一种预防蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷流失的方法

摘要

本发明公开了一种预防蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷流失的方法，包括菌种活化、种子液的制备、发酵罐发酵和提取步骤，所述发酵步骤采用的发酵培养基为：黄豆饼粉20g‑25g/L，葡萄糖10g‑15g/L，蔗糖10g‑15g/L，磷酸二氢钾0.3‑0.5g/L，MgSO4·7H2O0.2g‑0.4g/L，无水氯化钙0.25g/L，豆油0.4g/L，生物素1‑2g/T，余量为水。本发明在蝙蝠蛾拟青霉发酵培养基中添加一定量的不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰辅酶A的辅酶生物素，增强蝙蝠蛾拟青霉菌细胞膜的厚度，不仅可以防止蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中腺苷的流失，还能提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量。

说明书

技术领域

本发明属于食品保健品微生物技术领域，涉及一种增加蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷含量的方法。

背景技术

冬虫夏草是多种寄生真菌生长在虫体之上的复合体；在我国主要分布在西藏地区，此外在云南、四川、甘肃、新疆也有分布；是一种珍贵的食药用真菌。其体内不仅含有丰富的营养物质，还含有能够对人体多种疾病有预防和治疗功效的功能性成分；比如核苷类、甾醇类、蝙蝠蛾拟青霉素类等。但由于生长条件等影响，冬虫夏草产量极低，在市场上供不应求。

腺苷是冬虫夏草中主要的功能性成分，它做为一种内源性核苷广泛分布在人体之中，对人体的许多系统和组织都具有重要的生理学功能。腺苷可通过核苷类物质的代谢途径参与到人体的免疫和代谢系统之中，对心血管疾病、慢性支气管炎、肝硬化、高血脂等疾病有显著的预防和治疗功效，同时腺苷也是蝙蝠蛾拟青霉类产品质量评价的一项重要指标。

蝙蝠蛾拟青霉是一株从冬虫夏草中分离出来的寄生真菌，利用蝙蝠蛾拟青霉菌株通过深层液态发酵法产生的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中含有与冬虫夏草一致的功能性成分，其优势在于能够人工控制产生大量的菌丝体，同时菌丝体做为蝙蝠蛾拟青霉的初始形态，其多种功能性成分的含量高于子实体。此外，蝙蝠蛾拟青霉菌丝体中的腺苷含量也是考察蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉质量水平主要指标之一(中国药典规定腺苷含量≥0.2％为合格蝙蝠蛾拟青霉菌粉)。

生物素又名维生素H、辅酶R等，生物素为无色的针状结晶，极易溶于水，微溶于冷水，能溶于乙醇，但不溶于有机溶剂。对热稳定，强酸、强碱和氧化剂可使其破坏，紫外线也可使其逐渐破坏。生物素的主要功能是在脱羧、羧化反应和脱氢化反应中起辅酶作用，可以把CO

发明内容

本发明所要解决的技术问题是固化现有产品的质量水平，提供一种预防蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷流失的方法。本发明在发酵培养基中添加不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰辅酶A的辅酶生物素，能增强细胞膜的厚度，不仅可以防止蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中的腺苷的流失，还能提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种预防蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷流失的方法，包括菌种活化、种子液的制备、发酵罐发酵和提取步骤，所述发酵步骤采用的发酵培养基为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L， MgSO

优选所述的菌种活化为将蝙蝠蛾拟青霉菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子。优选斜面培养基组成为:麸皮50g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨2g/L,KH

优选种子液的制备为将活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液。

优选种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，黄豆饼粉20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1g/L，MgSO

优选采用的发酵罐发酵为：以发酵培养基体积计，将种子液按照10％接种量接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时。优选所述发酵培养基的pH是使用1～4mol/L磷酸、氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节的。

优选提取步骤为：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至10％以下，最后进行粉碎制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。

上述干燥指的是依次利用螺带干燥、热风真空烘干和沸腾干燥完成。

优选蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉制粒是利用40-80目不锈钢筛网。

本发明采用的蝙蝠蛾拟青霉菌株，分类命名为蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyceshepiali，该菌株已于2020年10月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.20758；

上述预防蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷流失的方法，具体可以包括以下步骤：

(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌株接种在斜面培养基上，于18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；

(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；

(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2) 中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；

所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖 10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO

(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至 10％以下，最后进行粉碎制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。

与现有技术比较本发明的有益效果：本发明在发酵培养基中添加了生物素，借鉴原核生物谷氨酸棒状杆菌的反向代谢理论(谷氨酸发酵过程中，筛选的生物素缺陷型菌株可以增加细胞膜的通透性，使谷氨酸快速从胞内运送至胞外)；验证真菌是否可以通过添加生物素增加细胞膜的厚度，降低细胞膜的透过性；从而预防胞内腺苷的流失。同时设置了生物素的添加浓度，能够全面了解生物素的不同浓度是否能够预防腺苷的流失，排除实施例偶然性，获得准确的实施结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种预防蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷流失的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于 18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；

所述蝙蝠蛾拟青霉菌株，分类命名为蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali，该菌株已于2020年10月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No.20758；

(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；

(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2) 中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；

所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖 10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO

(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥 20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至 10％以下，最后进行粉碎制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。

实施例2

一种预防蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷流失的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于 18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；

所述蝙蝠蛾拟青霉菌株，分类命名为蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali，该菌株已于2020年10月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No.20758；

(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；

(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2) 中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压 0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；

所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖 10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO

(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥 20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至 10％以下，最后进行粉碎制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。

实施例3

一种预防蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷流失的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于 18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；

所述蝙蝠蛾拟青霉菌株，分类命名为蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali，该菌株已于2020年10月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No.20758；

(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；

(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2) 中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压 0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；

所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO

(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥 20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至 10％以下，最后进行粉碎制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。

对比例1

一种预防蝙蝠蛾拟青霉发酵菌丝体中腺苷流失的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：将蝙蝠蛾拟青霉菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于 18℃-26℃培养72小时，制备活化后的斜面种子；

所述蝙蝠蛾拟青霉菌株，分类命名为蝙蝠蛾拟青霉Paecilomyces hepiali，该菌株已于2020年10月29日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No.20758；

(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，26℃，摇床转速150rpm/min培养70小时至对数生长期，得到蝙蝠蛾拟青霉菌发酵的种子液；

(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，10％接种量，将步骤(2) 中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度26±1℃，罐压 0.03-0.06MPa；通风量0.3-0.5vvm；初始发酵液pH值调至6.0，培养40小时；

所述发酵培养基组分为：黄豆饼粉20g-25g/L，葡萄糖10g-15g/L，蔗糖 10g-15g/L，磷酸二氢钾0.3-0.5g/L，MgSO

(4)提取：发酵结束后板框去除滤液收集菌丝体，之后用螺带干燥机干燥 20h使水分含量降至30％以下，然后用热风真空烘箱干燥20h使水分含量降至 10％以下，最后进行粉碎制粒并利用沸腾干燥彻底烘干；制备出蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉。

实施例1，实施例2，实施例3与对比例1的放罐菌丝体实施结果如下表所示：

通过上表三组实施例和一组对比例可以看出，在发酵培养基中添加生物素，其添加浓度与蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量成正比关系；三组实施例的腺苷与甘露醇含量与对比例无显著差别。

实施例1，实施例2，实施例3与对比例1的放罐发酵液静置不同时间菌丝体中腺苷含量如下表所示：

通过上表三组实施例和一组对比例可以看出，在发酵培养基中添加生物素，可以预防因发酵液固液分离不及时而导致的菌丝体中腺苷流失，给生产运行过程中的特殊情况提供了解决办法；从而保证产品质量的稳定性。

实施例1，实施例2，实施例3与对比例1的放罐发酵液静置不同时间菌丝体中甘露醇含量如下表所示：

通过上表三组实施例和一组对比例可以看出，发酵液固液分离不及时对菌丝体中的甘露醇含量的影响较小，在发酵培养基中添加生物素，对菌丝体中的甘露醇并没有显著影响。

综合上述结论可以得出在发酵培养基中添加生物素不但可以预防因蝙蝠蛾拟青霉发酵液因固液分离不及时而导致蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉中的腺苷流失，还可以提高蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉产量。