pMHC占有率的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物的组成

摘要

本发明描述了用不同核酸分子条形码化的pMHC多聚体种类及其用途：确定生物样品中的抗原反应性和TCR亲和力两者以及对对应的T细胞转录组、T细胞蛋白质组、T细胞表观基因组或TCR基因座进行测序。

说明书

本申请要求于2018年12月18日提交的美国临时专利申请62/781,377的权益和优先权，所述美国临时专利申请的内容通过引用结合在此。

背景技术

最近已经开发出了条形码抗体和条形码pMHC多聚体，使得同源细胞和结合蛋白/肽

发明内容

本文提供了产生共价和非共价缀合的条形码SA-寡核苷酸缀合物的组合物和方法(图1)可用作将T细胞组学分析与TCR-pMHC亲和力评估并行结合的平台。

一方面，本发明提供了不同主链(例如，链霉亲和素)占有率的条形码pMHC多聚体种类，其由至少一种非共价结合至链霉亲和素分子的生物素化pMHC分子和至少一种共价或非共价结合到相同主链分子的核酸分子组成，其中核酸可以包含中央条形码区。

另一方面，本发明提供了使用HPLC纯化将链霉亲和素与生物素化的寡核苷酸进行条形码编码以获得所期望的链霉亲和素占有率。

另一方面，本发明提供了使用共价键(例如，硫醚键或双芳基腙缀合键)对链霉亲和素进行条形码编码，其中每链霉亲和素具有至少一种寡核苷酸。

一方面，本发明提供了用至少一种核酸分子进行条形码编码的pMHC多聚体，所述至少一种核酸分子包括中央条形码区和聚-A尾。

另一方面，本发明提供了用至少一种核酸分子进行条形码编码的pMHC多聚体，所述至少一种核酸分子包括中央条形码区和与TCR恒定基因互补的核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了用至少一种核酸分子进行条形码编码的pMHC多聚体，所述至少一种核酸分子包括中央条形码区和模板切换寡核苷酸序列。

另一方面，本发明提供了用于制备或使用本文公开的条形码pMHC多聚体的方法。

一方面，本发明提供了肽-主要组织相容性复合物(pMHC)条形码多聚体，包括：

至少一种可调谐的pMHC实体，其中所述pMHC实体包括：

至少一种pMHC分子，所述至少一种pMHC分子由主链分子连接；以及

每主链分子至少一种核酸分子，

其中所述核酸分子包括共价或非共价连接的缀合物。

在pMHC多聚体的一些实施例中，核酸分子包括：

pMHC条形码核苷酸的中央拉伸，以及

核苷酸的第二拉伸，所述核苷酸的第二拉伸与靶寡核苷酸互补。

在一些实施例中，pMHC多聚体用于NGS中。

在pMHC多聚体的一些实施例中，主链分子是链霉亲和素。

在pMHC多聚体的一些实施例中，所述多聚体每主链分子包括至少一种pMHC实体、至少两种pMHC实体、至少三种pMHC实体或至少四种pMHC实体。

在一些实施例中，pMHC多聚体用于监测T细胞受体(TCR)-pMHC亲和力。

在pMHC多聚体的一些实施例中，所述链霉亲和素与所述至少一种核酸分子共价缀合，由此每链霉亲和素提供至少四种MHC单体。

在pMHC多聚体的一些实施例中，所述链霉亲和素与所述至少一种核酸分子非共价缀合，其中所述核酸分子是生物素化的，并且所述至少一种生物素化的核酸分子和链霉亲和素以一定比率复合，其中所述比率选自由以下项组成的组：1链霉亲和素:1寡核苷酸,以及1链霉亲和素:2寡核苷酸,以及1链霉亲和素:3寡核苷酸。

在一些实施例中，pMHC多聚体通过HPLC纯化工艺制备。

在pMHC多聚体的一些实施例中，其中所述链霉亲和素与所述至少一种核酸分子共价缀合，其中所述核酸分子包括条形码和至少一种生物素结合位点，其中所述结合位点包括：生物素化的肽、生物素化的蛋白质、生物素化的聚合物、生物素化的荧光团、生物素化的可裂解寡核苷酸或生物素化的试剂。

在pMHC多聚体的一些实施例中，其中所述至少一种核酸分子包括至少10个连续腺嘌呤的5’PCR柄区、中央条形码区、任选的UMI，或任选的3’聚-A尾区。

在pMHC多聚体的一些实施例中，所述核酸3’端尾中的至少一种由与靶寡核苷酸序列互补的任何序列组成。

在pMHC多聚体的一些实施例中，所述至少一种核酸分子的长度为约10-200个核苷酸或更长。

另一方面，本发明提供了一种组合物，包括多个任何上述pMHC多聚体的子集，其中pMHC多聚体的每个子集结合不同的肽并具有对应的条形码区域序列。

另一方面，本发明提供了一种将特定MHC分子与对应的T细胞转录组连接的方法，包括：

a)形成测试样品，所述测试样品包括任何上述pMHC多聚体分子、T细胞，和颗粒中的多个，所述颗粒与结合靶寡核苷酸连接，所述结合靶寡核苷酸包括5’PCR柄、中央细胞条形码、UMI和诱饵序列；

b)由所述测试样品形成液滴，使得每个液滴包含不多于一个的颗粒，并且一个T细胞与所述一个或多个pMHC多聚体分子结合；

c)在每个液滴中生成T细胞cDNA文库和pMHC条形码文库；并且

d)对所述T细胞mRNA文库和所述MCH条形码文库两者进行测序，由此将特定的MHC分子与所述对应的T细胞转录组连接。

在所述方法的一些实施例中，所述诱饵序列是3’聚-(dT)。

另一方面，本发明提供了一种多聚体pMHC，包括：

一个或多个pMHC分子，所述一个或多个pMHC分子由主链分子连接；以及

至少一种核酸分子，所述至少一种核酸分子连接至所述主链，其中所述核酸分子包括被设计用于扩增的核酸(条形码区)的中央拉伸；和核苷酸序列，所述核苷酸序列与TCR恒定基因互补。

在一些实施例中，所述多聚体pMHC包括第一类型的核酸分子，将所述第一类型的核酸分子连接至所述主链；并且其中所述第一类型的核酸分子包括中央条形码区和与TCRα或TCRβ恒定基因互补的核苷酸序列。

在一些实施例中，所述多聚体pMHC包括连接至所述主链的第一和第二类型的核酸分子；并且其中：

所述第一类型的核酸分子包括中央条形码区和与TCRα恒定基因互补的核苷酸序列，并且

所述第二类型的核酸分子包括中央条形码区和与TCRβ恒定基因互补的核苷酸序列；并且

所述两种类型的所述核酸分子的所述条形码区具有相同的序列；并且

任选地，用于所述两种类型的核酸分子中的每一种的UMI序列将是随机的，并且因此彼此不同，尽管其将位于相应核酸的相同区域。

在多聚体pMHC的一些实施例中，所述核酸分子包括5’PCR柄、中央条形码区、UMI和与TCR恒定基因互补的3’核苷酸序列。

在多聚体pMHC的一些实施例中，所述核酸分子包括与所述TCR恒定基因的5’端互补的核苷酸序列。

在多聚体pMHC的一些实施例中，所述TCR恒定基因是TCRα恒定基因、TCRβ恒定1基因或TCRβ恒定2基因。

在多聚体pMHC的一些实施例中，所述5’端核酸分子和/或3’端核酸分子与所述主链分子连接。

在多聚体pMHC的一些实施例中，所述核酸分子进一步包括邻近于所述条形码区的唯一分子标识符(UMI)。

在多聚体pMHC的一些实施例中，所述至少一种核酸分子的长度为约10-200个核苷酸或更长。

另一方面，本发明提供了一种组合物，包括任何上述pMHC多聚体的多个子集，其中pMHC多聚体的每个子集结合不同的肽并具有对应的条形码区域序列。

另一方面，本发明提供了一种将特定MHC分子与对应的TCRα序列和/或TCRβ序列连接的方法，包括：

a)提供任何上述多聚体pMHC中的一个或多个；

b)将所述多聚体pMHC分子与T细胞接触；

c)将与所述多聚体MHC分子结合的T细胞和不与所述多聚体MHC分子结合的那些T细胞分离；

d)裂解所述已分离的T细胞；

e)生成DNA文库，其中每个DNA分子包括TCRα和/或TCRβ基因的序列以及pMHC条形码；并且

f)对所述DNA文库进行测序，由此将所述特异性pMHC分子与所述对应的TCRα序列和/或TCRβ序列连接。

在上述方法的一些实施例中，所述步骤c)通过FACS分选或基于磁珠的分离来完成。

在上述方法的一些实施例中，多聚体pMHC分子被直接或间接荧光标记。

在上述方法的一些实施例中，结合有条形码的pMHC分子的T细胞在单个收集管中被大量分选。

在上述方法的一些实施例中，结合有条形码的pMHC分子的同源T细胞被分选至单独的板孔中作为单个细胞。

另一方面，本发明提供了一种多聚体pMHC，包括：

一个或多个pMHC分子，所述一个或多个pMHC分子由主链分子连接；以及

至少一种核酸分子，所述至少一种核酸分子连接至所述主链，其中所述核酸分子包括被设计用于扩增的核酸(条形码区)的中央拉伸；和模板切换寡核苷酸序列。

在多聚体pMHC的一些实施例中，所述核酸分子包括5’PCR柄、中央条形码区、UMI和3’模板切换寡核苷酸序列。

在多聚体pMHC的一些实施例中，所述模板切换寡核苷酸序列包括3核糖鸟苷的3’拉伸。在多聚体pMHC的一些实施例中，所述至少一种核酸分子的长度为约10-200个核苷酸或更长。

另一方面，本发明提供了一种组合物，包括任何上述pMHC多聚体的多个子集，其中多聚体pMHC的每个子集结合不同的肽并具有对应的条形码区域序列。

另一方面，本发明提供了一种将特定pMHC分子与对应的TCRα互补序列和/或TCRβ互补序列连接的方法，包括：

a)形成测试样品，所述测试样品包括任何上述多聚体pMHC分子、T细胞，和珠粒中的多个，所述珠粒与寡核苷酸缀合，所述寡核苷酸包括5’PCR柄、中央细胞条形码、UMI和与TCR恒定基因互补的3’核苷酸序列；

b)由所述测试样品形成液滴，使得每个液滴包含不多于一个的珠粒，并且一个T细胞与所述一个或多个多聚体MHC分子结合；

c)生成DNA文库，其中每个DNA分子包括TCRα和/或TCRβ基因的序列以及pMHC条形码；并且

d)对所述DNA文库进行测序，由此将特异性pMHC分子与对应的TCRα序列和/或TCRβ序列连接。

在所述方法的一些实施例中，所述珠粒选自水凝胶珠粒、硬珠粒和可溶解珠粒。

在所述方法的一些实施例中，所述珠粒与两个寡核苷酸缀合，其中所述第一寡核苷酸包括5’PCR柄、中央细胞条形码、UMI和与TCRα恒定基因互补的3’核苷酸序列；所述第二寡核苷酸包括5’PCR柄、中央细胞条形码、UMI和与TCRβ恒定基因互补的3’核苷酸序列；并且用于所述两种寡核苷酸的所述中央细胞条形码具有相同的序列。

在所述方法的一些实施例中，所述DNA文库生成步骤c)包括使用MMLV逆转录酶对TCR mRNA进行逆转录。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，PCR柄使得条形码序列的文库制备成为可能。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，PCR柄可以具有i7衔接子序列。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，条形码区包括至少4个核苷酸。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述pMHC分子经由链霉亲和素-生物素结合、经由MHC重链或经由MHC轻链(β2M)连接至所述主链。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述pMHC分子经由链霉亲和素-生物素结合连接至所述主链。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述多聚体pMHC包括至少一种MHC分子。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述至少一种核酸分子进一步包括化学修饰。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述至少一种核酸分子的5’或3’端经由隔离序列被附接至氨基。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述隔离序列可以是6-碳隔离序列或12-碳隔离序列。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述至少一种核酸分子包括所述5’端和/或3’端处的硫代磷酸酯核甘酸。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述至少一种核酸分子与所述主链分子之间的连接允许所述核酸分子的诱导型解离。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述至少一种核酸分子经由共价或非共价键连接至主链分子。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述共价键是硫醚。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，

所述至少一种核酸分子经由诱导型可裂解键连接至所述主链分子在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述诱导型可裂解键是可光裂解的，或包括二硫键。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述MHC分子是MHC I类和/或MHCII类单体。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述MHC分子用肽复合。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述MHC分子是生物素化的。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述主链进一步包括选自由以下项组成的组的一种或多种标签：荧光标签、His标记和金属离子标记。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述主链直接与所述荧光标签缀合。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述荧光标签是荧光团标记的寡核苷酸。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述荧光团标记的寡核苷酸与连接至所述主链的所述核酸分子互补。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述主链用荧光团标记的抗-链霉亲和素抗体标记。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述荧光团是荧光蛋白、荧光染料或量子点。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述至少一种核酸分子包括选自由以下项组成的组的核酸分子：DNA、RNA、人工核苷酸、PNA和LNA。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述多聚体pMHC结合同源T细胞。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述多聚体pMHC与流式细胞术应用相容。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述流式细胞术应用是单细胞或大量细胞荧光活化细胞分选(FACS)。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述多聚体pMHC与基于NGS的应用相容。

在任何上述多聚体pMHC和方法的一些实施例中，所述基于NGS的应用是基于液滴的单细胞测序。

另一方面，本发明提供了一种用于检测样品中抗原应答细胞的方法，包括：

a)提供任何上述多聚体pMHC中的一个或多个；

b)将所述多聚体pMHC分子与所述样品接触；以及

c)检测所述多聚体pMHC分子与所述抗原应答细胞的结合，由此检测对所述MHC分子中存在的抗原进行应答的细胞，其中所述结合是通过扩增通过所述主链分子与所述一个或多个MHC分子连接的核酸分子的条形码区来检测的。

在所述方法的一些实施例中，所述样品选自由以下项组成的组：血液样品、外周血液样品、血液衍生样品、组织样品、体液、脊髓液和唾液。

在所述方法的一些实施例中，样品是从哺乳动物获得的。

在所述方法的一些实施例中，所述方法进一步包括通过选自由以下项组成的组的方法：流式细胞术、FACS、基于磁珠的选择、尺寸排阻、梯度离心、柱附着和凝胶过滤进行细胞选择。

在所述方法的一些实施例中，所述扩增是PCR。

在所述方法的一些实施例中，所述核酸分子的所述条形码区的所述检测包含对所述条形码区进行测序或通过qPCR检测所述条形码区。

附图说明

图1描绘了用于与链霉亲和素缀合以用于制造条形码pMHC多聚体的经修饰的寡核苷酸的一般结构。紫色条代表寡核苷酸，并且绿色星代表5’修饰。以下是共价缀合中使用的寡核苷酸的序列。寡核苷酸的5’端是带有12-碳间隔液的氨基。还可以使用6-碳间隔液。可以使用可选的寡核苷酸修饰代替氨基，包含但不限于硫醇基或生物素基。5’生物素基团可以用于与链霉亲和素的非共价连接。这些寡核苷酸修饰也可以并入寡核苷酸的3’端上。PCR柄使条形码序列的文库制备成为可能。在此特定情况下，PCR柄是i7衔接子序列。四聚物条形码序列跟随在PCR柄之后，并且是对应于给定pMHC复合物序列的序列。在此序列中，pMHC条形码由6个核苷酸组成，这允许多达4096个四聚物条形码可能性。较长的pMHC条形码序列可以用于增加的通量。寡核苷酸的3’端是可以结合至靶序列的聚-A尾，在此情况下为聚(dT)VN。对于此寡核苷酸，使用了25个腺嘌呤，尽管可以使用更长的腺嘌呤延伸。聚-A尾的5’端处的B核苷酸(G，C或T)使得能够与聚(dT)VN序列的第二至最后3’核苷酸处的V(G，C，或A)核苷酸结合。如果诱饵序列的N核苷酸(任何碱基)是碳，那么其与所描绘的寡核苷酸序列互补结合。寡核苷酸3’端的任选的硫代磷酸酯DNA碱基提供对核酸外切酶活性的防范。可以将已修饰的碱基放置在任何位置处。

图2示出了条形码寡核苷酸与链霉亲和素的缀合，其间具有二硫桥。在所示出的实例中，缀合可以使用Solulink蛋白-寡核苷酸缀合试剂盒(TriLink生物科技公司(TriLinkBiotech))进行。链霉亲和素(在此情况下来自蛋白酶)用琥珀酰亚胺基-6-肼基-烟酰胺(S-HyNic)修饰。用琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺类似物(S-SS-4FB)修饰5’-氨基修饰的寡核苷酸。经修饰的链霉亲和素和经修饰的寡核苷酸结合产生条形码链霉亲和素。可选的方法包含将寡核苷酸与具有可光裂解的连接子(未描绘)的链霉亲和素缀合。

图3示出了DNA条形码寡核苷酸在变性条件下从链霉亲和素解离。在SYBR-安全琼脂糖凝胶(泳道1a)上运行与链霉亲和素缀合的66聚体寡聚体，其间有二硫桥。过量的寡核苷酸显示在100bp阶梯带以下。在泳道2a中，与泳道1a中相同量的条形码链霉亲和素与β-巯基乙醇一起孵育20分钟，然后装载至凝胶上。代表条形码链霉亲和素的带严重减少。相同的凝胶用考马斯蓝染色以使蛋白质可视化。在泳道1b中，条形码链霉亲和素是明显的，而泳道2b中的大部分蛋白质移位至凝胶的顶部。在没有寡核苷酸的负电荷的情况下，裸露的链霉亲和素迁移得慢得多。

图4示出了条形码链霉亲和素保留了结合生物素的能力。等量的条形码链霉亲和素与生物素磁珠粒(泳道1a)或链霉亲和素磁珠粒(泳道2a)一起孵育。等量的生物素磁珠粒或链霉亲和素磁珠粒用于此实验。样品经受磁性分离器分离结合的和未结合的条形码链霉亲和素。收获来自任一反应的所有未结合部分，并在SYBR-安全的琼脂糖凝胶上运行。相同的凝胶用考马斯蓝染色以使蛋白质可视化(泳道1a和2b)。条形码链霉亲和素的消耗(泳道1a和1b)表明生物素结合。生物素和链霉亲和素磁珠均购自瑞博奥公司(RayBiotech Inc)。

图5示出了条形码pMHC多聚体变体。靠左的条形码pMHC多聚体由链霉亲和素-寡核苷酸缀合物组成，该缀合物来源于共价缀合，之后根据已建立的技术

所有其它缀合物利用生物素化寡核苷酸与链霉亲和素之间的非共价键。左起第二个，条形码pMHC多聚体由比率为1:1(1b)纯化的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物组成，然后进行pMHC三聚化。左起第三个，条形码pMHC多聚体由比率为1:2(2b)纯化的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物组成，然后进行pMHC二聚化。最右侧，条形码pMHC多聚体由比率为1:3的已纯化的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物组成，然后与pMHC单体结合以得到链霉亲和素:单体摩尔比率为1:1。不同颜色的寡核苷酸代表每个多聚体物种的不同条形码序列。底部三角形描绘了预测的每个多聚缀合物的TCR-pMHC亲合力，其中4个单体＞3个单体＞2个单体＞1个单体。

图6包含四个板，图6A-6D，描绘了条形码pMHC多聚体检测的方法。在图6A中，含荧光团的链霉亲和素(例如，PE-链霉亲和素)被用作进一步与寡核苷酸缀合的起点。在图6B中，与共轭寡核苷酸互补的荧光团标记的寡核苷酸，退火至pMHC条形码寡核苷酸。此退火寡核苷酸的长度可以变化。在图6C中，荧光团标记的抗链霉亲和素抗体用于检测条形码pMHC多聚体。所使用的荧光团的化学物种可以包含但不限于荧光染料和量子点。也可以使用这些方法检测其中寡核苷酸非共价连接的条形码pMHC多聚体物种。图6D展示了用包含抗链霉亲和素抗体的不同荧光染料分别标记不同pMHC多聚体种类(包含相同肽)的可能性。图6A-6C中三种荧光标记技术中的任何一种可以被应用。以此方式，可以使用流式细胞术针对此特定的pMHC蛋白复合物的亲和力筛选不同的TCR。在此特定情况下，4单体pMHC多聚体(四聚物)不需要共价缀合的寡核苷酸，并且利用非共价结合寡核苷酸的pMHC多聚体种类不需要不同的寡聚体条形码序列，如果寡聚体需要阻断生物素结合位点的话。其它生物素化的分子理论上可以用来阻断生物素结合位点，如图14.

图7展示了使用条形码pMHC多聚体进行免疫表位亲和力监测的应用实例。一种肿瘤衍生的突变基因-编码蛋白被肽拼接用于TCR测序研究。在此描绘中，来自同一突变蛋白的两个重叠的肽氨基酸序列(用数字描绘)分别用生物素化的MHC(相同的MHC等位基因)复合，并且然后与如图所示的条形码链霉亲和素缀合物缀合。用于所有缀合物类型的寡核苷酸序列，无论pMHC，都将包含独特的条形码序列来区分它们(由附接至链霉亲和素的彩色线条表示)。条形码pMHC多聚体与样品混合在一起。TCRα序列和β序列经由单细胞RNA测序获得，并与同源pMHC多聚体类型配对。例如，使用这些缀合物的一项研究可以确定绿色肽-MHC复合物或红色肽-MHC复合物对相互结合的TCR序列是否具有更高的亲和力。

图8展示了条形码pMHC多聚体免疫-表位亲和力监测的另一应用实例。在此假设实例中，小瓶包含由链霉亲和素:寡核苷酸比率为1:1、1:2或1:3组成的条形码pMHC多聚体种类的规定混合物，其也可以被分别定义为链霉亲和素:pMHC单体的摩尔比为1:3、1:2和1:1。缀合物种类的寡核苷酸将包含独特的条形码序列来对其进行区分(不同颜色的序列)。因为据称肿瘤微环境

图9描绘了用于经由NGS检测的非共价结合的条形码pMHC多聚体的生成。生物素化寡核苷酸(包含pMHC多聚体特异性条形码)与链霉亲和素(或链霉亲和素-荧光团缀合物)以0.5-1.0寡核苷酸与1链霉亲和素的比率混合。经由HPLC精确纯化1:1的SA:寡核苷酸缀合物，从而除去未反应的链霉亲和素、未反应的生物素化寡核苷酸和不同水杨酸:寡核苷酸比率的缀合物。缀合物然后用生物素化的pMHC单体进行多聚体化。最终产物是条形码pMHC三聚物，其中每个链霉亲和素均具有一个寡核苷酸和三个pMHC单体。当制备由比率为1:2和1:3的链霉亲和素:寡核苷酸组成的缀合物时，使用相同的概念。

图10示出了当以足够高的浓度使用时，以及当检测中等亲和力的TCR时，不同单体比率的条形码pMHC多聚体可以类似地检测T细胞。链霉亲和素-寡聚物缀合物是通过将生物素化的寡聚物与链霉亲和素以1:1或1:2的比率连接而制备的。单独使用链霉亲和素作为对照，每个链霉亲和素(四聚物)具有4个pMHC单体，如底部图例所描绘的。1:1 Sa:寡核苷酸缀合物包含3种单体，而1:2Sa:寡核苷酸寡缀合物包含2种单体。出于本实验的目的，所有条形码缀合物的寡核苷酸由相同的69mer核苷酸序列组成。左边三列描绘了使用与CMV pp65肽复合的HLA-A*11:01 MHC I的多聚体染色，然后用链霉亲和素、具有一个寡核苷酸的链霉亲和素或具有两个寡核苷酸的链霉亲和素进行多聚体化。中间三列描绘了使用与EBV 399-408肽复合的HLA-A*11:01 MHC I的多聚体染色。右三列描绘了使用与EBV 416-424肽复合的HLA-A*11:01 MHC I的多聚体染色。每种染色中使用的链霉亲和素的量表明在该行的最左侧。多聚体阳性染色的百分比表明在每个方框中。先前，肽扩增细胞被用于用抗-CD3、抗-CD8、活/死染料以及非荧光团条形码pMHC多聚体(或四聚物)染色。二级染色由抗链霉亲和素组成，能够检测pMHC多聚体。流式细胞术门图例如图顶部所示。

图11展示了不同寡核苷酸和单体比率的条形码pMHC多聚体可以区分pMHC-TCR亲和力。链霉亲和素-寡核苷酸缀合物是经由共价键(硫醚键)将寡核苷酸共价连接至链霉亲和素上，或通过以不同的SA:寡核苷酸比率将生物素化的寡核苷酸连接至链霉亲和素上来制备的。为了本实验的目的，所有缀合物的寡核苷酸由46mer核苷酸序列组成。共价缀合物指示一个链霉亲和素分子与一个寡核苷酸缀合，其中所有四个生物素结合位点都可用。1b缀合物指示一个链霉亲和素连接至一个生物素化寡核苷酸上，剩下三个生物素结合位点。2b缀合物指示一个链霉亲和素连接至两个生物素化寡核苷酸上，剩下二个生物素结合位点。3b缀合物指示一个链霉亲和素连接至三个生物素化寡核苷酸上，剩下一个生物素结合位点。H-2Kb生物素化单体(MBLI)与高亲和力SIINFEKL肽或低亲和力SIIFFEKL肽

pMHC分子与链霉亲和素-寡核苷酸缀合物复合以生成条形码pMHC多聚体。OT-I脾细胞用不同SA量的各种条形码H-2Kb条形码pMHC多聚体种类染色(第一行0.25ug，第二行0.1ug，第三行0.025ug)。共价缀合物采用摩尔比率为1SA比4的单体进行pMHC四聚化。使用摩尔比率为1SA比3的单体对1b缀合物进行pMHC三聚化。使用摩尔比率为1SA比2的单体对2b缀合物进行pMHC二聚化。使用摩尔比率为1SA比1的单体对3b缀合物进行pMHC缀合。细胞同时用抗CD3、抗CD8、活/死染料和相应的非荧光团条形码pMHC多聚体种类染色。二级染色由抗链霉亲和素组成以检测pMHC多聚体。流式细胞术门图例如图顶部所示。pMHC多聚体阳性染色百分比以低、中或高强度展示在每个方框中。

图12展示了假设的实验结果，使用不同pMHC占用率的条形码pMHC多聚体来区分pMHC与TCR亲和力。在假设的实验环境中，SIINFEKL肽衍生的条形码pMHC多聚体和siiffekl肽衍生的条形码pMHC多聚体与OT-1脾细胞(左侧)混合。每种多聚体的比率可以基于实验目标进行调整。可选地，细胞的等分试样可以分别与SIINFEKL条形码pMHC多聚体或siiffekl条形码pMHC多聚体一起孵育。每个多聚体种类都有一个独特的条形码序列，以区别于其它多聚体种类。FACS分选可以在基于液滴的单细胞测序或其它单细胞测序平台(中间)之前使用。在右侧，预测条形码读取频率。在此情况下，基于高亲和力/亲合力SIINFEKL的pMHC条形码读数将在每个单体种类中占主导地位，而基于低亲和力/亲合力siiffekl的pMHC条形码读数很可能仅在4个单体种类中出现。对于此特殊情况，每种肽仅使用4种基于单体的pMHC多聚体就足以确定哪种pMHC复合物对这种特殊的TCR具有更高的亲和力。然而，在亲合力差异更为微妙的情况下，以及在涉及不同毒性接触率的情况下，使用pMHC条码种类可能会揭示亲合力的差异。

图13示出条形码pMHC多聚体可以用直接缀合的荧光团生成。链霉亲和素-寡核苷酸缀合物是经由硫醚键(Cov)通过共价连接寡核苷酸链霉亲和素制造的，或通过将生物素化寡核苷酸以1 SA:1寡核苷酸(1b)的比率共价连接至链霉亲和素上。另外，制造了一种含SA-寡核苷酸缀合物的荧光团(Alexa Fluor 647)。在此情况下，先将AF647直接与链霉亲和素缀合，然后将寡核苷酸直接与链霉亲和素缀合。为了本实验的目的，缀合物由46mer核苷酸序列组成。共价缀合物指示一个链霉亲和素分子与一个寡核苷酸缀合，其中所有四个生物素结合位点都可用。1b缀合物指示一个链霉亲和素连接至一个生物素化寡核苷酸上，剩下三个生物素结合位点。缀合物用包含HLA-A*02:01单体的生物素化的CMV pp65NLVPMVATV肽或阴性对照HLA-A*02:01单体(MBLI)以指定的比率多聚体化。先前用CMV pp65肽(NLVPMVATV)扩展的人类HLA-A*02:01PBMC用于缀合物染色。细胞用抗CD3、抗CD8、活/死染料和条形码pMHC多聚体染色。中间柱样品用MBLI商业CMV pp65 HLA-A*02:01PE四聚物染色作为对照。包含不含荧光团的缀合物的样品用抗水杨酸聚乙烯二次染色。流式细胞术门图例如图顶部所示。多聚体阳性染色的百分比指示在每个方框中。

图14示出了创建条形码pMHC多聚体种类的可选的方法。所有所描绘的缀合物种类经由共价键(例如，硫醚键)每链霉亲和素包含一个寡核苷酸。在实际的实验环境中，每个缀合物种类(4个单体、3个单体、2个单体或1个单体)将携带由不同颜色描述的独特条形码序列。生物素化的肽、生物素化的蛋白质、生物素化的脂质、生物素化的荧光团、生物素化的聚合物或可裂解的生物素化的寡核苷酸(所有可能性通常用紫色表示)以优化的比率与SA-寡核苷酸缀合物一起孵育，并用HPLC-纯化至所期望的生物素结合占有率。这些已纯化的缀合物然后用生物素化的pMHC单体进行多聚体化，导致每链霉亲和素的生物素结合位点被完全占据。底部三角形描绘了预测的每个多聚缀合物的TCR-pMHC亲合力，其中4个单体＞3个单体＞2个单体＞1个单体。

图15描绘了用于免疫-表位显性分析的大量pMHC多聚体条形码测序。在此实施例中，使用或不使用富集(如磁珠粒分离或FACS)从细胞中定量条形码pMHC多聚体(具有不同颜色线的星星)。在所示出的实例中，5种不同的gp100肽被制成单独的条形码pMHC多聚体，其中每种gp100肽/MHC复合物与一种独特的多聚体条形码(由不同的颜色表示)相关联。条形码pMHC多聚体可以利用共价连接的寡核苷酸或非共价连接的寡核苷酸。寡核苷酸将被加工用于文库制备和测序。

对于需要小条形码寡核苷酸文库(如8个或更少)的应用，无需测序即可确定pMHC多聚体条形码的定量。与pMHC多聚体区域互补的荧光标记寡核苷酸可以在与细胞孵育之前进行预退火。在与细胞孵育和随后的流式细胞术孵育之前，将每种条形码pMHC多聚体类型退火至包含寡聚体的独特荧光团。例如，包含gp100#1肽和相关寡核苷酸序列的pMHC多聚体将被预退火至互补的AlexaFluor488寡核苷酸，包含gp100#2肽和相关寡核苷酸序列的pMHC多聚体将被预退火至互补的AlexaFluor532寡核苷酸等。

图16展示了条形码pMHC多聚体与基于NGS的单细胞测序平台的使用。与靶细胞结合的条形码pMHC多聚体(在此实例中为共价键合的寡核苷酸)被捕获在单个液滴中。大多数单个液滴包含一个T细胞/条形码pMHC复合物连同一个包含目标寡核苷酸的颗粒。在此实例中，条形码寡核苷酸包含聚-A。寡核苷酸和T细胞基因都被反向转录，用于进一步的文库制备。任选地，在寡核苷酸与链霉亲和素的缀合期间，可以在寡核苷酸与链霉亲和素之间引入可裂解的键(紫外光或二硫键)。具体地，由于裂解缓冲液的还原环境，二硫键将在液滴中解离。

图17包含八个板，图17A-17H示出了靶向条形码pMHC多聚体的TCR基因座，以特异性测序TCR复合物读数和pMHC复合物读数。在大量测序和基于液滴的NGS平台中，寡核苷酸设计的可选的方案是具有寡核苷酸，该寡核苷酸靶向所期望的内源性mRNA转录物，同时维持pMHC复合物的同一性。描绘了条形码pMHC多聚体的各种设计，以特异性地询问TCR克隆性或单细胞TCR库以及对应的pMHC身份。这些设计允许在一次读取中对TCR转录物和pMHC条形码进行测序。PCR柄涉及PCR引物结合扩增的区域。条形码(BC)代表标识pMHC复合物的核苷酸序列TCR互补序列(TCR互补)与TCR恒定基因互补。TCR互补序列将在逆转录过程中作为引物。

在图17A中，条形码寡核苷酸与链霉亲和素共价连接，形成条形码四聚物。此条形码四聚物包含与TCRβ恒定区基因互补的3’序列。TCRβ恒定基因寡核苷酸序列与TCRβ恒定1基因和TCRβ恒定2基因互补，因为这两个恒定基因在5’端(最接近相应的J基因)处具有显著的序列相似性。已纯化的条形码链霉亲和素缀合物然后用pMHC四聚化。独有的分子标识符(UMI)也可以邻近于四聚物条形码放置，用于下游PCR重复数据消除，从而更准确地定量pMHC结合。TCRβ靶向寡核苷酸可以单独地用于研究TCR克隆性。可选地，TCRα恒定基因靶向寡核苷酸可以单独使用(未描绘)。

在图17B中，来自A的已纯化的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物被进一步修饰，以包含靶向TCRα恒定基因的共价附接的寡核苷酸。此构建体将适用于单细胞测序平台，以得到完整的TCRα/β序列(对于图17D至图H也一样)。然后此双寡核苷酸链霉亲和素缀合物将被四聚化。

在图17C中，靶向生物素化寡核苷酸的TCRβ非共价附接至链霉亲和素上，纯化，并且然后用生物素化pMHC单体三聚物化。

在图17D中，来自C的已纯化的TCRβ缀合物通过非共价附接靶向生物素化寡核苷酸的TCRα进一步修饰，纯化，然后用生物素化pMHC单体二聚化。

在图17E中，使用单寡核苷酸，该寡核苷酸包含TCRβ和靶向序列的TCRα，并在两端上进行生物素化。所期望的缀合物将被纯化并用生物素化的pMHC单体二聚化。可选的寡核苷酸设计是在两半之间包含可切割的(UV或二硫)键。

在图17F中，使用单寡核苷酸，该寡核苷酸包含TCRβ和靶向序列的TCRα。正确尺寸的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物被纯化并用生物素化的pMHC单体进行2x三聚物化，因此每个寡聚物总共得到6个pMHC单体。如在图17E中，此设计可以进一步增强以在两半之间包含可裂解的(紫外线或二硫)键。

在图17G中，一种包含TCRβ和靶向序列的TCRα的单寡核苷酸共价附接至链霉亲和素上。已纯化的缀合物用生物素化的pMHC单体四聚化。如在图17E和图中，此缀合物可以包含可裂解的键。

在图17H中，一种包含TCRβ和靶向序列的TCRα的单生物素化的寡核苷酸非共价附接至链霉亲和素上。已纯化的缀合物用生物素化的pMHC单体三聚物化。如在图17E至图G中，此缀合物可以包含可裂解的键。

图18示出了靶向条形码pMHC多聚体的TCR基因座，用于FACS分选的单细胞TCR克隆性或配对TCRα/β测序。出于说明的目的，仅示出了若干设计，但是可以潜在地使用来自前面附图的任何条形码pMHC万用表设计。

左侧描绘了包含TCRβ恒定基因靶向寡聚体的条形码四聚物。可选地，可以使用TCRα恒定基因靶向寡核苷酸，或两者都可以与上图中描述的设计一起使用。这些互补的TCRα/β寡核苷酸序列将作为内源性TCRα/βmRNA转录物的逆转录引物。为了在细胞分选应用中使用靶向条形码pMHC多聚体的TCR，可以如图6所描述的引入荧光。T细胞首先被单细胞分选并在井中反向转录，然后在单个试管中进行大量处理，以用于克隆性研究。T细胞#1被包含条形码序列#1的条形码pMHC多聚体结合，而T细胞#2被包含条形码序列#2的条形码pMHC多聚体结合。在右侧，条形码pMHC多聚体同时包含TCRαβ和靶向序列，如前述图所描述的。T细胞是在单个平板孔中分选和处理的单细胞，在这种情况下是96孔板。

克隆性研究使研究人员能够了解给定pMHC综合征的经颅多普勒超声的使用范围。如果同时使用TCRα和TCRα条形码寡核苷酸，批量测序的缺点是TCRα和TCRβ序列不能配对。为了克服此挑战，可以处理T细胞，如右侧所示，这允许TCRα和TCRα序列配对。

文库制备策略如以下所描述的，并在后续图中进行扩展:

i)单个分选的T细胞被反向转录，并且随后被批量处理。RNase处理之后是桥接衔接子连接。桥衔接子是所有反向转录基因共有的。随后的聚合酶链反应扩增产生最终的文库制备。

ii)单分选的细胞通过SMARTScribe RT(克隆技术)进行反向转录。更聪明的第一链合成和逆转录模板转换产生5’-种族就绪的基因。随后的大量聚合酶链反应扩增产生最终的文库制备。

iii)单细胞分选的T细胞被裂解，并进行孔内逆转录、孔内核糖核酸酶处理，然后进行孔内桥接接头连接。桥衔接子上游序列对所有孔都是通用的，但是每个孔在最接近TCR序列的位点接收具有唯一细胞条形码的桥衔接子。这种方法的主要优点是来自同一细胞的TCRα和TCRα序列可以配对，从而可以确定单个T细胞的完整TCR序列。将连接的转录物汇集在一起，用普通引物进行后续的聚合酶链反应扩增，得到最终的文库制备。

iv)单分选的T细胞被裂解并进行孔内智能切割(克隆技术)。更聪明的第一链合成和逆转录模板转换产生5’-种族就绪的基因。为了对每个孔进行单独的条形码标记，孔内聚合酶链反应扩增使用与SMARTerIIA寡核苷酸互补的正向引物进行，该寡核苷酸在SMARTerIIA结合序列上游具有独特的细胞条形码序列。这将区分转录本和单个孔。在正向引物的5’端，一个共同的启动位点(即i5序列)允许样品汇集。使用通用引物的聚合酶链反应扩增产生最终的文库制备。与iii一样，此方法的主要优点是来自同一细胞的TCRα和TCRα序列可以配对。

图19展示了使用桥衔接子进行克隆性研究的靶向条形码pMHC多聚体文库制备的TCR。如图18(i)所描述的，由同源T细胞结合的条形码pMHC多聚体首先被单细胞分选，反向转录，并且然后进行批量处理。为了显示，示出了TCRβ和TCRβ衍生的转录物两者，尽管克隆性研究只需要使用一个。荧光团跟踪策略的使用在图6中描述以在FACS分选中需要。井内逆转录后进行核糖核酸酶处理，并且然后进行桥衔接子连接。用于大量测序的桥衔接子(i5序列)对所有细胞都是相同的，并且在桥衔接子的底部寡核苷酸上包含一个5’磷酸，这是连接到新反向转录的TCR转录物的3’末端所必需的。桥衔接子还在非连接链的3’端包含6个随机核苷酸，以增强衔接子结合9的稳定性。连接后，用普通引物进行PCR扩增，产生最终的文库制备。

图20展示了使用智能划片酶(克隆技术公司(Clontech))进行大量测序的靶向条形码pMHC多聚体文库制备的TCR。如图18(ii)所描述的，由同源T细胞结合的条形码pMHC多聚体首先被单细胞分选，反向转录，并且然后进行批量处理。为了显示，示出了TCRβ和TCRβ衍生的转录物两者，尽管克隆性研究只需要使用一个。荧光团跟踪策略的使用在图6中描述以在FACS分选中需要。具有智能切片酶的孔内RT经由模板切换将SMARTerIIA寡核苷酸序列添加至新反向转录的转录物的3’端。模板切换后，用普通引物进行大量的PCR扩增，产生最终的文库制备。

图21展示了靶向条形码pMHC多聚体文库的TCR，用于使用桥衔接子的单细胞配对TCRα/β测序。如图18(iii)所描述的，由同源T细胞结合的条形码pMHC多聚体是被分选至单个孔中的单细胞。荧光团跟踪策略的使用在图6中描述以在FACS中需要。将分选的细胞裂解并进行孔内RT、孔内RNase处理，并且然后进行孔内桥衔接子连接(为简单起见，在连接步骤中仅显示一个TCR转录物)。每个孔的桥衔接子(列，i5序列)包含独特的细胞条形码，可使TCRα/β配对。在此图示中，00001代表用于此特定孔的细胞条形码。桥衔接子连接链上的5’磷酸能够连接到新反转录TCR转录物的3’端。桥衔接子还在非连接链的3’端包含6个随机核苷酸，以增强衔接子结合9的稳定性。连接后，汇集样品以用普通引物进行PCR扩增，产生最终的文库制备。

图22展示了使用智能划片酶进行单细胞测序的靶向条形码pMHC多聚体文库制备的TCR。如图18(iv)所描述的，由同源T细胞结合的条形码pMHC多聚体是被分选至单个孔中的单细胞。荧光团跟踪策略的使用在图6中描述以在FACS中需要。分选后的单细胞被裂解，并用智能划片酶(克隆技术公司)进行孔内RT，该酶经由模板切换将SMARTerIIA寡核苷酸序列添加至新反向转录的转录物的3’端。随后，使用正向引物进行孔内PCR扩增(为简单起见，仅显示单TCR转录物)，该正向引物包含SMARTerIIA结合序列以及细胞条形码序列(每个孔都是唯一的)以及5’端处的共同i5序列。在此图示中，单元格条形码由00001表示。对每个孔使用包含独特细胞条形码的正向引物可以使TCRα/β序列配对。样品被汇集用于进一步的PCR扩增，产生最终的文库制备。

图23包含八个板，图23A至图23B展示了用于基于液滴的单细胞TCRα/β单细胞测序的包含切换寡核苷酸的条形码pMHC多聚体。在图23A中，pMHC多聚体与包含切换序列的寡核苷酸共价连接。在图23B中，pMHC多聚体与包含切换序列的寡核苷酸非共价连接。针对此类型的pMHC多聚体的另外设计包含但不限于图5和图10。

图24描绘了基于液滴的测序珠粒(包含但不限于水凝胶珠粒、硬珠粒或可溶解珠粒)与由PCR柄、细胞条形码(BC)和TCR恒定基因互补序列组成的寡聚体缀合的用途。为简单起见，仅示出一个液滴。每个珠粒可以包含靶向寡核苷酸序列的TCRα和/或TCRα。如果同时使用TCRα和TCRα型寡核苷酸，对于给定的珠粒，两者将包含相同的细胞条形码。TCRα和/或TCRα寡核苷酸可以通过若干方式中的一种来解离，包含但不限于可光裂解的键或二硫键。另外，每个寡核苷酸可以包含用于PCR重复数据消除的UMI。

具有单珠粒和单细胞(在这种情况下，显示了条形码四聚物阳性T细胞)的单液滴将包含裂解试剂，该试剂释放凝胶珠粒寡核苷酸、T细胞mRNA以及四聚物-阳性T细胞-结合的条形码寡核苷酸两者。pMHC四聚物结合寡核苷酸也可以通过可裂解的键解离。反转录从TCR mRNA中添加TCR V(D)J序列，在珠粒寡核苷酸的3’端处有一式三份脱氧胞苷拉伸(为简单起见，在滴液下方仅描绘了单反转录基因)。此脱氧胞苷拉伸结合切换寡核苷酸用于模板切换。随后的第二链合成和PCR扩增完成了文库制备。

具体实施方式

本发明描述了与流式细胞术应用相容的条形码pMHC多聚体的生成，包含但不限于单细胞或大量细胞荧光激活细胞分选(FACS)，以及与基于NGS的应用和包含多重分析物分析和单细胞分析的其它平台的兼容性。本公开内容还描述了通过共价和非共价寡核苷酸连接生成条形码pMHC多聚体，以及这些多聚体在pMHC-TCR亲和力评估中的组合。本公开内容还描述了一种新的靶向TCRα/β恒定基因的pMHC多聚体条形码方法，该方法通过同时处理TCR序列和pMHC多聚体条形码来简化测序文库的制备。条形码寡核苷酸的长度和/或序列不是固定的，并且可以改变，包含使用各种碱基修饰。

本公开内容描述了pMHC多聚体(在一些实施例中，pMHC四聚物)的至少两种寡条形码策略。第一种使用条形码聚-A尾寡核苷酸将特定的pMHC与对应的T细胞转录组(包含TCR序列)连接起来。第二种条形码方法使用与链霉亲和素缀合的寡核苷酸，该寡核苷酸靶向TCRα和/或TCRα基因座，由此两种寡核苷酸都包含四聚物条形码。重要的是，如果同时使用TCRα和TCRα寡核苷酸两者，它们将包含用于给定四聚物的相同四聚物条形码信息。通过此法，所有反向转录的TCR序列都包含四聚物条形码序列，不需要单独的文库制备。

在本发明的组合物和方法中提供和使用的MHC蛋白可以是本领域已知的任何适合的MHC分子，其中期望将MHC蛋白最初包含的肽与另外的肽交换。通常，它们具有式(α-β-P)

MHC蛋白质可以来自任何哺乳动物或鸟类种类，例如，灵长类动物，特别是人；啮齿动物，包含小鼠、大鼠和仓鼠；兔子；马、牛、犬、猫；等。例如，MHC蛋白质可以来源于人HLA蛋白质或鼠H-2蛋白质。HLA蛋白质包含II类亚单元HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα和HLA-DRβ，以及I类蛋白质HLA-A、HLA-B、HLA-C、和β2-微球蛋白。H-2蛋白质包含I类亚单元H-2K、H-2D、H-2L、和II类亚单元I-Aα、I-Aβ、I-Eα和I-Eβ，和β2-微球蛋白。一些有代表性的MHC蛋白质的序列可以在卡巴特(Kabat)等人中找到。免疫学感兴趣的蛋白质序列，NIH出版物第91-3242号，第724-815页。适用于本发明的MHC蛋白质亚单元是正常膜-结合蛋白质的可溶性形式，如本领域已知的那样制备，例如通过跨膜结构域和细胞质结构域的缺失。

对于I类蛋白质，可溶性形式将包含α1、α2和α3结构域。可溶性II类亚单元将包含α亚单元的α1结构域和α2结构域，以及β亚单元的β1结构域和β2结构域。

α亚单元和β亚单元可以分别产生，并在体外结合形成稳定的异源双链复合物，或两种亚基都可以在单细胞中表达。用于产生MHC亚单元的方法在本领域中是已知的。

为了制备MHC-肽复合物，亚单元可以与抗原肽结合，并允许在体外折叠形成稳定的具有链内二硫键结合结构域的异二聚体复合物。肽可以包含在最初的折叠反应中，或可以在稍后的步骤中添加到空的异二聚体中。在本发明的方法中，这将是现有的肽。允许亚单元和肽折叠和结合的条件是本领域已知的。作为一个实例，可以在尿素溶液中混合大致等摩尔量的溶解的α亚单元和β亚单元。通过稀释或透析至不含尿素的缓冲溶液中开始重折叠。肽可以在约pH 5至5.5下装载至空的II类异二聚体中约1至3天，然后进行中和、浓缩和缓冲液交换。然而，具体的折叠条件对于本发明的实施并不重要。

单体复合物(α-β-P)(此处为单体)可以被多聚体化。所得到的多聚体将在长时间内保持稳定。优选地，多聚体可以通过本领域已知的α或β亚单元上的特定附着位点将单体结合至多价实体上而形成(例如，如美国专利第5,635,363号中所描述的)。单体或多聚体形式的MHC蛋白质也可以与珠粒或任何其它载体缀合。

经常，多聚体复合物将被标记，以便当用于免疫染色或本领域已知的其它方法时可直接检测，或将与特异性结合复合物的二级标记免疫试剂结合使用，如本领域已知的和本文所描述的。例如，标记可以是荧光团，如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、德克萨斯红、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、亮紫

本文所公开的组合物可以包含任何适合的MHC蛋白质。示例性MHC蛋白质和此处所公开的肽包含H-2Kb单体、HLA-A*02:01单体、HLA-A*24:02单体、HLA-A*02:01四聚物、HLA-A*24:02四聚物、和H-2Kb四聚物。然而，根据例如用于预测肽对MHC等位基因的亲和力的已知技术，在选择适当的现有肽后，任何MHC等位基因可用于本文的组合物和方法中。

在本文中使用的冠词“一个和一种(a/an)”指代所述冠词的语法宾语的一个或多于一个(即至少一种)。举例而言，“要素”意指一个要素或多于一个要素。

术语“氨基酸”旨在包含所有分子，无论是天然的还是合成的，其包含氨基官能团和酸官能团，并且能够包含在天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包含天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同源物；具有变异侧链的氨基酸类似物；以及任何前述的所有立体异构体。

短语“衍生自”当用于涉及重排可变区基因时，“衍生自”未重排可变区和/或未重排可变区基因区段是指将重排可变区基因的序列追溯到一组未重排可变区基因片段的能力，所述基因区段被重排以形成表达可变区的基因(在适用的情况下，考虑剪接差异和体细胞突变)。例如，经过体细胞突变的重排可变区基因仍然来自未重排可变区基因区段。在一些实施例中，当内源基因座被通用轻链或重链基因座取代时，术语“衍生自”指示将序列的起源追溯至所述重排基因座的能力，即使该序列可能已经经历了体细胞突变。

“PCR柄”是指与所有引物相同的恒定序列，其允许对本文所描述的条形码区进行PCR扩增。

术语“条形码区域”是指包括独特核苷酸序列的区。此核苷酸序列的最小长度取决于需要唯一标记的MHC多聚体的总数。例如，4个核苷酸长的核苷酸序列可以有256个不同的序列，其可以唯一地标记多达256个MHC多聚体。6个核苷酸长的核苷酸序列可以有4096个不同的序列，可以唯一地标记多达4096个MHC多聚体。较长的四聚物序列可以用于增加的通量。

术语“互补”是指两条核酸链的区之间或同一条核酸链的两个区之间序列互补的广义概念。众所周知，第一核酸区的腺嘌呤残基能够与第二核酸区的残基形成特定的氢键(“碱基配对”)，如果该残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则该残基与第一区反平行。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与第二核酸链的残基碱基配对，如果该残基是鸟嘌呤，则第二核酸链的残基与第一链反平行。如果当两个区以反平行方式排列时，第一区的至少一种核苷酸残基能够与第二区的残基碱基配对，则核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区互补。优选地，第一区包括第一部分，并且第二区包括第二部分，由此，当第一部分和第二部分以反平行方式排列时，第一部分的至少约50％，并且优选地至少约75％、至少约90％、或至少约95％的核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基能够与第二部分的核苷酸残基碱基配对。

实施例1，一种多聚体主要组织相容性复合物(MHC)，包括：

一个或多个MHC分子，所述一个或多个MHC分子由主链分子连接；以及

至少一种核酸分子，所述至少一种核酸分子连接至所述主链，其中所述核酸分子包括核酸(条形码区)的中央拉伸；和核酸的第二拉伸，其具有显示与靶寡核苷酸互补的序列。

实施例2根据实施例1所述的多聚体MHC，其中所述至少一种核酸分子包括5’PCR柄区、中央条形码区和3’聚-A尾区，任选的，其中所述至少一种核酸分子包括5’PCR柄区、中央条形码区、唯一分子标识符(UMI)和3’聚-A尾区

实施例3根据实施例1或2所述的多聚体MHC，其中所述聚-A尾包括至少10个连续的腺嘌呤。

实施例4根据实施例1至3中任一项所述的多聚体MHC，其中如果靶寡核苷酸的匹配核苷酸是C、G或A，则聚-A尾5’端的核苷酸是G、C或T。

实施例5根据实施例1至4中任一项所述的多聚体MHC，其中所述至少一种核酸分子长度为至少10个核苷酸，任选的，其中所述至少一种核酸分子长度为10至200个核苷酸。

实施例6一种组合物，包括根据实施例1至5中任一项所述的多聚体MHC的多个子集，其中多聚体MHC的每个子集结合不同的肽并具有对应的条形码区序列。

实施例7一种将特定MHC分子与对应的T细胞转录组连接的方法，包括：

a)形成测试样品，所述测试样品包括根据实施例1至5中任一项所述的多个MHC分子、T细胞，和颗粒，所述颗粒与互补靶寡核苷酸连接，所述互补靶寡核苷酸包括5’PCR柄、中央细胞条形码、UMI和3’聚-(dT)；

b)由所述测试样品形成液滴，使得每个液滴包含不多于一个的颗粒，并且一个T细胞与所述一个或多个多聚体MHC分子结合；

c)在每个液滴中生成T细胞cDNA文库和MHC条形码文库；并且

d)对所述T细胞mRNA文库和所述MCH条形码文库两者进行测序，由此将特定的MHC分子与所述对应的T细胞转录组连接。

实施例8一种多聚体MHC，包括：

一个或多个MHC分子，所述一个或多个MHC分子由主链分子连接；以及

至少一种核酸分子，所述至少一种核酸分子连接至所述主链，其中所述核酸分子包括核酸(条形码区)的中央拉伸；和核苷酸序列，所述核苷酸序列与TCR恒定基因互补。

实施例9根据实施例8所述的多聚体MHC，包括第一类型的核酸分子，将所述第一类型的核酸分子连接至所述主链；并且其中所述第一类型的核酸分子包括中央条形码区和与TCRα或TCRβ恒定基因互补的核苷酸序列。

实施例10根据实施例8所述的多聚体MHC，包括连接至所述主链的第一和第二类型的核酸分子；并且其中：

所述第一类型的核酸分子包括中央条形码区和与TCRα恒定基因互补的核苷酸序列；

所述第二类型的核酸分子包括中央条形码区和与TCRβ恒定基因互补的核苷酸序列；并且

所述两种类型的所述核酸分子的所述条形码区具有相同的序列；

任选地，其中每种类型的核酸分子进一步包括UMI，并且第一种类型的核酸分子的UMI序列不同于第二种类型的核酸分子的UMI序列。

实施例11根据实施例8至10中任一项所述的多聚体MHC，其中所述核酸分子包括5’PCR柄、中央条形码区、和与TCR恒定基因互补的3’核苷酸序列。

实施例12根据实施例8至11中任一项所述的多聚体MHC，其中所述核酸分子包括与所述TCR恒定基因的5’端互补的核苷酸序列。

实施例13根据实施例8至12中任一项所述的多聚体MHC，其中所述TCR恒定基因是TCRα恒定基因、TCRβ恒定1基因或TCRβ恒定2基因。

实施例14根据实施例8至13中任一项所述的多聚体MHC，其中所述5’端核酸分子和/或3’端核酸分子与所述主链分子连接。

实施例15根据实施例8至14中任一项所述的多聚体MHC，其中所述核酸分子进一步包括邻近于所述条形码区的唯一分子标识符(UMI)。

实施例16根据实施例8至15中任一项所述的多聚体MHC，其中所述至少一种核酸分子长度为至少10个核苷酸，任选的，其中所述至少一种核酸分子长度为10至200个核苷酸。

实施例17一种组合物，包括根据实施例8至16中任一项所述的多聚体pMHC的多个子集，其中多聚体MHC的每个子集结合不同的肽并具有对应的条形码区序列。

实施例18一种将特定MHC分子连接至对应的TCRα序列和/或TCRβ序列的方法，包括：

a)提供根据实施例8至16中任一项所述的一种或多种多聚体主要组织相容性复合物；

b)将所述多聚体MHC分子与T细胞接触；

c)将与所述多聚体MHC分子结合的T细胞和不与所述多聚体MHC分子结合的那些T细胞分离；

d)裂解所述已分离的T细胞；

e)生成DNA文库，其中每个DNA分子包括TCRα和/或TCRβ基因的序列以及MHC条形码；并且

f)对所述DNA文库进行测序，由此将所述特异性MHC分子与所述对应的TCRα序列和/或TCRβ序列连接。

实施例19根据实施例18所述的方法，其中所述步骤)通过FACS分选或基于磁珠的分离来完成。

实施例20根据实施例18或19所述的方法，其中所述多聚体MHC分子被直接或间接荧光标记。

实施例21根据实施例18至20中任一项所述的方法，其中结合有条形码的MHC分子的T细胞在单个收集管中被大量分选。

实施例22，根据实施例18至30中任一项所述的方法，其中结合有条形码的MHC分子的同源T细胞被分选至单独的板以及单个细胞中。

实施例23一种多聚体MHC，包括

两种或更多种MHC分子，所述两种或更多种MHC分子由主链分子连接；以及

至少一种核酸分子，所述至少一种核酸分子连接至所述主链，其中所述核酸分子包括核酸(条形码区)的中央拉伸；和模板切换寡核苷酸序列。

实施例24，根据实施例23所述的多聚体MHC，其中所述核酸分子包括5’PCR柄、中央条形码区、UMI和3’模板切换寡核苷酸序列。

实施例25根据实施例23或24所述的多聚体MHC，其中所述模板切换寡核苷酸序列包括3核糖鸟苷的3’拉伸。

实施例26根据实施例23至25中任一项所述的多聚体MHC，其中所述至少一种核酸分子长度为至少10个核苷酸，任选的，其中所述至少一种核酸分子长度为10至200个核苷酸。

实施例27一种组合物，包括根据实施例23至26中任一项所述的多聚体MHC的多个子集，其中多聚体MHC的每个子集结合不同的肽并具有对应的条形码区序列。

实施例28一种将特定MHC分子连接至对应的TCRα序列和/或TCRβ序列的方法，包括：

a)形成测试样品，所述测试样品包括根据实施例23至26中任一项所述的多个多聚体MHC分子、T细胞，和珠粒，所述珠粒与寡核苷酸缀合，所述寡核苷酸包括5’PCR柄、中央细胞条形码、UMI和与TCR恒定基因互补的3’核苷酸序列；

b)由所述测试样品形成液滴，使得每个液滴包含不多于一个的珠粒，并且一个T细胞与所述一个或多个多聚体MHC分子结合；

c)生成DNA文库，其中每个DNA分子包括TCRα和/或TCRβ基因的序列以及MHC条形码；并且

d)对所述DNA文库进行测序，由此将特异性MHC分子与所述对应的TCRα序列和/或TCRβ序列连接。

实施例29根据实施例28所述的方法，其中所述珠粒选自水凝胶珠粒、硬珠粒和可溶解珠粒。

实施例30根据实施例28或29所述的方法，其中所述珠粒与两个寡核苷酸缀合，其中所述第一寡核苷酸包括5’PCR柄、中央细胞条形码、UMI和与TCRα恒定基因互补的3’核苷酸序列；所述第二寡核苷酸包括5’PCR柄、中央细胞条形码、UMI和与TCRβ恒定基因互补的3’核苷酸序列；并且用于所述两种寡核苷酸的所述中央细胞条形码具有相同的序列。

实施例31根据实施例28至30中任一项所述的方法，其中所述DNA文库生成步骤c)包括使用MMLV逆转录酶对TCR mRNA进行逆转录。

实施例32根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述PCR柄使得能够制备所述条形码序列的所述文库。

实施例33根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述PCR柄具有i7衔接子序列。

实施例34根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述条形码区包括至少4个核苷酸。

实施例35根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述条形码区包括6个核苷酸。

实施例36根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中主链分子选自由以下项组成的组：多糖、葡聚糖、葡聚糖、链霉亲和素和链霉亲和素多聚体。

实施例37根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述MHC分子经由链霉亲和素-生物素结合、经由MHC重链或经由MHC轻链(β2M)连接至所述主链。

实施例38根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述MHC分子经由链霉亲和素-生物素结合连接至所述主链。

实施例39根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述多聚体MHC包括至少四种MHC分子。

实施例40根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述至少一种核酸分子进一步包括化学修饰。

实施例41根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述至少一种核酸分子的5’或3’端经由隔离序列被附接至氨基。

实施例42根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述隔离序列是6-碳隔离序列或12-碳隔离序列。

实施例43根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述至少一种核酸分子包括所述5’端和/或3’端处的硫代磷酸酯核甘酸。

实施例44根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述至少一种核酸分子与所述主链分子之间的连接允许所述核酸分子的诱导型解离。

实施例45根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述至少一种核酸分子经由可裂解桥连接至所述主链分子。

实施例46根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述二硫键是通过将琥珀酰亚胺基-6-肼基-烟酰胺(S-HyNic)修饰的主链分子与琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺类似物(S-SS-4FB)修饰的5’-氨基修饰的核酸分子结合而形成的。

实施例47根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述至少一种核酸分子经由可光裂解的键连接至所述主链分子。

实施例48根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述MHC分子是MHC I类和/或MHC II类单体。

实施例49根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述MHC分子与肽复合。

实施例50根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述MHC分子是生物素化的。

实施例51根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述主链进一步包括选自由以下项组成的组的一种或多种标签：荧光标签、His标记和金属离子标记。

实施例52根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述主链直接与所述荧光标签缀合。

实施例53根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述荧光标记用4FB修饰并与S-HyNic修饰的主链缀合。

实施例54根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述荧光标签是荧光团标记的寡核苷酸。

实施例55根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述荧光团标记的寡核苷酸具有5’-氨基或3’-氨基修饰，并进一步用4FB修饰，并与S-HyNic修饰的主链缀合。

实施例56根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述荧光团标记的寡核苷酸与连接至所述主链的所述核酸分子互补。

实施例57根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述荧光团标记的寡核苷酸长度为10个核苷酸。

实施例58根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述主链用荧光团标记的抗-链霉亲和素抗体标记。

实施例59根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述荧光团是荧光染料或量子点。

实施例60根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述至少一种核酸分子包括选自由以下项组成的组的核酸分子：DNA、RNA、人工核苷酸、PNA和LNA。

实施例61根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述多聚体MHC结合同源T细胞。

实施例62根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述多聚体MHC与流式细胞术应用相容。

实施例63根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述流式细胞术应用是单细胞或大量细胞荧光活化细胞分选(FACS)。

实施例64根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述多聚体MHC与基于NGS的应用相容。

实施例65根据前述实施例中任一项所述的多聚体MHC或方法，其中所述基于NGS的应用是基于液滴的单细胞测序。

实施例66一种用于检测样品中抗原应答细胞的方法，包括：

a)提供根据实施例1至13、8至25、32至35和41至70中任一项所述的一种或多种多聚体主要组织相容性复合物；

b)将所述多聚体MHC分子与所述样品接触；以及

c)检测所述多聚体MHC分子与所述抗原应答细胞的结合，由此检测对所述MHC分子中存在的抗原进行应答的细胞，其中所述结合是通过扩增通过所述主链分子与所述一个或多个MHC分子连接的核酸分子的条形码区来检测的。

实施例67根据实施例66所述的方法，其中所述样品选自由以下项组成的组：血液样品、外周血液样品、血液衍生样品、组织样品、体液、脊髓液和唾液。

实施例68根据实施例66或67所述的方法，其中所述样品从哺乳动物获得。

实施例69根据实施例66至68中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过选自由以下项组成的组的方法：流式细胞术、FACS、基于磁珠的选择、尺寸排阻、梯度离心、柱附着和凝胶过滤进行细胞选择。

实施例70根据实施例66至69中任一项所述的方法，其中所述扩增是PCR。

实施例71根据实施例66至70中任一项所述的方法，其中所述核酸分子的所述条形码区的所述检测包含对所述条形码区进行测序或通过qPCR检测所述条形码区。

现在概括地描述本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例仅仅是为了说明本发明的某些方面和实施例，而不是为了限制本发明。

以下描述了由任何序列组成的寡核苷酸的共价和非共价缀合。对于共价缀合，寡核苷酸(例如，在图1中)1)通过硫醚键的形成与链霉亲和素缀合，尽管也可以使用其它化学物质和键的形成。在此特定情况下，共价键将寡和链霉亲和素连接至共同的异双功能连接子上，产生链霉亲和素-寡核苷酸缀合物(图5)。与链霉亲和素非共价缀合的寡核苷酸可以通过将生物素化的寡核苷酸与链霉亲和素以最佳比率混合，并通过HPLC纯化所期望的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物来完成(图5和图9)。共价和非共价衍生的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物可以随后进行pMHC多聚化(图5)。这些pMHC多聚体种类可以以不同的组合用于pMHC-TCR亲和力研究(如图1中所描述的)。另外，如果已知靶pMHC-TCR亲和力足够高，使得每个链霉亲和素3至4个单体之间的差异不会影响TCR检测，则单亚型的pMHC多聚体(例如，仅pMHC三聚物)可以单独用于大量或单细胞测序平台。仅使用非共价衍生的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物的优点是放弃化学缀合以及每个链霉亲和素使用更少单体的成本节约。

作为另一个实例，可以使用具有补充的S-SS-4FB的可溶性蛋白质-寡核苷酸缀合试剂盒。链霉亲和素最先用S-HyNic修饰。5’-氨基修饰寡核苷酸用S-SS-4FB修饰。然后将已修饰的寡核苷酸和已修饰的链霉亲和素结合，产生直接条形码的链霉亲和素(图2)。可以使用可选的缀合化学方法和材料提供者，其将条形码寡核苷酸缀合至蛋白质，并允许可诱导的条形码寡核苷酸解离，包含但不限于可光裂解的键。实验证实了在还原条件下从链霉亲和素中暂时分离寡核苷酸的能力(图3)，以及条形码链霉亲和素结合生物素的能力(图4)。

条形码四聚物可以与各种荧光标记策略相结合(图6A至图6C)以用于单细胞应用和大量细胞分选应用。

条形码pMHC多聚体可以使用所描述的相同缀合化学对TCRα恒定基因和/或TCRβ恒定基因靶向(图17)。此公开内容有益于仅对获取TCR序列和匹配pMHC信息感兴趣的科学家。此方法的主要优点是仅需要一个文库制备，因为反向转录TCRα序列和/或TCRβ序列均包含pMHC多聚体条形码。因此，单测序读数将包含TCR序列和pMHC标识信息。这与聚-A尾或其它基于捕获序列的文库制备方法形成对比，其中较小的pMHC条形码/抗体条形码文库被单独处理，并且稍后在测序

在另一实施例中，可以制备条形码pMHC多聚体，使得pMHC多聚体-缀合寡核苷酸包含模板切换寡核苷酸序列以及pMHC多聚体条形码序列和PCR柄序列(图23)。关键是切换寡核苷酸序列包含3’拉伸的3个核糖鸟苷来结合由MMLV逆转录酶添加的脱氧胞苷。在此情况下，基于液滴的珠粒(包含但不限于水凝胶珠粒、硬珠粒或可溶解珠粒)将与具有典型细胞条形码和PCR柄序列的TCRα和/或TCRβ恒定基因互补寡核苷酸定制缀合。UMI可以包含在任何寡核苷酸序列中，用于PCR重复数据消除。具有TCRα靶向寡核苷酸和TCRβ靶向寡核苷酸的珠粒对于给定的珠粒将包含相同的条形码。在包含珠粒和pMHC多聚体阳性T细胞两者的单液滴中，用MMLV逆转录酶的逆转录将延伸基于珠粒的寡聚核苷酸，该寡聚核苷酸具有来自TCR mRNA的V(D)J序列，以及包含包含pMHC多聚体条形码和PCR柄的模板切换寡聚核苷酸序列。随后的二级链合成和PCR扩增将完成用于测序的文库制备。用于珠粒寡核苷酸和pMHC多聚体条形码/模板切换寡核苷酸两者的寡核苷酸序列、长度和修饰(包含但不限于使用锁定的核酸碱基)可以改变。此实施例可以与其它逆转录酶衍生物相容。

此系统具有若干关键优点。一种是仅获得了TCR序列和pMHC条形码序列，不需要对整个转录组进行测序。另一个优点是仅需要一个文库制备，因为四聚物条形码序列和TCR序列在同一转录物上。另一个优点是，如果同时使用TCRα珠粒寡核苷酸和TCRβ珠粒寡核苷酸两者，那么由于每个液滴内独特的细胞条形码序列，两者会自动配对。最后，因为只有pMHC多聚体阳性T细胞具有模板切换/pMHC多聚体条形码寡核苷酸，该寡核苷酸包含两个PCR柄之一，所以仅pMHC多聚体阳性T细胞有助于测序文库。

本文提到的所有出版物、专利和专利申请均通过全文引用的方式结合在此，其程度就如同明确且单独地指明了每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用结合。在冲突的情况下，以本申请(包含本文中的任何定义)为准。

1.Bentzen,A.K.等人,“使用标记有DNA条形码的肽-MHC-I多聚体大规模检测抗原特异性T细胞(Large-scale detection of antigen-specific T cells using peptide-MHC-I multimers labeled with DNA barcodes)”,《自然生物技术(Nat Biotechnol)》,2016,34(10):p.1037-1045。

2.Stoeckius,M.等人“单细胞中同时测定表位和转录组(Simultaneous epitopeand transcriptome measurement in single cells)”,《自然方法(Nat Methods)》,2017,14(9):p.865-868。

3.Peterson,V.M.等人,“单细胞中蛋白质和转录物的多重定量(Multiplexedquantification of proteins and transcripts in single cells)”,《自然生物技术》,2017,35(10):p.936-939。

4.Zhang,S.Q.等人,“单细胞中T细胞受体抗原特异性的高通量测定(High-throughput determination of the antigen specificities of T cell receptors insingle cells)”,《自然生物技术》,2018,

5.Dahotre,S.N.等人,“由数字PCR检测单抗原特异性T细胞的pMHC四聚物(DNA-Barcoded pMHC Tetramers for Detection of Single Antigen-Specific T Cells byDigital PCR)”,《分析化学(Anal Chem)》,2019,91(4):p.2695-2700。

6.Altman,J.D.和M.M.Davis,“MHC肽四聚物以使抗原特异性T细胞可视化(MHC-Peptide Tetramers to Visualize Antigen-Specific T Cells)”,《当代医学免疫(CurrProtoc Immuno)》,2016,115:p.17 3 1-17 3 44。

7.Krogsgaard,M.AAI 2019,《摘要》194.58。

8.Krummey,S.M.等人,“低亲和力记忆CD8+T细胞介导稳健的异源免疫(Low-Affinity Memory CD8+ T Cells Mediate Robust Heterologous Immunity)”,《免疫学期刊(J Immunol)》,2016,196(6):p.2838-46。

9.Zhou,Z.X.等人,“通过单链-DNA兼容和链特异性芯片-序列方法映射DNA损伤的基因组热点(Mapping genomic hotspots of DNA damage by a single-strand-DNA-compatible and strand-specific ChIP-seq method)”,《基因组研究(Genome Res)》,2013,23(4):p.705-15。

仅使用常规实验，所属领域的技术人员将认识到或者能够确定本文描述的本发明所涵盖的具体实施例的许多等效物。这些等效物旨在被以下权利要求所涵盖。