一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法；核酸组合物包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针；本发明发现的核酸组合物配置成的试剂盒具有操作简单、检测结直肠癌相关基因甲基化结果准确性高及敏感性高等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

结直肠癌(CRC)包括结肠癌和直肠癌，是人类常见的下消化道恶性肿瘤。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症统计数据显示，结直肠癌全球发病率居第三位(193万)，死亡率居第二位(94万)。结直肠癌的防治重在结直肠癌的早期筛查与早期诊断，在疾病发病期内实现早发现早治疗，阻止病程进展、防止蔓延或减缓其发展。据2016结直肠癌预防共识意见显示，IV期结直肠癌的五年生存率为12％，II-III期为70％，而原位癌-I期为90％，可以看出，若能实现早诊早治，将有效延长结直肠癌患者生存期。

目前用于筛查与早期诊断CRC的手段主要有电子肠镜(影像学技术)、粪便潜血实验(FOBT)。肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准，但需要患者1-3天的肠道准备周期；检测过程中可出现肠道疼痛和不适感：且有一些禁忌症，如高血压、冠心病等。这些造成其适用人群的局限性及增加了其在中国推广的难度。FOBT也是一项CRC筛查的普遍应用技术，是通过检测粪便中血红蛋白的含量来判断消化道是否出血，如，消化性溃疡、药物致胃黏膜损伤、钩虫病、肠结核、Crohn(克罗恩)为、溃疡性结肠炎、结肠息肉、胃癌、结直肠癌时，FOBT均可阳性。据报道消化性溃疡时，其阳性率为40-70％；消化道癌症时，阳性率达95％。可见，对于CRC筛查，FOBT的敏感度不高。

随着技术上的快速发展，发现特定基因的表观遗传学改变可作为癌症早期检测的潜在候选生物标记，如DNA甲基化。基因启动子区域中CpG岛的异常甲基化与肿瘤抑制基因的表观遗传转录沉默有关，这在CRC的早期发展中至关重要。结合全基因组分析表明，表观遗传学改变比CRC的遗传学改变更为频繁，基因启动子甲基化状态因此已经成为CRC分子诊断的重要指标。

DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的重要性日益受到重视，其优势主要为：其一，在肿瘤形成过程中，启动子超甲基化的发生频率很高，甚至高于基因突变，其中不乏与肿瘤形成有关的重要基因；其二，甲基化是肿瘤发生早期的重要事；其三，DNA甲基化稳定存在，可通过PCR放大效应进行检测。因此，甲基化检测对结直肠癌的早期诊断有潜在的应用价值。

Septin 9基因定位于染色体17q25.3位置，Septin 9基因有18个转录本，涉及肌动蛋白动力学、血管生成、细胞迁移、细胞增殖、细胞形状和细胞分裂等多种细胞生理学过程。VIM(Vimentin)是一种蛋白质编码基因，该基因编码III型中间丝蛋白，是真核生物细胞的重要结构，参与细胞的粘附、迁移、生长、凋亡和免疫反应等。主要表达于胚胎组织和由间叶组织来源的成体细胞。

MGMT(O-6-Methylguanine-DNA Methyltransferase)基因编码的蛋白质是一种DNA修复蛋白质，参与细胞防御诱变和烷基化剂毒性的防御。该蛋白质催化DNA从O(6)-烷基鸟嘌呤和DNA的其他甲基化部分向其自身分子的甲基转移，从而修复了毒性损伤。其相关途径包括DNA损伤逆转和染色质调节/乙酰化。

SDC2(Syndecan 2)基因编码的蛋白质是跨膜(I型)硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，是Syndecan蛋白聚糖家族的成员。syndecan-2蛋白起着整体膜蛋白的作用，是膜蛋白不可或缺的一部分。并通过其细胞外基质蛋白的受体参与细胞增殖，细胞迁移和细胞-基质相互作用。

目前，结直肠癌甲基化早期检测的核酸组合物和试剂盒仍然具有操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，本发明解决这样的问题，最终间接为人结直肠癌的早期诊断提供有效的信息，为结直肠癌的早发现早治疗以及治疗效果监控提供一种简便易行的方法。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法，本发明发现的核酸组合物配置成的试剂盒具有操作简单、检测结直肠癌相关基因甲基化结果准确性高及敏感性高等优点。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的核酸组合物，包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针；

Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGCGATTCGTGTTTATTAG-3＇SEQ ID 01，

反向引物：5＇-CACCTTCGAAATCGAAA-3＇SEQ ID 02，

检测探针：5＇标记物-CGCGTTACGCGAAATCCGACATAAT-3＇标记物SEQ ID 03；

MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GATATGTTGGATAGTTCGC-3＇SEQ ID 04，

反向引物：5＇-GCACTCTCCGAAACGAAACG-3＇SEQ ID 05，

检测探针：5＇标记物-CGTTTTGCGTTGACGTTCGTAGGTTTTCGCGGT-3＇标记物SEQ ID06；

VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GGTCGAGTTTTATGGAGTTACGT-3＇SEQ ID 07，

反向引物：5＇-CCCGAAAACAAACTAAAAACTA-3＇SEQ ID 08，

检测探针：5＇标记物-CGTATTTAAGTTGGGTAGCGC-3＇标记物SEQ ID 09；

SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-AAATTAATAATGGAGGGCGTCGC-3＇SEQ ID 10，

反向引物：5＇-CGAAAACCGAACTGAAACTCGA-3＇SEQ ID 11，

检测探针：5＇标记物-TTTCGGGCGTAGTTGCGGCGGCGGGA-3＇标记物SEQ ID 12；

ACTB内参基因特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGATGAGGAGGTTTGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，

反向引物：5＇-GCACTCTCCGAAAACGAACG-3＇SEQ ID 14，

检测探针：5＇标记物-ACCACACCCAACACACAATACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15。

一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的试剂盒，包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR缓冲液，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本，Taq酶；

Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGCGATTCGTGTTTATTAG-3＇SEQ ID 01，

反向引物：5＇-CACCTTCGAAATCGAAA-3＇SEQ ID 02，

检测探针：5＇标记物-CGCGTTACGCGAAATCCGACATAAT-3＇标记物SEQ ID 03；

MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GATATGTTGGATAGTTCGC-3＇SEQ ID 04，

反向引物：5＇-GCACTCTCCGAAACGAAACG-3＇SEQ ID 05，

检测探针：5＇标记物-CGTTTTGCGTTGACGTTCGTAGGTTTTCGCGGT-3＇标记物SEQ ID06；

VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GGTCGAGTTTTATGGAGTTACGT-3＇SEQ ID 07，

反向引物：5＇-CCCGAAAACAAACTAAAAACTA-3＇SEQ ID 08，

检测探针：5＇标记物-CGTATTTAAGTTGGGTAGCGC-3＇标记物SEQ ID 09；

SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-AAATTAATAATGGAGGGCGTCGC-3＇SEQ ID 10，

反向引物：5＇-CGAAAACCGAACTGAAACTCGA-3＇SEQ ID 11，

检测探针：5＇标记物-TTTCGGGCGTAGTTGCGGCGGCGGGA-3＇标记物SEQ ID 12；

ACTB内参基因特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGATGAGGAGGTTTGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，

反向引物：5＇-GCACTCTCCGAAAACGAACG-3＇SEQ ID 14，

检测探针：5＇标记物-ACCACACCCAACACACAATACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15。

前述的一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的试剂盒，PCR反应液的成分终浓度为：1X PCR缓冲液、0.4～0.6μM Septin 9正向引物、0.4～0.6μM Septin 9反向引物、0.2～0.3μM Septin 9检测探针，0.4～0.6μM MGMT正向引物、0.4～0.6μM MGMT反向引物、0.2～0.3μM MGMT检测探针，0.4～0.6μM VIM正向引物、0.4～0.6μM VIM反向引物、0.2～0.3μMVIM检测探针，0.4～0.6μM SDC2正向引物、0.4～0.6μM SDC2反向引物、0.2～0.3μM SDC2检测探针，0.1～0.3μM ACTB正向引物、0.1～0.3μM ACTB反向引物、0.05～0.15μM ACTB检测探针，0.2～0.5mM dNTP、无核酸酶水、基因组DNA样本、0.05-0.2U/μlTaq酶。

前述的一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的试剂盒，阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA。

前述的一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的试剂盒，阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA。

一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测方法，包括如下步骤：

步骤一：抽提待检测样本的DNA，经过转化处理后的DNA作为PCR的模板的基因组DNA样本；

步骤二：使用用于检测结直肠癌相关基因甲基化检测的试剂盒对基因组DNA样本进行PCR扩增；

试剂盒包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR缓冲液，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本，Taq酶；

Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGCGATTCGTGTTTATTAG-3＇SEQ ID 01，

反向引物：5＇-CACCTTCGAAATCGAAA-3＇SEQ ID 02，

检测探针：5＇标记物-CGCGTTACGCGAAATCCGACATAAT-3＇标记物SEQ ID 03；

MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GATATGTTGGATAGTTCGC-3＇SEQ ID 04，

反向引物：5＇-GCACTCTCCGAAACGAAACG-3＇SEQ ID 05，

检测探针：5＇标记物-CGTTTTGCGTTGACGTTCGTAGGTTTTCGCGGT-3＇标记物SEQ ID06；

VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GGTCGAGTTTTATGGAGTTACGT-3＇SEQ ID 07，

反向引物：5＇-CCCGAAAACAAACTAAAAACTA-3＇SEQ ID 08，

检测探针：5＇标记物-CGTATTTAAGTTGGGTAGCGC-3＇标记物SEQ ID 09；

SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-AAATTAATAATGGAGGGCGTCGC-3＇SEQ ID 10，

反向引物：5＇-CGAAAACCGAACTGAAACTCGA-3＇SEQ ID 11，

检测探针：5＇标记物-TTTCGGGCGTAGTTGCGGCGGCGGGA-3＇标记物SEQ ID 12；

ACTB内参基因特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGATGAGGAGGTTTGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，

反向引物：5＇-GCACTCTCCGAAAACGAACG-3＇SEQ ID 14，

检测探针：5＇标记物-ACCACACCCAACACACAATACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15；

步骤三：根据Septin 9、MGMT、VIM、SDC2和ACTB基因扩增结果的荧光Ct值来确定待测样本是否发生甲基化。

前述的一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测方法，步骤一中，转化处理采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐。

前述的一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测方法，步骤二中，PCR扩增的反应程序为：变性95℃10min；循环45cycles，95℃15sec，60℃30sec(采集荧光)。

本发明的有益之处在于：

本发明发现Septin 9、MGMT、VIM、SDC2特异性的正向引物、特异性的反向引物以及特异性探针的核酸组合物在检测结直肠癌相关基因甲基化的敏感性和特异性上具有协同作用；

本发明使用基因ACTB作为内参基因对样本的质量进行控制，考虑到管家基因可能甲基化的情况，在设计内参引物和探针时选择不含有CpG位点的位置，针对其亚硫酸氢盐处理后的序列进行设计，保证管家基因对样本的质控；

本发明通过设计特异性高的引物和探针，并配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，再结合科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点，利用本发明试剂盒进行结直肠癌筛查时，阳性检出率(敏感性)为100％，阴性检出率(特异性)为80％，实现对结直肠癌相关基因甲基化程度快速及准确测量，以便对结直肠癌间接进行及时、有效的诊断和治疗，降低医疗成本，节约社会资源，提升生活品质。

附图说明

图1是本发明Septin 9基因甲基化阳性样本扩增曲线图；

图2是本发明MGMT基因甲基化阳性样本扩增曲线图；

图3是本发明VIM基因甲基化阳性样本扩增曲线图；

图4是本发明SDC2基因甲基化阳性样本扩增曲线图；

图5是本发明阴性样本扩增曲线图；

图6是本发明目的基因和内参基因均无扩增曲线的示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的检测方法，包括如下步骤：

步骤一：抽提待检测样本的DNA，经过转化处理后的DNA作为PCR的模板的基因组DNA样本；

转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐，采用亚硫酸氢盐处理后的序列进行设计，可以保证管家基因对样本的质控；这里的举例并非穷举，只要是能够对序列进行前处理的均适用于本发明。

步骤二：使用用于检测结直肠癌相关基因甲基化检测的试剂盒对基因组DNA样本进行PCR扩增；

作为一种优选，PCR扩增的反应程序为：变性95℃10min；循环45cycles，95℃15sec，60℃30sec(采集荧光)，需要说明的是：PCR的扩增程序并不受限制，只要能够对基因组DNA样本进行扩增的程序都适用于本发明；

试剂盒包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA，可使基因组所有CpG序列中的C在C5位置上甲基化；阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA；无模板对照表示不含有人类基因组DNA。

PCR反应液包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR缓冲液，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本，Taq酶；

作为一种实施例，PCR反应液的成分终浓度为：1X PCR缓冲液、0.4～0.6μM Septin9正向引物、0.4～0.6μM Septin 9反向引物、0.2～0.3μM Septin 9检测探针，0.4～0.6μMMGMT正向引物、0.4～0.6μM MGMT反向引物、0.2～0.3μM MGMT检测探针，0.4～0.6μM VIM正向引物、0.4～0.6μM VIM反向引物、0.2～0.3μM VIM检测探针，0.4～0.6μM SDC2正向引物、0.4～0.6μM SDC2反向引物、0.2～0.3μM SDC2检测探针，0.1～0.3μM ACTB正向引物、0.1～0.3μM ACTB反向引物、0.05～0.15μM ACTB检测探针，0.2～0.5mM dNTP、无核酸酶水、基因组DNA样本、0.05-0.2U/μlTaq酶；需要说明的是：反应液的试剂配方不受限制，这里提供的只是一种优选实施例，其他能够配合样本DNA扩增的反应液配方也适用于本发明。

Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGCGATTCGTGTTTATTAG-3＇SEQ ID 01，

反向引物：5＇-CACCTTCGAAATCGAAA-3＇SEQ ID 02，

检测探针：5＇标记物-CGCGTTACGCGAAATCCGACATAAT-3＇标记物SEQ ID 03，作为一种优选，5＇标记物为FAM，3＇标记物为BHQ1；

MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GATATGTTGGATAGTTCGC-3＇SEQ ID 04，

反向引物：5＇-GCACTCTCCGAAACGAAACG-3＇SEQ ID 05，

检测探针：5＇标记物-CGTTTTGCGTTGACGTTCGTAGGTTTTCGCGGT-3＇标记物SEQ ID06，作为一种优选，5＇标记物为VIC，3＇标记物为BHQ1；

VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GGTCGAGTTTTATGGAGTTACGT-3＇SEQ ID 07，

反向引物：5＇-CCCGAAAACAAACTAAAAACTA-3＇SEQ ID 08，

检测探针：5＇标记物-CGTATTTAAGTTGGGTAGCGC-3＇标记物SEQ ID 09，作为一种优选，5＇标记物为ROX，3＇标记物为BHQ2；

SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-AAATTAATAATGGAGGGCGTCGC-3＇SEQ ID 10，

反向引物：5＇-CGAAAACCGAACTGAAACTCGA-3＇SEQ ID 11，

检测探针：5＇标记物-TTTCGGGCGTAGTTGCGGCGGCGGGA-3＇标记物SEQ ID 12，作为一种优选，5＇标记物为TAMRA，3＇标记物为BHQ2；

ACTB内参基因特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGATGAGGAGGTTTGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，

反向引物：5＇-GCACTCTCCGAAAACGAACG-3＇SEQ ID 14，

检测探针：5＇标记物-ACCACACCCAACACACAATACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15，作为一种优选，5＇标记物为CY5，3＇标记物为BHQ2；

备注：引物的纯度应达PAGE或HPLC级。

BHQ1、BHQ2作为淬灭标记基团只是一种优选，荧光标记物也只是一种优选，只要是可以用于标记的产品都可以应用于本发明。

步骤三：根据Septin 9、MGMT、VIM、SDC2和ACTB基因扩增结果的荧光Ct值来确定待测样本是否发生甲基化。

这里需要强调的是：本发明的检测方法不受限制，只要是运用了本发明的核酸组合物的检测方法都在本发明的保护范围内，这里不一一列举。

以下通过实验验证本发明的技术效果：

(一)先使用以下步骤制备用于实验的试剂盒。

一、材料：用于检测结直肠癌相关基因甲基化的试剂盒，其中包括：Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物；Septin 9基因特异的水解探针；MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物；MGMT基因特异的水解探针；VIM基因目的位点的甲基化特异性引物；VIM基因特异的水解探针；SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物；SDC2基因特异的水解探针；ACTB内参基因的引物；ACTB内参基因的水解探针；

Septin 9基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGCGATTCGTTGTTTATTAG-3＇(SEQ ID NO.1)

反向引物：5＇-CACCTTCGAAATCCGAAA-3＇(SEQ ID NO.2)

检测探针：5＇FAM-CGCGTTAACCGCGAAATCCGACATAAT-3＇BHQ1(SEQ ID NO.3)

MGMT基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GATATGTTGGGATAGTTCGC-3＇(SEQ ID NO.4)

反向引物：5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇(SEQ ID NO.5)

检测探针：5＇VIC-CGTTTTGCGTTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGCGGT-3＇BHQ1(SEQ IDNO.6)

VIM基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GGTCGAGTTTTAGTCGGAGTTACGT-3＇(SEQ ID NO.7)

反向引物：5＇-CCCGAAAACGAAACGTAAAAACTA-3＇(SEQ ID NO.8)

检测探针：5＇ROX-CGTATTTATAGTTTGGGTAGCGC-3＇BHQ2(SEQ ID NO.9)

SDC2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-AAATTAATAAGTGAGAGGGCGTCGC-3＇(SEQ ID NO.10)

反向引物：5＇-CGAAAACTCGAACTCGAAACTCGA-3＇(SEQ ID NO.11)

检测探针：5＇TAMRA-TTTCGGGGCGTAGTTGCGGGCGGCGGGA-3＇BHQ2(SEQ ID NO.12)

ACTB内参基因目特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT-3＇(SEQ ID NO.13)

反向引物：5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇(SEQ ID NO.14)

检测探针：5＇CY5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3＇BHQ2(SEQ ID NO.15)

二、阳性质控品和阴性质控品选择：

阳性质控品、阴性质控品。阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA，可使基因组中所有CpG序列中的C在C5位置上甲基化；阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA；

三、PCR反应液组成：

包括含有上述特异性引物及探针的PCR反应液，PCR反应液包括：

Septin 9正向引物：5＇-CGCGATTCGTTGTTTATTAG-3＇

Septin 9反向引物：5＇-CACCTTCGAAATCCGAAA-3＇

Septin 9检测探针：5＇FAM-CGCGTTAACCGCGAAATCCGACATAAT-3＇BHQ1

MGMT正向引物：5＇-GATATGTTGGGATAGTTCGC-3＇

MGMT反向引物：5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇

MGMT检测探针：5＇VIC-CGTTTTGCGTTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGCGGT-3＇BHQ1

VIM正向引物：5＇-GGTCGAGTTTTAGTCGGAGTTACGT-3＇

VIM反向引物：5＇-CCCGAAAACGAAACGTAAAAACTA-3＇

VIM检测探针：5＇ROX-CGTATTTATAGTTTGGGTAGCGC-3＇BHQ2

SDC2正向引物：5＇-AAATTAATAAGTGAGAGGGCGTCGC-3＇

SDC2反向引物：5＇-CGAAAACTCGAACTCGAAACTCGA-3＇

SDC2检测探针：5＇TAMRA-TTTCGGGGCGTAGTTGCGGGCGGCGGGA-3＇BHQ2

ACTB正向引物：5＇-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT-3＇

ACTB反向引物：5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇

ACTB检测探针：5＇CY5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3＇BHQ2

2X PCR缓冲液，Taq酶，dNTP及无核酸酶水。均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

PCR反应液成分的终浓度为：

1X PCR缓冲液、0.6μM(μmol/L)Septin 9正向引物、0.6μM(μmol/L)Septin 9反向引物、0.3μM(μmol/L)Septin 9检测探针，0.6μM(μmol/L)MGMT正向引物、0.6μM(μmol/L)MGMT反向引物、0.3μM(μmol/L)MGMT检测探针，0.6μM(μmol/L)VIM正向引物、0.6μM(μmol/L)VIM反向引物、0.3μM(μmol/L)VIM检测探针，0.6μM(μmol/L)SDC2正向引物、0.6μM(μmol/L)SDC2反向引物、0.3μM(μmol/L)SDC2检测探针，0.2μM(μmol/L)ACTB正向引物、0.2μM(μmol/L)ACTB反向引物、0.1μM(μmol/L)ACTB检测探针，0.25mM(mmol/L)dNTP。

(二)利用上文制备得到的试剂盒样品进行结直肠癌相关基因甲基化的检测：

一、技术原理

通过在人基因组中结直肠癌相关基因和内参基因的启动子区设计一对特异性引物和探针。然后使用该引物及探针去扩增经亚硫酸氢盐转化的样本DNA,根据相关基因的PCR扩增结果的相对荧光值Ct值来确定待测样本的是否发生甲基化，根据甲基化来间接判定结直肠癌的风险。

二、检测方法

步骤一：待测样本NDA的抽提，并对其进行亚硫酸氢盐转化处理，转化后的DNA作为PCR的模板进行qPCR扩增。

其中，转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐，及其他辅助试剂(相应试剂购自于德国QIAGEN公司的Epitect Fast Bisulfite Conversion Kit)；

步骤二：提供上述用于结直肠癌相关基因甲基化检测的试剂盒，并对模板进行PCR扩增；

步骤三：根据相关基因的PCR扩增结果的相对荧光值Ct来确定待检测样本是否发生甲基化；

具体的检测方法，如下：

一)血浆分离

1、利用游离DNA采样管抽取10ml外周血，到达实验室后第一时间进行血浆分离工作。

2、4℃，1600rpm离心力离心20min，取血浆分装到无菌离心管内。

3、初步分离后的血浆在4℃条件下以16,000rpm离心10min，以去除残余细胞。离心结束后将血浆分装到无菌离心管内。

二)提取血浆DNA：

DNA抽提试剂盒购自于济凡生物科技(北京)有限公司:

1、取2ml的血浆样本，按照以下体系加入相应的试剂量如表1所示：

表1

2、样本和试剂充分混匀后，室温孵育20min，期间每3-5min上下颠倒混匀10sec，使磁珠和核酸充分结合。孵育结束后简短离心去除管壁内壁的液滴；

3、离心管放置于磁力加上静置2min，待磁珠完全吸附时小心去除液体，取下离心管；

4、加入1ml缓冲液RBP，振荡混匀1min，使磁珠充分悬浮，简短离心以去除内壁的滴液；

5、将离心管放置于磁力加上静置1min，待磁珠完全吸附时小心去除液体，取下离心管；

6、加入1ml的80％的乙醇(现配现用)，每次振荡混匀1min，使磁珠充分悬浮，简短离心以去除内壁的滴液。

7、将离心管放置于磁力加上静置1min，待磁珠完全吸附时小心去除液体，取下离心管。

8、重复步骤6-7一次，共计2次乙醇洗脱。

9、将离心管放置于磁力加上，室温晾干5–10min。

10、将离心管从磁力加上取下，加入45μl缓冲液EB，震荡混匀使磁珠悬浮，56℃孵育5min，期间每2min轻轻晃动离心管，使核酸充分吸脱，后可短暂离心以去除管壁及管盖上的液体。

11、将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至1.5ml收集管中，并于适当条件保存。

12、取1μl的DNA洗脱液进行Qubit HS浓度测定，并记录数据结果，剩余样本如不继续进行实验保存在-20℃冰箱。

三)DNA转化流程：

1、将提取的DNA按照以下配方配置亚硫酸氢盐的转化体系如表2所示：

表2

2、转化体系配置完成后，按照以下反应条件，置于PCR仪中反应，反应程序如表3所示；

表3

3、亚硫酸氢盐转化后的DNA纯化：

4、瞬离PCR管，将亚硫酸氢盐转化后的产物转移至1.5ml的EP管中。

5、向每个样品中加310μl的缓冲液BL试剂

6、向每个样品中加250μl的无水乙醇，涡旋混匀溶液15秒，并短暂离心

7、将混合物转移到离心柱中,14000rpm离心1min

8、弃滤液，加500μl的缓冲液BW,14000rpm离心1min

9、弃滤液，加500μl的缓冲液BD静止孵育15min，14000rpm离心1min

10、弃滤液，加500μl的缓冲液BW，14000rpm离心1min

11、重复步骤10

12、弃滤液，加250μl的无水乙醇，14000rpm离心1min

13、弃滤液，14000rpm空离1min

14、室温下干燥3-5min去除残留乙醇；

15、加15μl缓冲液EB室温孵育洗脱1min，14000rpm离心1min，收集的DNA保存于-20℃。

四)qPCR反应配置

1、qPCR仪器为美国ABI 7500型实时荧光定量PCR系统(购自于life technology公司)，反应体系为20μl

2、qPCR反应体系配置及条件，如下表4所示：

表4

3、PCR反应加样布局：

待测DNA样本、阳性质控品、阴性质控品和无模板对照均进行3个平行检测检测，PCR仪的96孔加样布局见下表5所示。表中PC代表阳性质控品(Positive Control)，NC代表阴性质控品(Negative Control)，NTC代表无模板对照(No Template Control)，S代表检测样本(sample)

表5

4、PCR反应程序如下表6：

表6

5、检测结果分析

1)运行无模板对照(NTC)的扩增曲线分析，应无扩增曲线，说明实验无污染，可以继续分析；

2)质控品的内参基因(ACTB)应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，内参Ct值应符合下表7的结果；阴性质控品的目的基因应无扩增曲线升起，阳性质控品目的基因的Ct值应符合下表，质控品检测满足以下条件时，证明实验有效，可继续分析；

表7

3)样品的内参基因均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，样品PCR检测结果应按照下表8进行判读；

表8

基于本发明的具体实验数据参见图1-图6，其中，图1为Septin 9基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图2为MGMT基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图3为VIM基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图4为SDC2基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图5为阴性样本扩增曲线图，可以看出不同甲基化样本结直肠癌相关甲基化基因与ACTB内参基因的扩增曲线关系，如果目的基因和内参基因均无扩增曲线,见图6，表示该样本不合格需要重复检测或者重新采样。

(三)利用上文的试剂盒样品进行结直肠癌、正常人血浆的灵敏度和特异性检测：

以20例正常人和20例结直肠癌患者的血浆样本为监测对象。提取各样本的游离DNA。DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段进行，具体而言，在本案例中，所用的样本DNA是通过使用具体的提取方案按照案例2中的检测体系进行提取。

然后将DNA样本进行预处理使得5’位未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。在本实验案例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用案例2中的检测体系进行转化预处理的。

然后，将上述的预处理的20正常人和20例结直肠癌的DNA样本中加入上述案例2中的检测体系，多元化的检测Septin 9、MGMT、SDC2、VIM和内参基因ACTB。在亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，在实验案例中采用的PCR条件按照案例2中的qPCR条件进行。

最后，下表9和表10显示的是使用本发明的多重测定对20例正常人和20例结直肠癌患者样本进行检测的结果。由表9和表10可见，本方案的阳性检测率和阴性检测率很高。

表9 利用本发明试剂盒对结直肠癌患者血浆样本的检测结果

表10 利用本发明试剂盒对正常人血浆样本的检测结果

根据上表的检测结果，利用本发明试剂盒进行结直肠癌筛查时，其阳性检出率(敏感性)为100％，阴性检出率(特异性)为80％。

由以上验证实验可知：Septin 9、MGMT、VIM、SDC2特异性的正向引物、特异性的反向引物以及特异性探针的核酸组合物在检测结直肠癌相关基因甲基化的敏感性和特异性上具有协同作用，将Septin 9、MGMT、VIM、SDC2的特异性的正向引物、特异性的反向引物以及特异性探针组合在一起进行检测结直肠癌甲基化是一个创新性的发现，并非机械化的实验可以得到的结果。

本发明并非以诊断疾病为目的，且得到的检测也无法直接判断是否具有疾病，间接为人结直肠癌的早期诊断提供有效信息，为人结直肠癌早发现早治疗提供一种简便易行的方法。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 杭州圣庭医疗科技有限公司

<120> 一种用于检测结直肠癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法

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<213> Artificial Sequence

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