蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖在制备免疫抗肿瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖在制备免疫抗肿瘤药物中的应用。蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII可以显著抑制肝癌细胞的增殖和转移，改善荷瘤小鼠血清中IgA、IgG和IgM水平，影响荷瘤小鼠肿瘤组织中血管生成相关因子、白细胞介素、趋化因子等的表达，具有显著的免疫抗肿瘤活性；蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖为食源性真菌多糖，安全可靠。本发明为蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII在免疫抗肿瘤药物中的开发应用提供了理论基础，具有显著的临床应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces Hepiali)发酵菌丝体多糖在制备免疫抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肝细胞癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。2019年国家癌症中心发布的最新一期的全国癌症统计数据显示，2015年我国肝癌新发病例37.0万例，发病率为26.92/10万，中标率为17.64/10万，其发病占全部恶性肿瘤发病的9.42％，位居第四位；死亡率占全部恶性肿瘤死亡的13.94％。肝癌死亡率占比相较发病率占比出现明显提高，是死亡率仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤。肝癌不仅危害居民健康，还给家庭、社会和国家带来沉重的经济负担，已成为一个亟待解决的公共卫生问题。

手术、化疗和放疗是目前肝癌治疗的有效手段。手术和放疗属于局部治疗，对于潜在的转移病灶和已经发生临床转移的癌症难以发挥疗效。放疗和化疗过程中不可避免的伴随有毒副作用，如恶心、脱发及肝肾功能损害等。随着科学技术的发展，生物治疗逐渐活跃于科研工作者和大众视野。2018年，James P.Allison与Tasuku Honjo教授因发现抑制免疫负调节的新型癌症治疗方法获得诺贝尔生理学和医学奖。沃伦·阿尔珀特奖获得者陈列平教授根据肿瘤免疫逃逸机制，提出“免疫正常化(Immune normalization)”理论，靶向肿瘤微环境，治疗效果更加有效且毒性更低。这一系列成果充分体现了基于免疫学策略在治疗肿瘤方面取得的重大进展，也预示着肿瘤免疫生物治疗的巨大前景。

真菌多糖是真菌子实体及发酵菌丝体中重要的活性成分，具有抗氧化、提高免疫力等多种功效。在过去的两个世纪，真菌多糖制品已经被广泛应用于卫生保健系统，其常与放、化疗和生物治疗联合使用，协同调节机体免疫功能，抑制肿瘤发生与发展。因此，科研工作者期望能够以此为契机发现更加安全有效的抗肝癌药物，与现有治疗药物形成补充，为提高癌症病人生存期和生活质量提供一种新的可能，具有重要的社会和经济意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖在制备免疫抗肿瘤药物中的应用。蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖能够有效抑制肝癌细胞的增殖和转移，调节荷瘤小鼠血清中IgA、IgG和IgM水平，影响肿瘤组织中血管生成相关因子、白细胞介素、趋化因子等的表达，具有显著的免疫抗肿瘤活性。

本发明采用的技术方案是：蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖在制备免疫抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖的制备方法包括如下步骤：取蝙蝠蛾拟青霉菌粉，在80℃的双蒸水中提取4小时，离心获得上清液，浓缩后，用三氯乙酸法除蛋白，之后采用90％乙醇沉淀过夜，收集析出物；将析出物溶于超纯水中，大孔树脂除盐后，采用DEAE-52离子交换层析纯化，分别用超纯水和0.5mol/l NaCl溶液进行洗脱，收集NaCl洗脱峰，透析除盐，减压浓缩后，冷冻干燥，所得产物进一步采用G-100凝胶柱层析纯化，超纯水洗脱，收集洗脱峰Ⅱ，减压浓缩，冷冻干燥，得蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖(PHsgII)。

进一步的，所述蝙蝠蛾拟青霉菌粉的制备方法，包括如下步骤：将保藏号为CCTCCNO：M 2014670的蝙蝠蛾拟青霉菌株PH40，采用液体培养基进行发酵培养，收集发酵菌丝体，采用冻干机冻干后，得蝙蝠蛾拟青霉菌粉。

进一步的，所述液体培养基的组成为：蔗糖25g/L，酵母浸粉20g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.25g/L，硫酸镁0.25g/L，维生素B1 0.01g/L，氯化锌0.003g/L，水余量。

进一步的，本发明所指肿瘤选自肝癌。

进一步的，蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖的剂量为10-100mg/kg/day。

本发明的有益效果是：

1、蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖，可以显著增强免疫抑制小鼠血浆T细胞介导的迟发型超敏反应，提高NK细胞活性和脾淋巴细胞向淋巴母细胞的转化能力；抑制肝癌细胞的增殖和转移，改善诱导型肝癌小鼠血清中IgA、IgG和IgM水平，影响诱导型肝癌小鼠肿瘤组织中血管生成相关因子、白细胞介素、趋化因子的表达，具有显著的免疫抗肿瘤活性。

2、蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖，以药食同源的真菌的发酵菌丝体为原料制备获得，是一种天然多糖成分，具有低毒性、高安全性、高药理活性的特点。

附图说明

图1是蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII的高效液相色谱图。

图2是蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII的刚果红染色结果图。

图3是蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII的电镜照片。

图4是划痕实验检测蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖抑制肿瘤细胞迁移能力图。

图5是PHsgII治疗后对荷瘤小鼠肿瘤体积的影响。

图6是PHsgII治疗后对荷瘤小鼠体重的影响

具体实施方式

为了能够更好地了解本发明的技术内容，下面通过具体实施例对本发明进行详细描述。

实施例1蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖的制备

1、蝙蝠蛾拟青霉菌粉的制备

取保藏号为CCTCC NO：M 2014670的蝙蝠蛾拟青霉菌株PH40，采用液体培养基(蔗糖25g/L，酵母浸粉20g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾0.25g/L，硫酸镁0.25g/L，维生素B10.01g/L，氯化锌0.003g/L，水余量)，于26℃下进行发酵培养5-7天，收集发酵菌丝体，采用冻干机冻干后，得蝙蝠蛾拟青霉菌粉。

2、蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖的制备：

按固液比1g：40mL的比例，取蝙蝠蛾拟青霉菌粉和双蒸水。将蝙蝠蛾拟青霉菌粉在80℃的双蒸水中提取4小时，离心获得上清液，浓缩后，用三氯乙酸法除蛋白，之后采用90％乙醇沉淀过夜，收集析出物；将析出物溶于超纯水中，大孔树脂除盐后，采用DEAE-52离子交换层析纯化，分别用超纯水和0.5mol/l NaCl溶液进行洗脱，收集NaCl洗脱峰，透析除盐，减压浓缩后，冷冻干燥，所得产物进一步采用G-100凝胶柱层析纯化，超纯水洗脱，收集洗脱峰Ⅱ，减压浓缩，冷冻干燥，得蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖(PHsgII)。

图1为蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII的高效液相色谱图，结果显示，蝙蝠蛾拟青霉多糖PHsgII为单一色谱峰，出峰时间为22.414min，证明蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII为均一多糖。

图2为蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII刚果红实验结果，采用5mg蝙蝠蛾拟青霉菌丝体多糖，2ml去离子水溶解后，加入2ml 80umol/l的刚果红试剂，逐渐加入NaOH溶液，使NaOH终浓度由0mo/l逐渐升高至0.5mol/l，并测定其最大吸收波长。结果显示，与对照组相比，蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII与刚果红形成络合物的最大吸收波长发生明显红移，表明样品能与刚果红形成络合物，即样品中有规则的螺旋构象。

图3为蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖PHsgII的电镜照片，扩大倍率为50000倍。

实施例2蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖在免疫治疗中的应用

方法：8周龄balb/c小鼠，适应性喂养一周后，采用腹腔注射80mg/kg环磷酰胺(CTX)方法建立免疫抑制小鼠模型。建模小鼠随机分成4组，每组10只，分别模型组，低剂量组(10mg/kg/day)、中剂量组(30mg/kg/day)和高剂量组(90mg/kg/day)，连续灌胃给药4周，模型组灌胃给与生理盐水溶液同周龄健康小鼠作为空白组对照，处理4周后，进行检测。结果如表1。

表1蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖在免疫治疗中的应用

由表1可见，PHsgII有效缓解CTX引起的免疫抑制小鼠体重、胸腺和脾脏指数的降低；增强T细胞介导的迟发型超敏反应，提高免疫抑制小鼠NK细胞活性和脾淋巴细胞向淋巴母细胞的转化能力。

由表1可见，抗原刺激的T细胞转化为浆母细胞，然后分化为浆细胞，浆细胞分泌免疫球蛋白来调节免疫反应。IgG抗体可能附着在巨噬细胞和NK细胞的Fc受体上，以改变NK细胞和巨噬细胞的功能，且IgM可激活补体系统。PHsgII可显著升高血清中IgA、IgG和IgM水平，增强免疫抑制小鼠的体液免疫应答。

白细胞介素(ILs)和干扰素(IFNs)可促进B淋巴细胞的增殖分化，调节NK细胞的细胞毒性。CTX可抑制ILs和IFNs的水平，从而导致免疫细胞功能的深度抑制。PHsgII可通过上调ILs和IFNs水平表明其免疫增强活性。结果展示出PHsgII对环磷酰胺引起的免疫功能抑制小鼠的保护作用，印证了其免疫增强效果。

实施例3蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖在肿瘤治疗中的应用(一)蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖抑制肿瘤细胞增殖

方法：无限增殖是肿瘤细胞最重要的特征之一，将人肝癌细胞(HepG2及Huh7细胞)接种于96孔板内，分别采用50和100μg/ml PHsgII处理细胞0天、2天、4天、6天。在不同处理时间点结束培养后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜，置于摇床上低温振荡10min，在多功能酶标仪上进行定量分析，以评价细胞生长增殖情况。

结果显示，与对照组相比，50和100μg/ml PHsgII处理HepG2及Huh7细胞的第4天，这两组吸光度值显著降低(P<0.05)；处理HepG2及Huh7细胞6天后，100μg/ml PHsgII组吸光度值相比于对照组分别降低了65.2％和76.3％，表明PHsgII能够显著抑制人肝癌细胞增殖。

(二)蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖抑制肿瘤细胞迁移

方法：划痕实验是用于检测细胞迁移能力的经典方法。将HepG2细胞接种至6孔板中，细胞生长至铺满板底后，利用枪头垂直于孔板制造划痕，并尽量保证划痕宽度的一致性，利用50和100μg/ml PHsgII分别处理HepG2细胞36小时，经倒置显微镜拍照收集数据。结果如图4。

由图4可见，肝癌细胞会向划痕的空白处迁移，因此划痕的愈合速度与细胞的迁移能力呈正相关。与空白组相比，50和100μg/ml PHsgII能够显著抑制HepG2细胞划痕愈合速度，表明其具有抗肝癌细胞迁移的作用。

(三)蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体多糖抑制荷瘤小鼠免疫因子表达

方法：将培养至对数生长期的HepG2细胞注射接种在无胸腺裸鼠大腿外侧表皮下，建立荷瘤小鼠模型。待肿瘤直径至2～3mm时，随机分为2组，分别为空白组和PHsgII(50mg/kg/day)剂量组。连续灌胃给药17天，期间每2天检测一次体重和肿瘤体积。结果如图5和图6。

由图5和图6可见，与空白组相比，从第13天开始，PHsgII能够显著抑制肿瘤体积，且对荷瘤小鼠体重无显著影响。

前述结果表明，首先，PHsgII对环磷酰胺引起的免疫功能抑制小鼠的保护作用，印证了其免疫增强效果；其次，PHsgII在肝癌细胞系和荷瘤小鼠模型的基础上展现出良好的抗肿瘤活性。