一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，解决了现有技术中尚无较好的体外诱导以及大量表达恙虫病东方体相关蛋白的方法和相适应的条件的问题，所述用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，包括引物合成、目的基因的获取与扩增、重组表达质粒的构建、恙虫病东方体相关蛋白的诱导表达、Western blot试验、重组蛋白表达形式分析、重组蛋白纯化等步骤。本发明设计了一种恙虫病东方体TSA蛋白获取的方法，通过探索调整蛋白诱导表达条件及蛋白纯化方法，成功体外诱导表达恙虫病东方体相关TSA蛋白，同时提高体外蛋白的纯度。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法。

背景技术

恙虫病是一种自然疫源性疾病，又称丛林性斑疹伤寒，由专性细胞内细菌恙虫病东方体引起的一种容易被忽略的潜在的致命感染性疾病，恙虫病每年发生100万余例，已有研究发现，恙虫病如果没有接受及时的治疗，病死率的发生很可能大于登革热而达到10%的病死率，尤其在患者还未接受抗生素治疗的时候，该病的死亡率甚至可以高达40%-45%。

恙虫病东方体寄生于恙螨，人被恙螨叮咬后，在人体血管内皮细胞生长、繁殖，其潜伏期一般为7-21天，临床表现主要有寒战、发热等非特异性症状，重症感染表现为感染性休克、弥散性血管内凝血甚至死亡。而恙虫病由于起病初期的非特异性症状很难与其他发热性疾病如发热伴血小板减少综合征、流行性出血热等疾病鉴别，所以，目前对于恙虫病相关致病机制的研究报道几乎依旧处于空白领域。虽然随着研究的不断深入，PCR和血清学检测及敏感抗生素的治疗得以发展，但快速准确的高敏感性和特异性的诊断方法及疫苗的研究依旧具有重要的意义。

恙虫病患者的早期诊断和治疗对于改善疾病的预后至关重要，因此建立快速且准确的恙虫病诊断方法至关重要，而恙虫病患者的血清已经被证明可以与几种恙虫病主要抗原反应，包括主要外膜56-kDa（TSA）蛋白，它占立克次体细胞蛋白总含量的10- 15%以及其他次要蛋白，如22-kDa、47-kDa和110-kDa蛋白等，而由于56-kDa型特异性抗原(TSA)位于恙虫病立克次体表面的免疫显性。已有研究发现56kDa（TSA）蛋白是一种免疫显性的抗原，具有群体特异性和菌株特异性的表位，可以与单克隆抗体发生反应，虽然其抗原多样性与不同菌株的分子变异程度有关，但是，大多数恙虫病患者的血清可以识别TSA蛋白，因此TSA蛋白被认为是合适的诊断性抗原和候选疫苗。

现阶段对于恙虫病东方体56kDa蛋白对机体的致病机制的研究人员较多，但是如何稳定于体外获得纯度较高的恙虫病东方体相关蛋白一直是一个难点，目前尚无较好的体外诱导以及大量表达恙虫病东方体相关蛋白的方法和相适应的条件。基于上述陈述，本发明提出了一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中尚无较好的体外诱导以及大量表达恙虫病东方体相关蛋白的方法和相适应的条件的问题，而提出的一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法。

一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，包括以下步骤：

（1）引物合成：参照GenBank及所需要的酶切位点设计恙虫病东方体TSA致病蛋白引物1-30条，共计30条引物，采用overlapPcr方法合成该蛋白序列全长。

（2）目的基因的获取与扩增：合成恙虫病东方体TSA蛋白，PCR扩增TSA蛋白全长序列，依次进行全长PCR一轮、全长PCR二轮反应，反应完成后，将全长PCR二轮产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收TSA目的片段备用；

（3）pET30a-TSA重组表达质粒的构建：PCR扩增的同时，用BamHI-Xhol双酶切处理pET30a质粒，进行胶回收，重组反应体系为：步骤（2）中的TSA回收产物4ul，pET30a＋载体3.5ul，重组酶2.5ul,50℃水浴25min，放置2-3分钟降温，进行菌落筛选实验，挑取单克隆菌落，振荡培养12-14h，保存菌液，提取质粒并送测序，即得重组菌菌液；

（4）恙虫病东方体TSA蛋白的诱导表达：将经过测序保存的重组菌菌液，于37℃，220r/min震荡培养至菌液D600为0.6-0.8时，加入0.4mM的IPTG进行诱导表达，收集菌液超声处理后，获得蛋白样品；

（5）Western blot 试验：使用步骤（4）中的蛋白样品，以12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，将蛋白转移至硝酸纤维素膜5%脱脂乳封闭1h，鼠源His抗体孵育过夜，PBST洗涤4次，每次5min，使用HRP标记的山羊抗小鼠二抗37℃孵育1h，PBST洗涤4次，5min每次，显影；

（6）恙虫病东方体TSA重组蛋白表达形式分析：步骤（3）中保存的重组菌，加入IPTG进行诱导表达，收取菌液，经超声破碎后，4000r/min离心10min，收取上清，用PBS重悬沉淀，分别取上清、细菌包涵体制备样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验；

（7）恙虫病东方体TSA重组蛋白纯化：复苏TSA蛋白相关重组菌，转移到1L培养基中，37℃条件下振荡培养至菌液D600为0.6-0.8,加入0.2mM的IPTG进行诱导表达，4h后收集蛋白，采用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化，制备蛋白样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，分析蛋白纯化效果；

（8）通过上述流程，成功于体外诱导表达纯化获取了大量纯度较高的恙虫病东方体TSA重组蛋白。

优选的，所述步骤（2）中全长PCR一轮反应体系为50ul：在PCR管中依次加入ddH2O38ul,聚合酶（pv2）0.5ul，5 X PV2 buffer 10ul,10mM dNTP 1ul，引物1-30各0.5ul。

优选的，所述步骤（2）中全长PCR一轮反应扩增条件为：95℃预变性 3 min;95℃变性25s，62℃退火20 s，72℃延伸 45 s，25个循环；72℃延伸1 min。

优选的，所述步骤（2）中全长PCR二轮反应体系为50ul：在PCR管中依次加入ddH2O37.2ul,聚合酶（pv2）0.5ul，5 X PV2 buffer 10ul,10mM dNTP 1ul，引物1 0.5ul,引物300.5ul。

优选的，所述步骤（2）中全长PCR二轮扩增条件为：95℃预变性 3 min;95℃变性25s，62℃退火20 s，72℃延伸 45 s，25个循环；72℃延伸1 min。

本发明提出的一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，具有以下有益效果：

1、本发明提出的用于恙虫病东方体相关蛋白诱导表达及大量纯化的方法，能够成功于体外诱导并大量表达恙虫病东方体TSA蛋白，同时能够成功于体外获得纯度较高的恙虫病东方体TSA蛋白；所得TSA蛋白可以用于进一步的多克隆抗体及单克隆抗体的制备，相关蛋白及多克隆抗体及单克隆抗体的后续制备，后期应用于临床疾病的快速检测，同时为疫苗的研发提供靶点。

2、本发明通过原核表达系统成功表达并纯化恙虫病东方体恙虫病东方体TSA重组蛋白，同时为下一步单克隆抗体与多克隆抗体的制备、相关ELISA检测方法等疾病的快速检测方法及基因工程相关疫苗等研究奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例一中的蛋白表达鉴定SDS-PAGE分析图；图中：M表示蛋白质分子质量标准；1表示pET-30a诱导；2表示未诱导；3表示诱导后；4表示诱导破碎后上清；5表示诱导破碎后沉淀。

图2为本发明实施例一中的蛋白纯化SDS-PAGE分析图；图中：M表示蛋白质分子质量标准；1表示破碎后处理样品；2表示流出；3-4表示洗脱。

图3为本发明实施例一中的蛋白Western Blot鉴定分析图；图中：M表示蛋白质分子质量标准；1表示纯化后样品。

图4为本发明实施例一中的蛋白SDS-PAGE鉴定分析图；图中：M表示蛋白质分子质量标准；1表示0.5mg/mL BSA；2表示纯化后样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例一

本发明提出的一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，包括以下步骤：

（1）引物合成：参照GenBank及所需要的酶切位点设计恙虫病东方体TSA致病蛋白引物1-30条，共计30条引物，采用overlapPcr方法合成该蛋白序列全长。

（2）目的基因的获取与扩增：合成恙虫病东方体TSA蛋白，PCR扩增TSA蛋白全长序列，依次进行全长PCR一轮、全长PCR二轮反应，全长PCR一轮反应体系为50ul：在PCR管中依次加入ddH

（3）pET30a-TSA重组表达质粒的构建：PCR扩增的同时，用BamHI-Xhol双酶切处理pET30a质粒，进行胶回收，重组反应体系为：步骤（2）中的TSA回收产物4ul，pET30a＋载体3.5ul，重组酶2.5ul,50℃水浴25min，放置3分钟降温，进行菌落筛选实验，挑取单克隆菌落，振荡培养14h，保存菌液，提取质粒并送测序，即得重组菌菌液；

（4）恙虫病东方体TSA蛋白的诱导表达：将经过测序保存的重组菌菌液，于37℃，220r/min震荡培养至菌液D600为0.8时，加入0.4mM的IPTG进行诱导表达，收集菌液超声处理后，获得蛋白样品；

（5）Western blot 试验：使用步骤（4）中的蛋白样品，以12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，将蛋白转移至硝酸纤维素膜5%脱脂乳封闭1h，鼠源His抗体孵育过夜，PBST洗涤4次，每次5min，使用HRP标记的山羊抗小鼠二抗37℃孵育1h，PBST洗涤4次，5min每次，显影；

（6）恙虫病东方体TSA重组蛋白表达形式分析：步骤（3）中保存的重组菌，加入IPTG进行诱导表达，收取菌液，经超声破碎后，4000r/min离心10min，收取上清，用PBS重悬沉淀，分别取上清、细菌包涵体制备样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验；

（7）恙虫病东方体TSA重组蛋白纯化：复苏TSA蛋白相关重组菌，转移到1L培养基中，37℃条件下振荡培养至菌液D600为0.8,加入0.2mM的IPTG进行诱导表达，4h后收集蛋白，采用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化，制备蛋白样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，分析蛋白纯化效果；

（8）通过上述流程，成功于体外诱导表达纯化获取了大量纯度较高的恙虫病东方体TSA重组蛋白；

（9）恙虫病东方体TSA蛋白基因序列扩增：利用引物二轮扩增，进行胶回收，产物大小与预期基本一致（如图1所示）；

（10）蛋白诱导表达： 收取诱导后的菌液，12%的SDS-PAGE和Western blot结果表明重组菌可见单一目的条带（如图2所示）；

（11）恙虫病东方体TSA蛋白表达形式分析：分别收取破碎细菌后的上清和包涵体，SDS-PAGE结果表明，该重组菌以包涵体的形式表达蛋白（如图3所示）；

（12）恙虫病东方体TSA蛋白纯化：大量培养TSA蛋白的重组菌，收集蛋白样品，采用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化，结果表明成功纯化TSA重组蛋白（如图4所示）。

实施例二

本发明提出的一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，包括以下步骤：

（1）引物合成：参照GenBank及所需要的酶切位点设计恙虫病东方体TSA致病蛋白引物1-30条，共计30条引物，采用overlapPcr方法合成该蛋白序列全长。

（2）目的基因的获取与扩增：合成恙虫病东方体TSA蛋白，PCR扩增TSA蛋白全长序列，依次进行全长PCR一轮、全长PCR二轮反应，全长PCR一轮反应体系为50ul：在PCR管中依次加入ddH

（3）pET30a-TSA重组表达质粒的构建：PCR扩增的同时，用BamHI-Xhol双酶切处理pET30a质粒，进行胶回收，重组反应体系为：步骤（2）中的TSA回收产物4ul，pET30a＋载体3.5ul，重组酶2.5ul,50℃水浴25min，放置2.5分钟降温，进行菌落筛选实验，挑取单克隆菌落，振荡培养13h，保存菌液，提取质粒并送测序，即得重组菌菌液；

（4）恙虫病东方体TSA蛋白的诱导表达：将经过测序保存的重组菌菌液，于37℃，220r/min震荡培养至菌液D600为0.7时，加入0.4mM的IPTG进行诱导表达，收集菌液超声处理后，获得蛋白样品；

（5）Western blot 试验：使用步骤（4）中的蛋白样品，以12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，将蛋白转移至硝酸纤维素膜5%脱脂乳封闭1h，鼠源His抗体孵育过夜，PBST洗涤4次，每次5min，使用HRP标记的山羊抗小鼠二抗37℃孵育1h，PBST洗涤4次，5min每次，显影；

（6）恙虫病东方体TSA重组蛋白表达形式分析：步骤（3）中保存的重组菌，加入IPTG进行诱导表达，收取菌液，经超声破碎后，4000r/min离心10min，收取上清，用PBS重悬沉淀，分别取上清、细菌包涵体制备样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验；

（7）恙虫病东方体TSA重组蛋白纯化：复苏TSA蛋白相关重组菌，转移到1L培养基中，37℃条件下振荡培养至菌液D600为0.7,加入0.2mM的IPTG进行诱导表达，4h后收集蛋白，采用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化，制备蛋白样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，分析蛋白纯化效果；

（8）通过上述流程，成功于体外诱导表达纯化获取了大量纯度较高的恙虫病东方体TSA重组蛋白。

实施例三

本发明提出的一种用于恙虫病东方体TSA蛋白诱导表达及大量纯化的方法，包括以下步骤：

（1）引物合成：参照GenBank及所需要的酶切位点设计恙虫病东方体TSA致病蛋白引物1-30条，共计30条引物，采用overlapPcr方法合成该蛋白序列全长。

（2）目的基因的获取与扩增：合成恙虫病东方体TSA蛋白，PCR扩增TSA蛋白全长序列，依次进行全长PCR一轮、全长PCR二轮反应，全长PCR一轮反应体系为50ul：在PCR管中依次加入ddH

（3）pET30a-TSA重组表达质粒的构建：PCR扩增的同时，用BamHI-Xhol双酶切处理pET30a质粒，进行胶回收，重组反应体系为：步骤（2）中的TSA回收产物4ul，pET30a＋载体3.5ul，重组酶2.5ul,50℃水浴25min，放置2分钟降温，进行菌落筛选实验，挑取单克隆菌落，振荡培养12h，保存菌液，提取质粒并送测序，即得重组菌菌液；

（4）恙虫病东方体TSA蛋白的诱导表达：将经过测序保存的重组菌菌液，于37℃，220r/min震荡培养至菌液D600为0.6时，加入0.4mM的IPTG进行诱导表达，收集菌液超声处理后，获得蛋白样品；

（5）Western blot 试验：使用步骤（4）中的蛋白样品，以12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，将蛋白转移至硝酸纤维素膜5%脱脂乳封闭1h，鼠源His抗体孵育过夜，PBST洗涤4次，每次5min，使用HRP标记的山羊抗小鼠二抗37℃孵育1h，PBST洗涤4次，5min每次，显影；

（6）恙虫病东方体TSA重组蛋白表达形式分析：步骤（3）中保存的重组菌，加入IPTG进行诱导表达，收取菌液，经超声破碎后，4000r/min离心10min，收取上清，用PBS重悬沉淀，分别取上清、细菌包涵体制备样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验；

（7）恙虫病东方体TSA重组蛋白纯化：复苏TSA蛋白相关重组菌，转移到1L培养基中，37℃条件下振荡培养至菌液D600为0.6,加入0.2mM的IPTG进行诱导表达，4h后收集蛋白，采用Ni-IDA亲和层析柱进行纯化，制备蛋白样品，用12%的分离胶进行SDS-PAGE试验，分析蛋白纯化效果；

（8）通过上述流程，成功于体外诱导表达纯化获取了大量纯度较高的恙虫病东方体TSA重组蛋白。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。