一种TIPE3免疫组织化学检测试剂盒及其使用方法和应用

摘要

本发明提供一种TIPE3免疫组织化学检测试剂盒及其使用方法和应用，属于肿瘤检测技术领域。本发明研究发现，TIPE3在胰腺癌中表达显著升高，与肿瘤侵袭转移潜能密切相关，而且是胰腺癌患者的独立预后危险因素，因此可以通过检测TIPE3的表达来达到帮助判断胰腺癌恶性程度及患者预后的目的，从而提供一种TIPE3免疫组织化学检测试剂盒，该试剂盒可有效预测胰腺癌恶性程度和转移潜能，对胰腺癌患者进行复发转移风险分级；同时还可以评估患者预后情况，从而有助于提高胰腺癌患者的生存率，为临床上胰腺癌的防治提供重要的科学依据，因此具有良好的临床应用价值和社会效益。

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤检测技术领域，具体涉及一种TIPE3免疫组织化学检测试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

胰腺癌是恶性程度最高的消化系统肿瘤之一，其发病隐匿，进展迅速，预后极差，发病率几乎等于死亡率。据美国癌症协会(ACS)最新统计数据显示，胰腺癌的预期发病率在消化系统肿瘤中居于第二位，而死亡率高居所有恶性肿瘤的第四位。预计在2030年，胰腺癌将成为所有恶性肿瘤中的第二大杀手。

虽然胰腺癌的诊断和治疗模式在不断更新完善，但近四十年来患者的预后没有显著改善，5年生存率仅为6％左右，是目前预后最差的恶性肿瘤，故临床急需有效的联合检测，从而改善整体治疗效果。此外，胰腺癌恶性程度往往只能根据胰腺癌TNM分期来评判，而对胰腺癌了解程度越高，更有利于对患者进行治疗。

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(tumor necrosis factor alpha-induced protein 8,TNFAIP8或TIPE)家族共有4个成员：TIPE、TIPE1、TIPE2与TIPE3，它们在结构上具有高度同源性。其中TIPE3于2008年被发现【参见：Sun,H.,et al.TIPE2,a negative regulator ofinnate and adaptive immunity that maintains immune homeostasis[J].Cell.2008,133(3):415-426.】。相关研究表明TIPE3是磷脂酰肌醇第二信使的转运蛋白，通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路，影响肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和迁移【Moniz,L.,et al.A new TIPE of phosphoinositide regulator in cancer[J].CancerCell.2014,26(4):443-444.】。

免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测，是利用了抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织或细胞内的抗原(多肽和蛋白)，对其定位、定性及相对定量的研究。比如，将酶通过共价键方式连接在抗体上，制成酶标抗体再利用酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下在细胞表面或细胞内进行各种抗原成分的定位。目前，通常选用免疫组化间接染色法进行试验，利用该技术可在组织水平或细胞水平检测各抗原物质，如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机的结合在一起，这门新技术已经广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中，免疫组化的作用和意义更为重要。而发明人发现，目前未见利用免疫组化检测TIPE3评估胰腺癌恶性程度及患者预后的方法报道。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供一种TIPE3免疫组织化学检测试剂盒及其使用方法和应用。本发明研究发现，TIPE3在胰腺癌中表达显著升高，与肿瘤侵袭转移潜能密切相关，而且是胰腺癌患者的独立预后危险因素，因此可以通过检测TIPE3的表达来达到帮助判断胰腺癌恶性程度及患者预后的目的，从而提供一种TIPE3免疫组织化学检测试剂盒，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明的第一个方面，提供一种TIPE3作为诊断标志物在制备胰腺癌相关检测产品中的应用。

其中，所述胰腺癌相关检测产品包括TIPE3免疫组织化学检测试剂盒，其可用于判断胰腺癌恶性程度及患者预后情况。

本发明的第二个方面，提供一种TIPE3免疫组织化学检测试剂盒，所述TIPE3免疫组织化学检测试剂盒至少包括如下组分：一抗、二抗、灭活组织切片中过氧化物酶和生物素的试剂、与辣根过氧化物酶反应并显色的显色试剂，特异性对组织中细胞核染色的试剂；

其中，一抗具体为针对人TIPE3抗原所制备的TIPE3特异性抗体，如兔抗人TIPE3多克隆抗体等，在此不做具体限定。

相对应的，二抗只需与一抗的种属、类别或亚类相匹配即可，如当一抗为兔抗人TIPE3多克隆抗体时，二抗可以为羊抗兔IgG(羊抗兔IgG-HRP)。

本发明的第三个方面，提供上述TIPE3免疫组织化学检测试剂盒用于组织切片免疫组织化学染色诊断的使用方法，所述方法包括：

S1、取待测者待测组织固定后制石蜡片；

S2、经处理后的石蜡片先后与一抗、二抗反应；

S3、反应结束后，对切片进行清洗，经DAB染色、苏木素复染、脱水透明封片，显微镜观察。

本发明的第四个方面，提供上述TIPE3免疫组织化学检测试剂盒和/或使用方法在肿瘤检测中的应用。

其中，所述肿瘤为胰腺癌；

所述肿瘤检测具体包括：判断胰腺癌恶性程度、转移潜能及患者预后情况(包括胰腺癌患者生存率)。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案基于胰腺癌患者癌组织TIPE3免疫组化染色强度越高、范围越广，胰腺癌的恶性程度越高；反之，则恶性程度越低，从而制备一种TIPE3免疫组织化学检测试剂盒，该试剂盒可以有效地区分胰腺癌癌组织和正常组织，还可为胰腺癌个体化治疗提供新的诊断和分类依据。

上述试剂盒可有效预测胰腺癌恶性程度和转移潜能，对胰腺癌患者进行复发转移风险分级；同时还可以评估患者预后情况，从而有助于提高胰腺癌患者的生存率，为临床上胰腺癌的防治提供重要的科学依据，因此具有良好的临床应用价值和社会效益。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例中TIPE3高表达和低表达患者的生存曲线；

图2是本发明实施例中胰腺癌周围正常组织IHC染色图；

图3是本发明实施例中胰腺癌组织IHC染色图；

图4是本发明实施例中淋巴结转移阴性的胰腺癌组织IHC染色图；

图5是本发明实施例中淋巴结转移阳性的胰腺癌组织IHC染色图；

图6是本发明实施例中未发生转移的淋巴结组织IHC染色图；

图7是本发明实施例中发生转移的淋巴结组织IHC染色图；

图8是本发明实施例中利用本方法预测胰腺癌患者是否发生淋巴结转移的ROC曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

如前所述，目前未见利用免疫组化检测TIPE3评估胰腺癌恶性程度及患者预后的方法报道。发明人通过对胰腺癌患者做癌组织TIPE3免疫组化检测发现，胰腺癌组织免疫组化染色TIPE3蛋白表达要明显高于周围非癌组织。而发生了淋巴结转移的胰腺癌患者的癌组织TIPE3免疫组化检测TIPE3蛋白表达要高于未发生淋巴结转移的胰腺癌患者。此外，TIPE3高表达的胰腺癌患者的生存率是低于TIPE3低表达的胰腺癌患者的。因此，胰腺癌患者癌组织TIPE3免疫组化染色强度越高、范围越广，胰腺癌的恶性程度越高；反之，则恶性程度越低。基于上述研究成果，从而提出本发明。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种TIPE3作为诊断标志物在制备胰腺癌相关检测产品中的应用。

其中，所述胰腺癌相关检测产品包括TIPE3免疫组织化学检测试剂盒，其可用于判断胰腺癌恶性程度及患者预后情况。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种TIPE3免疫组织化学检测试剂盒，所述TIPE3免疫组织化学检测试剂盒至少包括如下组分：一抗、二抗、灭活组织切片中过氧化物酶和生物素的试剂、与辣根过氧化物酶反应并显色的显色试剂，特异性对组织中细胞核染色的试剂；

其中，一抗具体为针对人TIPE3抗原所制备的TIPE3特异性抗体，如兔抗人TIPE3多克隆抗体等，在此不做具体限定。

相对应的，二抗只需与一抗的种属、类别或亚类相匹配即可，如当一抗为兔抗人TIPE3多克隆抗体时，二抗可以为羊抗兔IgG(羊抗兔IgG-HRP)。

所述灭活组织切片中过氧化物酶和生物素的试剂可以为0.3％的H

所述与辣根过氧化物酶反应并显色的显色试剂可以为DBA溶液。

所述特异性对组织中细胞核染色的试剂可以为苏木素。

本发明的又一具体实施方式中，所述TIPE3免疫组织化学检测试剂盒还可以包括固定剂、脱蜡水化剂、血清封闭剂、缓冲液、抗体稀释液、脱水透明剂等。

其中，所述固定剂可以为中性缓冲4％多聚甲醛液、Bouin’s液或mDF液。

所述血清封闭剂一般是和二抗同一来源的动物自身的血清中抗体，预先能和组织中能够与二抗结合的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

缓冲液可以是PBS缓冲液。

抗体稀释液用PBS即可，也可用有利于抗体的多次回收利用而添加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份的专用抗体稀释液。

所述脱蜡水化剂与脱水透明剂均为二甲苯和乙醇(包括无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇和75％乙醇)，只是在使用顺序上完全相反。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述TIPE3免疫组织化学检测试剂盒用于组织切片免疫组织化学染色诊断的使用方法，所述方法包括：

S1、取待测者待测组织固定后制石蜡片；

S2、经处理后的石蜡片先后与一抗、二抗反应；

S3、反应结束后，对切片进行清洗，经DAB染色、苏木素复染、脱水透明封片，显微镜观察。

其中，所述步骤S1中，待测者待测组织可以为胰腺组织(如胰腺癌组织)。

所述步骤S2中，所述石蜡片处理过程包括：将制备得到的石蜡片脱蜡水化后，进行抗原修复，然后灭活过氧化物酶和生物素并进行血清封闭即可。

所述步骤S3中，所述显微镜观察包括：每个样本随机选取三个视野，每组细胞约500个；根据苏木精染色强度进行半定量评分(0，阴性；1，+；2，++；3，+++)，根据阳性细胞的百分数分为四级(<1％，0分；1-25％，1分；26-50％，2分；60-75％，3分；76-100％，4分)；将每个样本的两个评分结合，得到最终的TIPE2表达评分(IHC sum score)。定义表达水平的分界点为：0-3分，低表达；4-8分，高表达。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述TIPE3免疫组织化学检测试剂盒和/或使用方法在肿瘤检测中的应用。

其中，所述肿瘤为胰腺癌；

所述肿瘤检测具体包括：判断胰腺癌恶性程度、转移潜能及患者预后情况(包括胰腺癌患者生存率)。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

利用TIPE3免疫组织化学检测试剂盒评估胰腺癌的恶性程度及患者预后的方法包括样本处理，试验初期，抗体孵育，显色，观察得出结论五部分，具体划分为以下步骤：

(1)组织固定：取患者胰腺癌样本后，为了保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性，除去妨碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原-抗体结合物易于获得良好的染色结果，需要固定液处理。常用中性缓冲4％多聚甲醛液(也可选用Bouin’s液、mDF液等)。组织固定时间最好在l2h内，一般不应超过24h。因为随着固定时间的延长，组织抗原的检出强度将逐渐降低。

(2)制片：可做石蜡片，石蜡片保存简单、结构漂亮、保存时间长。先用梯度乙醇(由低到高，通常从50％酒精开始，经70％、85％、95％直至纯酒精)进行脱水，然后用透明剂浸渍组织，再对组织完全浸蜡，最后切片。一般石蜡片切片5μm左右。切片完成后进行贴片(捞片)和烤片。可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将蜡片于温水(45℃左右)中展平后，捞至玻片上铺正，用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥。

(3)石蜡片脱蜡和水化：为了抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应，需要利用二甲苯、梯度乙醇(由高到低)依次清洗胰腺癌样本切片。二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min；无水乙醇5min、95％乙醇5min、85％乙醇5min、75％乙醇5min；磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，置于摇床。

(4)抗原修复：组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，会发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱可分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。一般可以将组织切片放在修复液中，然后用微波修复中火6min*4次。注意微波修复后自然冷却30min左右。

(5)灭活过氧化物酶和生物素：如果显色系统为过氧化物酶(HRP)系统，或者在传统ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，为了防止产生非特异性显色，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。而且一些组织内源性过氧化物酶含量会较高，需要灭活过氧化物酶。可将样本片放入0.3％H

(6)血清封闭：血清封闭，以便排除非特异性结合位点，排除非特异性着色。封闭血清一般是和二抗同一来源的动物自身的血清中抗体，预先能和组织中能够与二抗结合的位点发生结合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。可室温10-30min，防止封闭过度。

(7)一抗、二抗处理：

一抗孵育温度有几种：4℃、室温、37℃，其中4℃孵育效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关。可37℃1-2h，而4℃需要过夜，再从冰箱拿出后37℃复温45min。

二抗可室温或37℃孵育30min-1h。且二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配。

本实施例中，免疫组化所用一抗为武汉博士德生物工程有限公司合成，设计合成的TIPE3抗原表位肽为C末端含有20个氨基酸(RPNLKRICEGINKLLDEKVL)，稀释浓度1：300，孵育时间4℃过夜；二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

抗体稀释液用PBS即可，也可用有有利于抗体的多次回收利用而添加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份的专用抗体稀释液。

(8)切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗)：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要，可以一抗孵育前的清洗：3min*3次，一抗孵育后的清洗：5min*5次。

(9)DAB显色：滴加DBA溶液，显色，光学显微镜下观察棕色本底，实时自来水冲洗终止。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗。

(10)复染：常用苏木素复染(胞核染料)。目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒，再次流水振洗，最后放入氨水中返蓝。

(11)脱水透明封片：脱水透明过程与脱蜡过程相反。按照梯度乙醇(从低到高)，二甲苯依次清洗玻片：75％乙醇5min→85％乙醇5min→95％乙醇10min→无水乙醇10min→二甲苯10min，吸去液体，室温下晾干。透明可用二甲苯Ⅱ10min、二甲苯Ⅰ10min。而为了长期保存，一般用中性树胶封片。可以直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后盖上盖玻片，注意小心气泡的产生。晾干半天即可。

(12)显微镜下观察。

免疫组化染色评分方法：由两位经验丰富的病理学家独立地进行盲评。当存在较大差异时(得分差异>2)，则需要第三位病理学家分析结果。在光学显微镜下观察，每个样本随机选取三个视野，每组细胞约500个。根据苏木精染色强度进行半定量评分(0，阴性；1，+；2，++；3，+++)，根据阳性细胞的百分数分为四级(<1％，0分；1-25％，1分；26-50％，2分；60-75％，3分；76-100％，4分)。将每个样本的两个评分结合，得到最终的TIPE2表达评分(IHCsum score)。定义表达水平的分界点为：0-3分，低表达；4-8分，高表达。

对胰腺癌患者做癌组织TIPE3免疫组化检测，如图3所示，发现胰腺癌组织免疫组化染色TIPE3蛋白表达要明显高于周围非癌组织(图2)。而发生了淋巴结转移的胰腺癌患者的癌组织TIPE3免疫组化检测(图5)TIPE3蛋白表达要高于未发生淋巴结转移的胰腺癌患者(图4)。此外，如图1所示，我们的临床数据说明，TIPE3高表达的胰腺癌患者的生存率是低于TIPE3低表达的胰腺癌患者的。此外，免疫组化染色评分4分以上更容易发生淋巴结转移。综上所述，胰腺癌患者癌组织TIPE3免疫组化染色强度越高、范围越广，胰腺癌的恶性程度越高；反之，则恶性程度越低。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。