一种提高胶球藻生物量和光合固碳能力的方法

摘要

本发明公开了一种提高胶球藻生物量和光合固碳能力的方法。该方法包括如下步骤：将活化后的胶球藻种子液，在无菌条件下接种至含有NaHCO3的培养基中，将装有培养基的三角瓶置于摇床上，放入带有顶部光照的二氧化碳培养箱中，通入CO2和空气的混合气体并控制CO2混合比例，使胶球藻进行光合自养培养；在培养过程中将光照强度与胶球藻细胞密度相关联，采用阶梯式调高光强的策略并贯穿整个培养过程。采用本发明的方法，通过NaHCO3化学固定CO2与阶梯调光耦合措施，能促进胶球藻细胞生物量增长，提高光合固碳能力，可运用在微藻CO2减排联产胶球藻生物质的绿色循环经济和碳中和技术领域。

说明书

技术领域

本发明属于工业生物技术领域，尤其涉及一种提高胶球藻生物量和光合固碳能力的方法。

背景技术

CO

微藻光合固碳的原理是光合作用，主要包括光反应和暗反应两个过程。光反应完成光能的吸收、传递并产生能量，暗反应(卡尔文循环)则完成CO

目前微藻光合固碳的生物过程存在光衰减严重、CO

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种提高胶球藻生物量和光合固碳能力的方法。

本发明采用一种将胶球藻细胞密度与光照强度相关联的阶梯式调光策略，在光合固碳中提供充足的光照强度；同时向培养体系中添加适量碳酸氢钠，弱碱性液体可实现CO

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的提高胶球藻生物量和光合固碳能力的方法，包括如下步骤：

将已活化的胶球藻(Coccomyxasubellipsoidea C-169)种子液在无菌条件下接种在含有NaHCO

进一步地，在所述含有NaHCO

优选地，在所述含有NaHCO

进一步地，所述含有NaHCO

优选地，所述Basal培养基包含1.25～2.50g L

进一步优选地，所述Basal培养基包含2.5g L

进一步地，所述含有NaHCO

优选地，所述含有NaHCO

进一步地，所述胶球藻的初始密度为8.0×10

优选地，所述胶球藻的初始密度为1.0×10

进一步地，所述混合气体为CO

优选地，在所述混合气体中，CO

进一步地，所述二氧化碳恒温培养箱中摇床的转速为120～170rpm，培养温度为25±1℃，培养时间为10～14天。

优选地，所述二氧化碳恒温培养箱中摇床的转速为150rpm。

优选地，所述光合自养培养时间为12天。

进一步地，所述光合自养培养过程中，光源为白光，初始光强为80±5μmol m

优选地，在所述光合自养培养过程中，光源为白光，初始光强为80±5μmol m

在培养过程中，光源可以由LED自然白光灯条提供。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供的方法，通过在体系中加入适量NaHCO

(2)本发明提供的方法，使用与胶球藻细胞密度相关联的阶梯式调光策略，克服了培养后期由于细胞密度增高导致光衰减和光利用率降低的关键问题，从而显著提高了胶球藻的光合固碳能力。

(3)采用本发明提供的方法，胶球藻的生物量浓度最高达到7.42g L

附图说明

图1为实施例中不同碳源下光合自养培养胶球藻(Coccomyxasubellipsoidea C-169)时pH变化曲线；

图2为实施例中不同碳源下光合自养培养胶球藻(Coccomyxasubellipsoidea C-169)时生物量浓度、固碳量和固碳速率；

图3为实施例中不同NaHCO

图4为实施例中不同调光策略下光合自养培养胶球藻时细胞密度变化的结果图；

图5为实施例中不同调光策略下光合自养培养胶球藻时生物量浓度、固碳量和固碳速率的结果图；

图6为实施例中不同初始氮源浓度下光合自养培养胶球藻时生物量浓度、固碳量和固碳速率的结果图；

图7为实施例中不同氮源添加方式下光合自养培养胶球藻时生物量浓度、固碳量和固碳速率的结果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

本发明实施例中采取的检测方法可参照如下说明。

1.生物量浓度

将2mL胶球藻藻液置于预先称重的离心管(标记为W1)中，在10,000rpm转速下离心4min，沉淀藻泥用蒸馏水洗涤两次，将含有藻泥的离心管置于60℃烘箱中烘干至恒重，测定其质量(标记为W2)，并按如下公式计算生物量：

生物量(g L

W1为预先称重的离心管质量；

W2为离心管与烘干后藻泥两者质量之和。

2.固碳量和固碳速率

取0时和培养结束时的藻液，在10,000rpm转速下离心4min，藻泥用蒸馏水洗涤两次，-40℃真空冷冻干燥获得藻粉。取冻干藻粉3～5mg用元素分析仪测定其中的C元素含量，结果用百分比表示。固碳量和固碳速率计算方式见如下公式：

M＝B·Cc (1)

R

M——光合固碳量(g L

B——生物量浓度(g L

Cc——总碳元素含量(％，w/w)；

R

P——生物量产率(g L

M

3.细胞密度

取1mL新鲜胶球藻藻液，进行稀释后，利用流式细胞仪测定得到细胞密度。

以下实施例中，图2、图3、图5、图6及图7中，若标注有不同字母代表数据具有显著性差异，相同字母代表数据无显著性差异(实验组别多于2组时用此种标注方法)，若标注有**表示极显著性差异(P<0.01)；#表示显著性差异(P<0.05)；△表示显著性差异(P<0.05)(实验组别少于3组时用此种标注方法)。

实施例1不同碳源下胶球藻光合自养过程中pH变化规律

1.1藻种活化及种子液制备

将胶球藻(Coccomyxasubellipsoidea C-169)转接到Basal固体培养基上培养12天，培养温度25℃，pH值6.1，光照强度60μmol m

从固体平板上挑取胶球藻藻苔于Basal液体培养基中，在250mL三角瓶中装液量为100mL，置于光照恒温摇床中培养7天用作种子液，设置pH值6.1、温度25±1℃，光强80μmolm

表1 Basal培养基配方

注：若配置固体Basal培养基，需再加入2wt％琼脂；EDTA为乙二胺四乙酸。

1.2不同碳源下胶球藻光合自养过程中pH变化规律

1.2.1自养培养

将活化好的胶球藻种子液在无菌条件下分别接种至100mL含有不同碳源的Basal培养基中(起始细胞密度为1.0x10

1.2.2分析结果

在不同碳源下胶球藻培养液的pH变化曲线见图1所示。在以0.42gL

实施例2不同碳源下胶球藻生物量浓度和固碳能力

2.1藻种活化及种子液制备

按1.1所述方法活化制备胶球藻种子液。

2.2不同碳源下胶球藻自养培养与固碳能力分析

2.2.1自养培养

按1.2所述方法自养培养胶球藻

2.2.2分析检测

培养结束后收集胶球藻悬浮液，2mL离心取藻泥，洗涤烘干至恒重后，测定生物量；另取培养0时和培养结束时的藻液，经离心、洗涤、-40℃真空冷冻干燥获得藻粉，用于测量藻细胞内碳含量。

采用Origin 9.0软件进行绘图；SPSS 22.0软件进行显著性分析，以不同字母和符号表示组间显著性差异(p<0.05)。

2.2.3分析结果

将胶球藻置于不同碳源下培养，生物量浓度和固碳能力见图2。在以0.42gL

实施例3不同NaHCO

3.1藻种活化及种子液制备

按1.1所述方法活化胶球藻制备种子液。

3.2不同碳酸氢钠浓度下胶球藻自养培养与固碳能力分析

3.2.1自养培养

实验过程中，配置好一定浓度的NaHCO

3.2.2分析检测

方法同2.2.2

3.2.3分析结果

在不同碳酸氢钠浓度下通入2％CO

实施例4阶梯调光策略下胶球藻细胞密度变化规律

4.1藻种活化及种子液制备

按1.1所述方法活化制备胶球藻种子液。

4.2阶梯调光策略下胶球藻自养培养与生长状态分析

4.2.1自养培养

将活化好的胶球藻种子液在无菌条件下接种至含有0.42g L

4.2.2分析检测

培养过程中，每2天取1mL藻液，适当稀释后用于细胞密度测定。

4.2.3结果分析

不同调光策略下光合自养培养胶球藻时细胞密度变化见图4。由图4可知，第0～4天细胞生长处于延滞期，两种光照方式对其生长的影响没有明显差异；在对数期末期，对照组细胞密度为1.3×10

表2 阶梯式调光策略

实施例5阶梯调光策略下胶球藻生物量浓度和固碳能力

5.1藻种活化及种子液制备

按1.1所述方法活化制备胶球藻种子液。

5.2阶梯调光策略下胶球藻自养培养与固碳能力分析

5.2.1自养培养

培养方法同4.2.1。对照组以恒定光强进行培养，实验组光强调控策略为：在培养初期，藻细胞生长处于延滞期(0～2d)，细胞密度低，此时维持光强为80±5μmol m

5.2.2分析检测

方法同2.2.2。

5.2.3分析结果

由图5可知，对照组以恒定光强80μmol m

实施例6不同初始氮源浓度下胶球藻生物量浓度和固碳能力分析

6.1藻种活化及种子液制备

按1.1所述方法活化制备胶球藻种子液。

6.2不同初始氮源浓度下胶球藻自养培养与固碳能力分析

6.2.1自养培养

配置好一定量NaNO

6.2.2分析检测

方法同2.2.2。

6.2.3分析结果

不同初始NaNO

实施例7不同氮源添加方式下胶球藻生物量浓度和固碳能力分析

7.21.自养培养

将活化完成的胶球藻种子液在无菌条件下接种至含有0.42g L

7.2.2分析检测

方法同2.2.2。

7.2.3分析结果

不同氮源添加方式下胶球藻生物量和固碳能力见图7。将2.50g L

综合实例1-7的结果表明，以NaHCO

以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。