细胞因子IL-27作为NEC与FPIES鉴别诊断标志物及应用

摘要

本发明涉及细胞因子IL‑27作为新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)与食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征(FPIES)鉴别诊断标志物及应用，属于医药技术领域。本发明主要针对NEC与FPIES鉴别诊断困难这一问题，提供一种新的鉴别诊断标志物。IL‑27在NEC和FPIES患儿血浆中的表达水平较正常对照组升高，且IL‑27在NEC患儿血浆中的表达水平高于FPIES患儿，根据血浆中IL‑27的水平，可很好地鉴别NEC与FPIES，灵敏度为84.93，特异性为81.63，ROC曲线下面积为0.877。血浆IL‑27作为NEC与FPIES的鉴别诊断标志物具有较好的诊断效能，可为儿科医生提供参考，有利于临床决策。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及细胞因子IL-27作为新生儿坏死性小肠结肠炎与食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征鉴别诊断的生物标记物及应用。

背景技术

新生儿坏死性小肠结肠炎(Necrotizing enterocolitis，NEC)是一种严重的胃肠道炎症性疾病，主要影响早产儿。在≤33孕周或出生体重≤2500克的婴儿中，NEC发病率高达13％。此外，NEC的平均死亡率为20％～30％，在需要手术治疗的婴儿中高达50％。而幸存的NEC患儿易并发短肠综合症、胆汁淤积、生长显著受损以及神经发育不良等疾病。这些婴儿需要长期护理，治疗复杂且花费高昂。目前NEC的诊断依据主要是临床表现和影像学检查，而实验室检查指标仅有粪便隐血阳性、酸中毒、中性粒细胞及血小板减少，缺乏特异性。

食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征(Food Protein–Induced Enterocolitis，FPIES)是一种非免疫球蛋白E(IgE)介导的胃肠道食物超敏反应。牛乳和大豆蛋白是两种最常见的食物诱因。目前的诊断主要依靠病史、临床表现、口服食物激发试验和禁食后症状缓解情况。 FPIES和NEC有许多相似的临床症状，如呕吐、腹胀、腹泻、便血、进食困难、嗜睡、呼吸暂停，甚至休克，腹部平片均表现为肠扩张、肠气肿和门静脉积气，因此二者的鉴别诊断较难。但FPIES和NEC的治疗方法却截然不同：NEC需要禁食和使用抗生素，而FPIES则需要改变食物种类。NEC不能及时发现尽早治疗，如前所述危害很大；FPIES如不能及时发现，会导致疾病反复发作，使肠道结构发生进行性改变，甚至需要手术治疗，如误诊为 NEC采取禁食和使用抗生素则会加剧过敏状态，给婴儿带来不必要的伤害。目前尚未有文献报道利用生物标志物对二者进行鉴别诊断。本发明为NEC与FPIES的鉴别诊断提供了一种新的标志物。

发明内容

1.本发明要解决的技术问题是为NEC与FPIES的鉴别诊断提供一种新的鉴别诊断标志物。

2.本发明的技术方案是细胞因子IL-27，IL-27属于IL-12细胞因子家族，是由IL-27p28亚基和Ebi3亚基组成的异源性二聚体细胞因子,其特征在于：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.本发明提供了IL-27在NEC与FPIES的鉴别诊断中的用途。

4.本发明提供了IL-27作为NEC与FPIES鉴别诊断的生物标志物。作为一个优选项，IL-27 在NEC和FPIES患儿血浆中的表达水平较健康对照组高；且IL-27在NEC患儿血浆中的表达量高于FPIES患儿。

5.本发明提供了IL-27与NEC与严重程度正相关。作为一个优选项，IL-27的表达水平 NEC I期

6.本发明的优点在于：

(1)目前尚无研究报道IL-27在NEC及FPIES中的表达情况；另外，临床上常常难以鉴别 NEC和FPIES，本发明首次提出IL-27这一实验室指标可作为NEC与FPIES的鉴别诊断指标，且IL-27与NEC严重程度密切相关。

(2)在鉴别NEC与FPIES方面，Il-27具有较好的特异性和敏感性，与其他实验室诊断指标的比较，IL-27具有更好的诊断效能。

附图说明

图1为本发明纳入的研究对象的人口学和临床特征，包括胎龄、出生体重、性别、发病日龄、分娩方式、Apgar评分及辅助通气的情况。

图2为IL-27在NEC组、FPIES组及对照组中的表达情况。其中：

图2A在黄疸婴儿血浆中，IL-27表达水平随日龄波动的情况

图2B在不同性别黄疸婴儿中，IL-27的血浆表达水平

图2C、图2D分别为IL-27与黄疸新生儿胎龄及出生体重的相关性分析

图2E 为IL-27在NEC组，FPIES组和黄疸婴儿血浆中的表达水平

图3为IL-27对NEC和FPIES鉴别诊断的ROC曲线分析

图4为IL-27、IL-6、E、PLT、WBC、N、L、N/L及CRP对NEC的诊断效应对比分析，且主要从以下几个方面进行比较：AUC、Se、Sp、YJ、PPV、NPV、+LR、-LR及Cut-off 值

图5为IL-27与其他实验室诊断指标(IL-6、CRP、PCT、PLT、WBC及X线评分)的相关性分析

图6为IL-27对NEC严重程度的判断能力。其中：

图6A IL-27在黄疸婴儿及NEC不同分期患者血浆中的表达水平

图6B IL-27在黄疸婴儿，NEC手术及非手术患者血浆中的表达水平

图6C、图6D及图6E分别为IL-27在黄疸婴儿及NEC严重并发症患者(败血症、感染性休克及全腹膜炎)血浆中的表达水平

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明的技术方案是IL-27，其特征在于：(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2) 如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，IL-27p28和EBI3为IL-27的两个亚基，斜体所示为非编码区，非斜体区域所示为编码区。

SEQ ID NO.1：

IL-27p28亚基核苷酸序列如下：

EBI3亚基核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.2：

IL-27p28亚基氨基酸序列如下：

MGQTAGDLGWRLSLLLLPLLLVQAGVWGFPRPPGRPQLSLQELRREFTVSLHLARKLLSE VRGQAHRFAESHLPGVNLYLLPLGEQLPDVSLTFQAWRRLSDPERLCFISTTLQPFHALLGG LGTQGRWTNMERMQLWAMRLDLRDLQRHLRFQVLAAGFNLPEEEEEEEEEEEEERKGLL PGALGSALQGPAQVSWPQLLSTYRLLHSLELVLSRAVRELLLLSKAGHSVWPLGFPTLSPQ P

EBI3亚基氨基酸序列如下：

MTPQLLLALVLWASCPPCSGRKGPPAALTLPRVQCRASRYPIAVDCSWTLPPAPNSTSPVSF IATYRLGMAARGHSWPCLQQTPTSTSCTITDVQLFSMAPYVLNVTAVHPWGSSSSFVPFITE HIIKPDPPEGVRLSPLAERQLQVQWEPPGSWPFPEIFSLKYWIRYKRQGAARFHRVGPIEATS FILRAVRPRARYYVQVAAQDLTDYGELSDWSLPATATMSLGK

实施例1

1.研究对象

本发明的研究对象均来自重庆医科大学附属儿童医院(2019年6月至2020年12月)。在这项研究中，我们招募了214名疑似NEC的患者和54名生理性黄疸婴儿作为健康对照。在收集入组患者之前，我们根据改良的Bell分期，制定了严格的入组标准，出现下述疑似 NEC的临床症状一项或以上者：嗜睡，呕吐，胃潴留，腹胀，便血；排除标准，(1)不愿加入本研究的患者(2)具有重大先天性畸形患者(3)遗传病患者(4)信息缺失者(5)其他非NEC及非FPIES的肠道疾病患者。疑似NEC的患者随后分为NEC组(n＝78)、FPIES 组(n＝51)，其他肠道疾病组(n＝85)和健康对照组(n＝54)。根据改良的贝尔分期标准对NEC进行诊断，并最终由两名新生儿科专家确认患儿患病情况。

2.资料收集

患者入院后立即收集患者一般情况，包括患者病历号、姓名、性别、胎龄、出生体重等；收集患者既往疾病史，包括喂养史，既往有无便血、呕吐、呼吸困难、感染等病史；收集患儿母亲分娩史，包括有无过敏性疾病、高血压、糖尿病、分娩方式等。并收集包括血常规、血培养、粪便常规、肝肾功能、X线检查及超声检查等临床检验指标。

3.样本收集

(1)NEC组和FPIES组标本收集：从出现症状开始，收集患儿住院期间血浆标本(3000rpm，3min，肝素抗凝血)，以每管120μl分装到200μl EP管中，于-80℃存放。

(2)健康对照组标本收集：早产和足月的生理性黄疸患儿：从入院第一天开始收集患儿血浆标本，同疾病组标本一样处理。

(3)收集标本时，均获得患儿父母的书面知情同意。

4.实验方法

(1)ELISA：检测患儿血浆标本中IL-27的含量，根据产品说明说进行操作(RD公司，批号 DY2526-05)。

(2)两独立样本的比较：Mann-Whitney U检验，采用的统计软件为SPSS 20.0。

(3)两个以上独立样本的比较：2×3χ

(4)相关性分析：斯皮尔曼相关性分析IL-27与IL-6、CRP、N/L、WBC、E及PLT等指标的相关性，采用的统计软件为SPSS 20.0。

(5)ROC曲线：根据患儿的临床信息，由两名儿科专家判断疾病类型1)NEC组2)FPIES 组3)其他肠道疾病组4)健康对照组。采用MedCalc Statistical Software version15.2.2 (MedCalc Software bvba,Ostend,Belgium；http://www.medcalc.org；2015)对NEC组和FPIES组进行ROC曲线分析，并比较IL-27、IL-6、CRP、N/L、WBC、E及PLT对NEC和FPIES鉴别诊断的能力。

5.实验结果

(1)研究对象的人口学信息和临床特征，见图1。

(2)IL-27在NEC组、FPIES组和健康对照组婴儿血浆中的表达情况，见图2。

结果表明，IL-27在黄疸婴儿血浆中的表达比较稳定，其表达水平不会随婴儿日龄变化，且与性别、胎龄、出生体重无相关性。我们还发现IL-27在NEC和FPIES患儿血浆中的表达水平较黄疸对照组显著升高，且NEC患儿IL-27的表达水平高于FPIES。

(3)IL-27及其他实验室指标鉴别诊断NEC及FPIES的能力分析，见图3和图4。结果显示，IL-27与其他实验室指标相比有较高的AUC、YJ、Se、Sp、NPV及PPV等，具有较好的诊断效应，其中E也有较高的AUC，出现这种情况可能是由于判断FPIES这一疾病时，较多地参考了E这一指标，遗漏了部分E不升高的病例。

(4)IL-27与其他实验室诊断指标的相关性，见图5。

结果显示，IL-27与CRP、PCT和X线评分具有正相关关系，而与PLT和WBC具有负相关关系，差异具有统计学意义。

(5)IL-27对NEC严重程度的判断能力分析，见图6。

结果显示IL-27在NEC不同分期中差异表达，并随着疾病的加重表达升高。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 细胞因子IL-27作为NEC与FPIES鉴别诊断标志物及应用

<141> 2020-12-03

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 2202

<212> DNA/RNA

<213> 白介素27(Homo sapiens)

<400> 2

gaccaaagag gctgggcccc gccatgggcc agacggcagg cgaccttggc tggcggctca 60

gcctgttgct gcttcccttg ctcctggttc aagctggtgt ctggggattc ccaaggcccc 120

cagggaggcc ccagctgagc ctgcaggagc tgcggaggga gttcacagtc agcctgcatc 180

tcgccaggaa gctgctctcc gaggttcggg gccaggccca ccgctttgcg gaatctcacc 240

tgccaggagt gaacctgtac ctcctgcccc tgggagagca gctccctgat gtttccctga 300

ccttccaggc ctggcgccgc ctctctgacc cggagcgtct ctgcttcatc tccaccacgc 360

ttcagccctt ccatgccctg ctgggagggc tggggaccca gggccgctgg accaacatgg 420

agaggatgca gctgtgggcc atgaggctgg acctccgcga tctgcagcgg cacctccgct 480

tccaggtgct ggctgcagga ttcaacctcc cggaggagga ggaggaggaa gaggaggagg 540

aggaggagga gaggaagggg ctgctcccag gggcactggg cagcgcctta cagggcccgg 600

cccaggtgtc ctggccccag ctcctctcca cctaccgcct gctgcactcc ttggagctcg 660

tcttatctcg ggccgtgcgg gagttgctgc tgctgtccaa ggctgggcac tcagtctggc 720

ccttggggtt cccaacattg agcccccagc cctgatcggt ggcttcttag ccccctgccc 780

cccacccttt agaactttag gactggagtc ttggcatcag ggcagccttc gcatcatcag 840

ccttggacaa gggagggctc ttccagcccc ctgccccagg ctctacccag taactgaaag 900

cccctctggt cctcgccagc tatttatttc ttggatattt atttattgtt tagggagatg 960

atggtttatt tattgtcttg gggcccgatg gtcctcctcg ggccaagccc ccatgctggg 1020

tgcccaataa agcactctca tccaactcct gagagcagag ctggccgcag ccatgacccc 1080

gcagcttctc ctggcccttg tcctctgggc cagctgcccg ccctgcagtg gaaggaaagg 1140

gcccccagca gctctgacac tgccccgggt gcaatgccga gcctctcggt acccgatcgc 1200

cgtggattgc tcctggaccc tgccgcctgc tccaaactcc accagccccg tgtccttcat 1260

tgccacgtac aggctcggca tggctgcccg gggccacagc tggccctgcc tgcagcagac 1320

gccaacgtcc accagctgca ccatcacgga tgtccagctg ttctccatgg ctccctacgt 1380

gctcaatgtc accgccgtcc acccctgggg ctccagcagc agcttcgtgc ctttcataac 1440

agagcacatc atcaagcccg accctccaga aggcgtgcgc ctaagccccc tcgctgagcg 1500

ccagctacag gtgcagtggg agcctcccgg gtcctggccc ttcccagaga tcttctcact 1560

gaagtactgg atccgttaca agcgtcaggg agctgcgcgc ttccaccggg tggggcccat 1620

tgaagccacg tccttcatcc tcagggctgt gcggccccga gccaggtact acgtccaagt 1680

ggcggctcag gacctcacag actacgggga actgagtgac tggagtctcc ccgccactgc 1740

cacaatgagc ctgggcaagt agcaagggct tcccgctgcc tccagacagc acctgggtcc 1800

tcgccaccct aagccccggg acacctgttg gagggcggat gggatctgcc tagcctgggc 1860

tggagtcctt gctttgctgc tgctgagctg ccgggcaacc tcagatgacc gacttttccc 1920

tttgagcctc agtttctcta gctgagaaat ggagatgtac tactctctcc tttaccttta 1980

cctttaccac agtgcagggc tgactgaact gtcactgtga gatatttttt attgtttaat 2040

tagaaaagaa ttgttgttgg gctgggcgca gtggatcgca cctgtaatcc cagtcactgg 2100

gaagccgacg tgggagggta gcttgaggcc aggagctcga aaccagtccg ggccacacag 2160

caagacccca tctctaaaaa attaatataa atataaaata aa 2202

<210> 2

<211> 472

<212> PRT

<213> 白介素27(Homo sapiens)

<400> 2

Met Gly Gln Thr Ala Gly Asp Leu Gly Trp Arg Leu Ser Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Pro Leu Leu Leu Val Gln Ala Gly Val Trp Gly Phe Pro Arg Pro

20 25 30

Pro Gly Arg Pro Gln Leu Ser Leu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Phe Thr

35 40 45

Val Ser Leu His Leu Ala Arg Lys Leu Leu Ser Glu Val Arg Gly Gln

50 55 60

Ala His Arg Phe Ala Glu Ser His Leu Pro Gly Val Asn Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Leu Pro Leu Gly Glu Gln Leu Pro Asp Val Ser Leu Thr Phe Gln Ala

85 90 95

Trp Arg Arg Leu Ser Asp Pro Glu Arg Leu Cys Phe Ile Ser Thr Thr

100 105 110

Leu Gln Pro Phe His Ala Leu Leu Gly Gly Leu Gly Thr Gln Gly Arg

115 120 125

Trp Thr Asn Met Glu Arg Met Gln Leu Trp Ala Met Arg Leu Asp Leu

130 135 140

Arg Asp Leu Gln Arg His Leu Arg Phe Gln Val Leu Ala Ala Gly Phe

145 150 155 160

Asn Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

165 170 175

Arg Lys Gly Leu Leu Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Leu Gln Gly Pro

180 185 190

Ala Gln Val Ser Trp Pro Gln Leu Leu Ser Thr Tyr Arg Leu Leu His

195 200 205

Ser Leu Glu Leu Val Leu Ser Arg Ala Val Arg Glu Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Ser Lys Ala Gly His Ser Val Trp Pro Leu Gly Phe Pro Thr Leu Ser

225 230 235 240

Pro Gln Pro Met Thr Pro Gln Leu Leu Leu Ala Leu Val Leu Trp Ala

245 250 255

Ser Cys Pro Pro Cys Ser Gly Arg Lys Gly Pro Pro Ala Ala Leu Thr

260 265 270

Leu Pro Arg Val Gln Cys Arg Ala Ser Arg Tyr Pro Ile Ala Val Asp

275 280 285

Cys Ser Trp Thr Leu Pro Pro Ala Pro Asn Ser Thr Ser Pro Val Ser

290 295 300

Phe Ile Ala Thr Tyr Arg Leu Gly Met Ala Ala Arg Gly His Ser Trp

305 310 315 320

Pro Cys Leu Gln Gln Thr Pro Thr Ser Thr Ser Cys Thr Ile Thr Asp

325 330 335

Val Gln Leu Phe Ser Met Ala Pro Tyr Val Leu Asn Val Thr Ala Val

340 345 350

His Pro Trp Gly Ser Ser Ser Ser Phe Val Pro Phe Ile Thr Glu His

355 360 365

Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro Leu Ala

370 375 380

Glu Arg Gln Leu Gln Val Gln Trp Glu Pro Pro Gly Ser Trp Pro Phe

385 390 395 400

Pro Glu Ile Phe Ser Leu Lys Tyr Trp Ile Arg Tyr Lys Arg Gln Gly

405 410 415

Ala Ala Arg Phe His Arg Val Gly Pro Ile Glu Ala Thr Ser Phe Ile

420 425 430

Leu Arg Ala Val Arg Pro Arg Ala Arg Tyr Tyr Val Gln Val Ala Ala

435 440 445

Gln Asp Leu Thr Asp Tyr Gly Glu Leu Ser Asp Trp Ser Leu Pro Ala

450 455 460

Thr Ala Thr Met Ser Leu Gly Lys

465 470