氨基甲酸酯β苯乙醇胺类似物增强胞内LDL胆固醇的清除及与他汀类药物联用的新用途

摘要

本发明涉及氨基甲酸酯‑β‑苯乙醇胺类似物在上调LDL受体，促进摄取细胞外LDL胆固醇和减少细胞间总胆固醇中的用途。它还涉及使用氨基甲酸酯‑β‑苯乙醇胺类似物和其他降脂剂的他汀类药物作为联合治疗，发挥降低LDL胆固醇以及减少不良反应的协同作用。

说明书

发明领域

本发明包括R-班布特罗在内的氨基甲酸酯-β-苯乙醇胺类似物，作用是上调 LDL受体并促进肝脏和其他细胞对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的摄取。本发明还包括R-班布特罗在内的氨基甲酸酯-β-苯乙醇胺类似物，作用是促进细胞间 LDL-C的转换或清除，从而促进血液中LDL-C的清除。

降低低密度脂蛋白胆固醇是治疗高脂血症最重要的目标。低密度脂蛋白胆固醇和心血管风险之间的因果关系已经被证实(Michael G.Silverman,et al. AssociationBetween Lowering LDL-C and Cardiovascular Risk Reduction.JAMA Volume 316:12,September 27,2016)。然而，心血管风险与血液中总胆固醇或甘油三酯水平之间的关系仍然存在争议(Meera Senthilingam,Statins or not？New study aims to help doctorsand patients decide,CNN,Sep 8,2016；Robert DuBroff, Michel de Lorgeril,Cholesterol confusion and statin controversy,World J Cardiol 2015July 26；7(7):404-409)。

LDL受体和LDL-C是临床治疗高脂血症最重要的治疗靶点。常用的他汀类药物的主要作用靶点或作用机制是阻断总胆固醇的合成。他汀类药物的缺点在于它的不良反应。主要不良反应为肌痛、糖尿病、肝损伤、神经元损伤等。除了能降低血液胆固醇外，导致他汀类药物副作用主要由于它的非靶标作用，因为他汀类药物非选择性抑制人体所有组织中胆固醇合成，而胆固醇是有益脂类和相关激素的重要组成部分，在人体中发挥着重要作用。所以人们希望能够提供精准降低低密度脂蛋白胆固醇的靶向药物，且副作用更少。目前基本没有市售药物能达到这个目的。本发明公开了一种可以满足目前医疗需求的新药物，它能作用于LDL 受体(特别是在肝脏中的LDL受体)，增强细胞内LDL-C的清除。

他汀类药物已经使用了20多年，现在占治疗高脂血症市场的90％。他汀类药物虽有严重的副作用，但仍是最常用的药物。此外，他汀类药物对约30％的患者无效。本发明还涉及一种包括了R-班布特罗的氨基甲酸酯-β-苯乙醇胺类似物，能用于联合他汀类和其他降脂药物治疗高脂血症，以达到增强协同降低LDL-C 的治疗效果。本发明还涉及一种氨基甲酸酯-β-苯乙醇胺类似物与他汀类及其他降脂药物联合使用，以减少他汀类及其他降脂药物引起的毒性和不良反应。

背景技术

血脂异常是一种常见的疾病。这可能涉及血液中甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇的升高。血脂异常的主要临床并发症是由于胆固醇沉积和炎症反应引起的大动脉损伤，从而导致动脉硬化和斑块形成。顽固性小动脉的动脉硬化可导致高血压。当冠状动脉或大脑动脉受损时，可能会导致组织缺血，此外，血管壁的斑块掉落会立即形成栓塞，导致心脏附着或脑卒中。医学界普遍认为高脂血症会增加心血管疾病的发病风险。最近有争论是否诱发高血压脂质和心血管事件之间有关系，从临床试验的荟萃分析尚未说明高血胆固醇和更高的心血管疾病发生率有关系,甚至有大量的心血管疾病患者的血脂是正常，甚至是偏低的。尽管如此，大家所认为的：“低密度脂蛋白胆固醇与心血管疾病风险之间明显的相关”这一观点与关键临床试验的证据相吻合。低水平的血液低密度脂蛋白胆固醇通常会有更好的心血管疾病预后。因此，降低血液LDL-C水平仍然是当前临床治疗血脂异常的主要目标。

亲脂性他汀类药物一直是降脂的主要药物，过去几十年都着重于减低LDL-C。他汀类药物的主要作用机制是通过竞争性抑制一种关键酶HMG-CoA还原酶来阻断胆固醇的合成。然而，大约有30％以上的患者对他汀类药物治疗没有反应。此外，HMG-CoA还原酶也是参与合成体内其他类固醇类化合物，如皮质类固醇、性激素等的一种关键酶。因此,长期使用他汀类药物引起严重副作用如肌痛和糖尿病的风险,肝毒性,甚至心脏问题的最新报告(

大约有30％的患者对他汀类药物有耐药性。人们希望有药物能够更精确地针对低密度脂蛋白胆固醇，且副作用更少。很少有药物能达到这个目的。本发明公开了一种用于未满足医疗需要的新药物，该药物专门作用于LDL受体，降低细胞内LDL-C。

依折麦布是另一类降脂药物。它是一种通过抑制Niemann-Pick C1-like 1蛋白(NPC1L1)来抑制肠道胆固醇吸收的抑制剂，从而抑制胆固醇在肝脏和肠道中的转运。因此，常与胆固醇合成抑制剂他汀联合使用，以达到更好的降血脂效果。

最近成功用于治疗血脂异常的新药物是：静脉注射的抗体药物-PCSK9。 PCSK9抗体可显著降低血浆LDL-C。PCSK9的作用机制不同于他汀类药物，它阻断了血液中一种称为PCSK9的特定蛋白质，这种蛋白它可以分解胞浆中的 LDL受体，从而降低LDL转化率和其回膜量。LDL受体的减少降低了血液LDL-C 的转运和代谢，导致血液低密度脂蛋白胆固醇的增加。使用PCSK9抗体阻断 PCSK9蛋白将显著降低患者LDL[Fiorella Devito et.at.Focuson alirocumab:A PCSK9 antibody to treat hypercholesterolemia.PharmacologicalResearch.Vol.120, Dec.(2015)]。

然而，由于血脂异常是慢性的，不是急性发作或直接威胁生命的疾病，因此患者对PCSK9静脉注射制剂的依从性是其临床应用的主要缺点。此外，还有一些临床试验揭示了接受PKSC9抗体治疗的患者出现了一些严重不良影响，如认知功能障碍[Swiger KJ andMartin SS.PCSK9 inhibitors and neurocognitive adverse events:exploring theFDA directive and a proposal for N-of-1trials.Drug Saf.Jun；38(6):519-26,(2015)]。

R-bambuterol对小鼠和人体有降脂作用[Wen Tan,R-Bambuterol,itspreparation and therapeutic uses,EP20020807678.]口服R-bambuterol可降低血液中的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇[Ye et al.The Lipid-lowering Effects of R-bambuterol in Healthy Chinese Volunteers:A Randomized Phase I Clinical Study,EBioMedicine 2(2015)356]。

然而，血液胆固醇可能受到许多不同方式的影响。它可能受肠道吸收、合成的影响，包括：胆汁酸螯合，胆固醇在血液和细胞之间的转运，以及胆固醇被肝脏或其他器官吸收，LDL受体的活性或功能等。到目前为止，R-班布特罗的作用机制或目标尚不清楚。R-班布特罗对LDL受体的作用及其对细胞内LDL-C周转的作用尚不清楚。

由于R-班布特罗是BuChE最有效的抑制剂之一，所以这些作用可能与抑制丁酰胆碱酯酶(BuChE)的活性有关，以及与BuChE的高表达或增强活性与高脂血症和肥胖有关[Kutty,KM et,al.Serum pseudocholinesterase:high density lipoproteincholesterol ratio as an index of risk for cardiovascular disease,ClinicaChimica Acta 115(1):55-61,February(1981)；Calderon-Margalit et al.:BuChE,Cardiovascular Risk Factors,and Mortality,General Clinical Chemistry 52:5000(2006)]。然而，也存在争议。BuChE与LDL或胆固醇之间的因果关系尚未确定。据报道，BuChE基因敲除小鼠饲喂高脂饲料后，对比野生型的小鼠，基因敲除小鼠体重上升更快[Chen YPet al.,Butyric cholinesterase deficiency promotes adipose tissue growth andhepatic lipid accumulation in male mice on high fat diet. Endocrinology 157:3086-3059,(2016)]。

R-班布特罗是特布他林的前药。根据我们的研究，本发明所揭示的R-班布特罗对LDL受体和LDL-C的影响与其母体药物特布他林无关。更重要的是， BuChE与LDL受体以及BuChE抑制剂与LDL受体之间的关系尚未被研究清楚。在现有研究中，R-班布特罗降低血脂和低密度脂蛋白胆固醇的靶点是什么仍然是未知的。R-班布特罗是否作用于LDL受体或清除细胞内胆固醇或两者都没有研究[WenTan,R-Bambuterol,its preparationandtherapeutic uses,EP20020807678]。

然而，R-班布特罗是β2激动剂-特布他林的前药。β2受体激动剂被认为可调节多种参与脂质代谢的途径，降低胆固醇和LDL-C。β2受体激动剂，如特布他林，可刺激调节胆固醇、脂肪酸和甘油三酯生物合成的固醇调节元件结合蛋白 (SREBPs)。有人认为，R-班布特罗的降脂作用可能与母体药物特布他林有关，因此，R-班布特罗降脂的事实证明了β-2激动剂在脂代谢中的作用，它可能提供解决血脂异常的另一方式。[Michael H.Davidson,Beta-2 Agonism:APotential Therapeutic Target for Dyslipidemia.EBioMedicine 2(2015)284]。

对于解决血脂异常的医学需求尚未得到满足，需要寻找一种能够特异作用于LDL-C受体和细胞内清除LDL-C的药物，以减少不良反应。另外，寻找一种能降低他汀类药物毒性、提高其疗效的药物已成为当今需要的主要降脂药物的发展目标。

发明内容

在实际中，本发明公开了R-班布特罗的新用途。本发明揭示，通过荧光标记，R-班布特罗可促进LDL-C和氧化LDL胆固醇(ox-LDL-C)从胞外内吞或转运进入肝细胞。此外，在R-班布特罗作用后，细胞膜上LDL受体的表达也有上调， LDL-C与受体的结合增加。结果表明，R-班布特罗有利于LDL-C和ox-LDL-C 向细胞的转运，消除了细胞外或血液中的LDL和ox-LDL-C，从而降低了血液中 LDL和ox-LDL-C的水平。

本发明揭示了R-班布特罗降低LDL-C的靶点和机制与他汀类药物不同，他汀类药物主要是通过抑制胆固醇的细胞内合成。本发明公开的R-班布特罗的治疗靶点也不同于PCSK9抗体，PCSK9抗体是通过抑制PCSK9酶来减缓LDL受体的细胞间降解。在本发明中R-班布特罗现有研究中并未发现属于以上两种机制。因此，它应该被认为是通过新机制产生作用。

在一个实例中，本发明还发现R-班布特罗用量与肝细胞间LDL-C显著降低的是剂量相关的。同时，丁酸胆碱酯酶活性抑制也是与R-班布特罗剂量相关。

在W Tan和J Chen先前的美国专利[US Patent.2002]公开了口服R-班布特罗可以降低血脂和低密度脂蛋白(LDLprotein)。然而，它是否涉及吸收、消除或其他靶点或机制尚不清楚。R-班布特罗可能是通过促进代谢、增加肝细胞胆汁酸分泌，或通过减少胆固醇合成而增强了细胞间LDL-C的清除或周转。本发明中披露的这些对LDL受体的影响未曾在现有专利中报道过。脂代谢紊乱或高脂血症是涉及不同机制或疾病靶点的症状。这就要求相关药物具有明确、特异的生理靶点，才能是治疗患者的理想选择。本发明提供了一种传统化合物用于治疗低密度脂蛋白胆固醇升高的患者的新用法。

他汀类药物是一线用药，也是广泛使用的处方药。为获得更好的疗效，建议将R-班布特罗与他汀联合使用。本发明公开了R-班布特罗与他汀类药物合用时具有显著的协同作用。

在一个实例中，本发明揭示了R-班布特罗和他汀类药物在相对较低的剂量下对细胞内胆固醇的减少或合成均未显示抑制作用。然而，当R-班布特罗和他汀以同上相同剂量的联合使用时，细胞内胆固醇显著降低。此外，在LDL从细胞外进入细胞的摄取或转运比较中，R-班布特罗和他汀联合用药比R-班布特罗或他汀单独用药相比有更显著的效果。联合用药的导致的细胞内胆固醇的减少或清除，是因为胆固醇的合成的降低和代谢过程的促进，或被肝细胞以胆汁酸的形式分泌的增加等。这种协同效应在现有技术中从未被报道过。这个技术无法被其他专利推导的。

此外，已知他汀类药物可能引起肝毒性和其他不良反应[Atorvastatinassociated liver disease,Clarke AT and PR.Mills,Digestive and liver disease,38:772. (2006)]。转氨酶水平是肝损伤的一个指标，在使用他汀类药物的患者中，高达2％的患者出现转氨酶水平高于正常上限(ULN)的3倍[Chalasani N,et al,Patients withelevated liver enzymes are not at higher risk for statin hepatotoxicity.Gastroenterology.126(5):1287–1292.(2004)]。由于不良反应，他汀类药物对某些患者来说是不耐受的，他们不得不终止治疗或重新调整剂量，使得他汀类药物的疗效降低。

一方面，本发明揭示了阿托伐他汀治疗可以显著抑制细胞合成细胞间胆固醇，但同时也对细胞有毒，增加阿托伐他汀剂量会降低细胞的活力。另一方面，班布特罗在剂量是他汀的4倍时，对细胞没有毒性，同时，细胞间胆固醇显著减少。在这方面，R-班布特罗优于他汀类药物。

在一个实例中，用阿托伐他汀和R-班布特罗联合处理细胞。我们惊奇地发现阿托伐他汀的毒性作用大大减少。阿托伐他汀在10μM或20μM剂量时可显著抑制细胞活力。然而，相同剂量的阿托伐他汀联合20μM的R-班特罗对细胞活力没有抑制作用。因此，R-班布特罗可以保护细胞免受阿托伐他汀诱导的毒性，使细胞对阿托伐他汀等他汀类药物的治疗具有更大的耐受性。这些从未被现有技术报道，它应该被认为是新颖的和独创的。

在一个实例中，我们发现在高脂高胆固醇饮食诱导的高脂血症家兔中，阿托伐他汀联合班布特罗比单独阿托伐他汀具有更强的降脂作用。病理检查显示，仅阿托伐他汀组毒性作用显著，而联合R-班布特罗组未见明显损伤。

在另一个实例中，我们发现在骨骼或平滑肌细胞和心肌细胞中也发现了R- 班布特罗类似的保护作用。

如前所述，R-班布特罗增加LDL受体的表达，促进LDL的内化。另一方面， R-班布特罗降低细胞内胆固醇，促进胞内LDL-C的清除。这些R-班布特罗在调节LDL受体和增强细胞内LDL-C清除方面的作用是独创的，是无法被其他专利推导的。

班布特罗是特布他林的前药。据认为，R-班布特罗的降脂作用是由于其原型药的作用[Michael H.Davidson,Beta-2 Agonism:A Potential Therapeutic Target forDyslipidemia,Ebiomedicine 2015]。在一个实例中，本发明显示了LDL的降低和对他汀类药物的细胞保护均与特布他林无关。因此，本发明颠覆了一种广泛的谬误，揭示了R-班布特罗的降脂作用与其原型药特布他林无关。这在现有技术中尚未被阐述。

R-班布特罗是一种特布他林前药，R-班布特罗已被证明是一种有效的BuChE 抑制剂，而其原型药特布他林则不是。此外，R-班布特罗的保护作用与抑制BuChE 有关。班布特罗的R-对映体被发现在降脂方面最有效，而S-对映体效果较小或没有效果。表明BuChE具有手性选择性。

在本发明的一个实例中发现，当两种药物联合使用时，可以看到R-班布特罗有对辛伐他汀引起的毒性的保护作用。这说明R-班布特罗可以预防其他他汀类药物引起的毒性，特别是已经上市的他汀类药物，如洛伐他汀、帕伐他汀、鲁伐他汀、切伐他汀、氟伐他汀、美伐他汀、匹他汀、普伐他汀等。

在本发明的另一个实例中，揭示了R-单酰胺-班布特罗或乙基化班布特罗对 LDL受体和细胞内LDL-C也有类似的清除作用。当与他汀类药物联合使用时，它们具有协同作用。此外，当这两类化合物分别与其中一种他汀联合使用时，它们对阿托伐他汀、西伐他汀和其他他汀类药物所引起的毒性具有与R-班布特罗类似的保护作用。

这项发明公开，如结构I中描述的一类(±)氨基甲酸酯-β-苯基乙醇胺类似物和它们的活性对映体以及药学上相应的盐形式，对丁胆碱酯酶的抑制作用相近，他们在上调LDL受体、通过合成或代谢提高细胞内低密度脂蛋白胆固醇的清除效率以及对他汀类药物和其他降脂药物引起的副作用或毒性的保护作用，具有与 R-班布特罗类似的保护作用。

另外，本发明专利颠覆了一个广泛的谬误，即左旋班布特罗及其类似物的降脂作用是由它的原型药——特布他林产生的。

结构式I

(±)-氨基甲酸酯-β-苯基乙醇胺

其中，

A选自取代或未取代的烷基，取代或未取代的烯基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的环烷基；

B选自氢或-CO-N(W)(X)；W和X独立地选自氢，取代或未取代的烷基；

C选自氢或-CO-N(Y)(Z)；Y和Z独立地选自氢，取代或未取代的烷基。

本发明公开的R-班布特罗是结构式I的优选选择。具有如结构式II的结构，

结构式II，R-班布特罗

其中，A为正丁基，B为-CO-N(W)(X)，W和X为甲基。C为-CO-N(Y)(Z)，由结构式I，Y和Z是甲基。

本发明公开了单胺班布特罗是结构式I的另一种优选选择，具有如结构式III 的结构。

结构式III，R-单胺班布特罗

3-(2-(叔丁基氨基)-1-羟乙基)-5-羟苯基二甲基氨基甲酸酯班布特罗单氨基甲酸酯(MONO)。其中A为正丁基，B为-CO-N(W)(X)，W和X是甲基。由结构式I，C是氢。

在一个实施方案中，我们公开了单胺班布特罗和R-班布特罗在上调LDL受体和增强细胞内LDL-C清除方面具有相似的作用。在与阿托伐他汀或西伐他汀联合使用时，具有协同作用和减低的毒性。

本发明公开了乙氧基班布特罗也是结构式I的优选选择，并具有如结构式IV 的结构。

结构式IV，乙氧基化班布特罗

5-(1-羟基-2-(叔戊基氨基)乙基)-1,3-亚苯基双(乙基(氨基)甲酸乙酯)。其中，A是叔戊基，B是-CO-N(W)(X)，W是甲基，X是乙基。C是-CO-N (Y)(Z)，由结构式I，Y是甲基，Z是乙基。

在一个实施方案中，我们公开了乙氧基班布特罗具有与R-班布特罗相似的作用，可上调LDL受体并促进细胞内LDL-C的清除。与阿托伐他汀或西伐他汀合用时，具有协同作用和降低他汀类药物的毒性。

本发明公开了(±)-氨基甲酸酯-β-苯基乙醇胺类似物，可上调LDL受体，促进细胞内LDL-C的清除。与他汀类药物和其他降脂剂联合使用对LDL的清除具有协同作用。另外，(±)-氨基甲酸酯-β-苯基乙醇胺类似物和他汀类药物的组合可以保护细胞免受他汀类药物诱导的毒性，因此可以减少他汀类药物的不良反应。本发明所有这些公开的发现从未在现有技术中报道过。

此外，本发明专利颠覆了一个广泛接受的谬误，即左旋班布特罗及其类似物通过它的原型药——特布他林发挥降脂作用。这是本领域技术人员无法推导出来的。

在某些情况下，他汀类药物治疗方案可能不能满足减少患者体内LDL-C所需的临床效果。这由于他汀类药物剂量相关副作用的限制，也由于他汀类药物本身的药效情况。特别是，约有30％的患者对他汀类药物治疗无反应。然而，本发明中公开的(±)-氨基甲酸酯-β-苯基乙醇胺类似物提供了可以显著改善当前他汀类药物治疗的功效和有效性的新方法。此外，还为对他汀类药物治疗无效的患者提供了最佳替代方案。

本发明进一步公开了，在肝细胞中，(±)-氨基甲酸酯-β-苯基乙醇胺类似物能特异性地作用于LDL受体，促进细胞内LDL清除。这些在现有技术中尚未被报道。

本发明公开了使用结构式I中所述的R-班布特罗或氨基甲酸酯-β-苯基乙醇胺类似物与他汀类药物或其他降脂剂(例如依泽替米贝，吉非贝齐，非诺贝特酸 (贝非特类)，烟酸，胆甾醇胺或colestipol(树脂，胆固醇酯转移蛋白(CETP) 抑制剂，PKSC9抑制剂(例如Evolocumabor和Alirocumab，Bococizumab和 Inclisiran)可产生协同作用，并减少患者的不良反应或毒性。

这些联合疗法不仅是增强药效，而且产生协同作用，显着减少药物不良反应。因此，本发明公开的这些联合疗法为需要他汀类药物和其他降脂剂的患者提供了更好的治疗指引。

(±)-氨基甲酸酯-β-苯基乙醇胺类似物或R-班布特罗与他汀类或其他降脂剂结合使用的这些新方法是独创的，本领域技术人员无法通过推导得出。

本发明提供了一种活性化合物对映体，具体结构如结构式I所示。该活性化合物对映体具有在上调LDL受体表达、结合并促进LDL-C摄取以及增强细胞内 LDL-C清除方面具有更好的效果。结构式I所示的活性对映体与他汀类药物合用时也具有较好的协同降脂作用。同时，结构式I的活性对映体与他汀类药物合用时对他汀类药物的毒性有较好的保护作用。

在本发明的一个实例中，提供了一种新的药物作为联合治疗方案，其包含有效剂量的R-班布特罗或来自结构式I的化合物或其盐类，联用阿托伐他汀或其他一种他汀。通过口服、吸入、注射，局部，直肠或阴道给药用于联合给药、序贯给药或单独给药的联合治疗。剂型包括固体剂型、溶液剂型、注射剂型、软膏剂型、软胶囊剂型和栓剂剂型。

在他汀类药物和结构式I所示化合物的联合治疗中，所含活性成分的含量可根据治疗目的、患者年龄以及患者的自身状况进行调整。在该联合方案中，应具有至少一种含量为1％-99％的他汀类药物和至少一种含量为1％-99％的结构式I所示化合物。

本发明中，结构式I的化合物或R-班布特罗的盐形式包括那些常规的医药上可接受的无机或有机酸盐，例如：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸二氢盐、甲磺酸盐、溴化物、硫酸甲酯、醋酸盐，草酸盐、顺丁烯二酸、富马酸、琥珀酸、2-萘磺酸、乙醇酸、葡萄糖酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸异硫酯、苯磺酸或对甲苯磺酸。

实施例

实施实例1

R-班布特罗增加LDL蛋白受体的表达并促进LDL-胆固醇的摄取

检测方法

将小鼠肝AML12细胞接种于24孔培养板中，并添加含10％热灭活胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养。用荧光标记的LDL孵育细胞，研究细胞对LDL-胆固醇的摄取和代谢。用LDL特异性抗体检测细胞表达的LDL受体。

将细胞分为不同组，分别添加R-班布特罗(R-BM)、阿托伐他汀(Statin) 或R-BM+Statin，包括以下组别：对照组、LDL蛋白、LDL蛋白+Statin 10μM、 LDL蛋白+R-BM 10μM或20μM、LDL蛋白+R-BM 10μM+Statin 10μM、LDL 蛋白+R-BM 20μM+Statin 20μM。

处理24小时后，将细胞洗涤并用多聚甲醛固定。然后在室温下加入1:200 稀释的抗LDL蛋白受体的一抗孵育4小时。洗涤后，添加稀释度为1:200的Alexa Fluor 488标记的二抗，并在室温下孵育2小时。清洗细胞后在配备数码相机的荧光显微镜(Axio Observer7)进行检查。分别或者合并检测绿色荧光抗体结合的LDL受体以及结合LDL受体的LDL或者胞内红色荧光标记的LDL。用计算机软件对荧光强度进行定量，荧光强度反映LDL的数量以及LDL受体结合抗体的数量。

实验结果：

1)与对照组和LDL，LDL+Statin 10μM和LDL+Statin 20μM相比，R-班布特罗治疗组(10μM和20μM)的结合和胞内荧光标记的LDL蛋白极显著增多，并且20μM R-班布特罗治疗的结合和胞内荧光标记的LDL蛋白高于10μM R- 班布特罗治疗。结果表明，R-班布特罗以剂量依赖的方式增强了低密度脂蛋白胆固醇向肝细胞的转运。肝细胞是低密度脂蛋白胆固醇的主要代谢途径。因此， R-班布特罗有助于清除细胞外间隙或血液中的低密度脂蛋白。

2)阿托伐他汀组LDL结合和胞内荧光标记的LDL明显高于LDL组，但还是低于R-班布特罗处理组。这说明阿托伐他汀也能促进LDL向细胞内转运。

3)他汀类药物与R-班布特罗联合处理组的LDL结合强度和细胞内荧光标记率均显著高于R-班布特罗或他汀类药物单用组。这一结果表明R-班布特罗和他汀在LDL转运到细胞中具有协同作用。

4)通过在显微镜下对随机选择区域的荧光强度进行量化，各组LDL受体的数量如下表所示。LDL受体在负载LDL的培养基中显著上调，然而R-班布特罗处理后其LDL受体还会进一步增加。R-班布特罗治疗组细胞中LDL受体表达的增加是他汀治疗组的两倍。这些结果表明R-班布特罗能上调LDL受体的表达，且比他汀类药物更有效。

然而，与单独使用他汀类药物相比，他汀类药物与R-班布特罗联合使用的效果显著增强。

表1.R-BM和他汀类药物对肝细胞LDL受体的上调作用(荧光强度)

实施例2.

R-BM可以提高LDL-C的清除或转运，与他汀类药物具有协同作用。

实验内容

HepG2细胞是人肝细胞，将其接种在6-孔板内，给予含10％热灭活胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养。将细胞暴露在40μg/mL LDL的环境中，并给予不同剂量的R-BM进行孵育。孵育24h后，采用总胆固醇检测试剂盒(Total CholesterolAssay Kit E105,Applygen Technologies Inc.,Beijing,China)检测胞内和胞外总胆固醇含量。另外小鼠肝细胞(AML12)实验中，同样的细胞培养条件，在40μg/mL LDL的环境中，分别给予10μM的他汀类药物、10μM的R-BM或二者组合，同样方法检测细胞内外LDL-C含量。

实验结果

1)细胞内LDL-C清除增加

HepG2实验中，对照组和LDL组的细胞内胆固醇含量相似。10μM的他汀类药物和10μM的R-BM单独使用时均对细胞内胆固醇无影响。

和HepG2细胞不同，在AML12细胞中，10μM R-BM和10μM阿托伐他汀单独使用均可以引起胞内胆固醇的少量下降。

表2R-BM降低细胞内LDL胆固醇

2)R-BM和他汀类药物协同降低胆固醇

在AML12细胞中，10μM R-BM和10μM阿托伐他汀单独使用均可以引起胞内胆固醇的少量下降。但是，当R-BM和阿托伐他汀联用时，细胞内总胆固醇含量显著下降，而且超过这两者任何一个单独使用时的作用。由此可以看出，R-BM和他汀类药物在清除细胞内胆固醇方面具有协同作用。

表3R-BM和他汀类药物联合使用的作用

实施例3.

R-BM可以对抗他汀类毒性，从而表现出联合他汀类用药时的保护作用。

实验内容

将HepG2细胞或肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)接种于96-孔板。当细胞密度达到50％左右时，更换培养基为无血清培养基，给予阿托伐他汀或R-BM室温条件下孵育24h。之后，更换含10％CCK-8的无血清培养基，黑暗条件下培养3h，采用多功能酶标仪 (TriStar2S LB942)检测细胞活性。以不给予药物组作为对照组，R-BM、他汀或者两者联用组的细胞活性均以对照组进行归一化。除对照组外，其他所有组别中，R-BM的浓度均为20μM。

实验结果

(1)HepG细胞实验结果

所有浓度的R-BM对于HePG2的活性均没有影响。他汀类药物在起始浓度(5μM)时就表现出了显著的细胞毒性，对细胞活性的影响呈现浓度依赖性。但是，R-BM可以显著降低他汀类药物的毒性，甚至可以完全消除低浓度他汀类药物的毒性。

表4.R-BM和阿托伐他汀对肝细胞活性的影响(占对照组的百分比)

(2)肺动脉平滑肌细胞

R-BM未对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)产生毒性作用。相比于HepG2细胞，PASMC细胞似乎对阿托伐他汀的耐受性更强。但是，他汀类对于PASMC 细胞同样也存在着呈浓度依赖性的细胞毒性作用。在PASMC中，R-BM同样可以显著降低他汀类药物的毒性。

表5.R-BM和阿托伐他汀对PASMC细胞活性的影响(占对照组的百分比)