1：将实验1中的对比例1中的谷氨酸发酵液换成脯氨酸发酵液，然后测定脯氨酸发酵液中海藻糖含量，重复上述检测方法3次，得到3个海藻糖含量值。

对比例2：将实验1中的对比例2中的谷氨酸发酵液换成脯氨酸发酵液，然后测定脯氨酸发酵液中海藻糖含量，重复上述检测方法3次，得到3个海藻糖含量值。

将对比例2第1次所测的海藻糖含量值与对比例1第1次所测的海藻糖含量值做差值，将对比例2第2次所测的海藻糖含量值与对比例1第2次所测的海藻糖含量值做差值；将对比例2第3次所测的海藻糖含量值与对比例1第3次所测的海藻糖含量值做差值。

具体检测结果见下表2：

表2脯氨酸中海藻糖含量对比表，单位：g/L

实验3：

对比例1：将实验1中的对比例1中的谷氨酸发酵液换成苏氨酸发酵液，然后测定苏氨酸发酵液中海藻糖含量，重复上述检测方法3次，得到3个海藻糖含量值。

对比例2：将实验1中的对比例2中的谷氨酸发酵液换成苏氨酸发酵液，然后测定苏氨酸发酵液中海藻糖含量，重复上述检测方法3次，得到3个海藻糖含量值。

将对比例2第1次所测的海藻糖含量值与对比例1第1次所测的海藻糖含量值做差值，将对比例2第2次所测的海藻糖含量值与对比例1第2次所测的海藻糖含量值做差值；将对比例2第3次所测的海藻糖含量值与对比例1第3次所测的海藻糖含量值做差值。

具体检测结果见下表3：

表3苏氨酸中海藻糖含量对比表，单位：g/L

结合上述实验1-3所得的结果，如表1-3可知，本发明实施例1检测方法所检测得到的检测结果与传统的高效液相色谱法所检测得到的检测结果相比较，误差不超0.03g/L，因此本发明实施例1检测方法所检测的结果准确度高；同时可以看出本发明实施例1检测方法可适用于各种氨基酸发酵液，能准确的测定出发酵液副产物海藻糖的含量。

传统的高效液相色谱法所使用到的液相色谱仪器市场价格约为80-120万，同时采用传统的高效液相色谱法检测样品的海藻糖含量，平均每检测一个样品就需要消耗色谱柱、化学药品等耗材约80-100元；本发明检测方法所使用到的生物传感仪的市场价格约为20万，同时采用本发明检测方法检测样品的海藻糖含量，平均每检测一个样品需要消耗海藻糖酶液、试管等耗材约10-20元；因此传统的高效液相色谱法所使用到的检测材料成本高，耗材量大，不适于于工业化大批量样品监测；而本发明检测方法操作简便、不使用化学试剂，无污染，环保健康、成本低，适合工业化大批量样品检测。

以上是本发明的优选实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。