一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法

摘要

本发明公开了一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法；核酸组合物，包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针；本发明发现的核酸组合物配置成的试剂盒具有检测检测肺癌相关基因甲基化结果准确、时效性快，检测通量高、特异性好、敏感性好等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法。

背景技术

肺癌已经成为人类癌症死亡的主要原因之一。在中国肺癌是发病率最高的癌症，且发病率和死亡率逐年增长。肺癌的发生率和死亡率是所有肿瘤中最高的，但是肺癌却不是诊断的最多的肿瘤，在美国，乳腺肿瘤和前列腺肿瘤有更高的诊断率，而且早期诊断使早期治疗得以实现，大大提高了5年生存率(分别为89和99％)；与之对应的肺癌的5年生存率才15％。目前1期肺癌5年总体生存率可达80％，如果及早发现早治疗，肺癌患者5年生存率将会大大提高。

遗憾的是在临床实践中，肺癌早期诊断一直是难点。目前对癌症的诊断主要依据临床症状、影像学检测和组织病理学检查等，但有许多癌症临床症状出现较晚，并且活体取样检测也困难，严重影响了癌症的早期诊断和病人的预后。具最新研究表明：癌细胞的DNA普遍存在着的反常甲基化，而一部分来自于癌细胞小片段DNA(ctDNA)会进入到外周循环血中。这些来自于癌细胞的携带反常甲基化小片段DNA可以用做肿瘤的早筛和检测。事实上，利用ctDNA的反常甲基化进行的肿瘤的早筛和检测已经成为国际国内研发热点。

DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的优势主要为：(1)肿瘤细胞相对于同类组织的正常细胞，DNA甲基化位点改变较多；(2)肿瘤DNA反常甲基化在肿瘤发生过程中出现较早；(3)DNA甲基化比较稳定。因此，甲基化检测对肺癌的早期筛查和诊断有很大的应用价值。

吸烟是引起肺癌的原因之一，在正常吸烟人群的呼吸道中发现了几种在人类肺癌中经常出现的基因异常。其中，研究较多的是CDKN2Ap16基因异常甲基化。对正常吸烟人群痰标本中的脱落细胞进行检测时，发现p16基因异常甲基化频率较高，而正常非吸烟人群痰标本中则没有发现该变化，说明这一基因改变可能与早期呼吸道肿瘤发生过程密切相关。痰液中相关基因启动子甲基化程度随着肿瘤危险性增高而增高，而CDKN2A/p16和/或CDKN2A基因在明确肺鳞癌诊断的3年前已可以在痰中检出。目前，有很多研究检测血液、痰液、肺泡灌洗液中的细胞或DNA甲基化状态，以期找到用于肺癌早期诊断的标志物。。

SHOX2(Short Stature Homeobox 2)，译为“矮小同源盒基因”，是同源盒基因家族的一员，为转录调控因子，其基因表达调控与器官发育密切相关。研究发现，SHOX2基因在胚胎时期表达于中胚层和外胚层，对骨骼、心脏和神经系统的发育起到重要作用。另外，SHOX2基因甲基化与肺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌等恶性疾病有关；且目前SHOX2基因甲基化已应用于临床检测，其在肺癌诊断、鉴别中的作用日渐明确。SHOX2不仅可以作为肺癌早期检测的标志物，而且其甲基化还可以作为非小细胞肺癌(NSCLC)预后的独立预测指标。

RASSF1A(Ras Association Domain Family Member 1)基因编码类似于RAS效应蛋白的蛋白质，是潜在的肿瘤抑制因子。RASSF1A调控的靶基因涉及基因转录、信号转导、细胞骨架、细胞周期、细胞黏附及调亡等多方面内容，具有广泛的生物学作用。而RASSF1A作为一种新型肿瘤抑制基因，其在肿瘤发生及发展过程中的作用尤为重要。目前认为，RASSF1A基因表达失活主要与启动子区异常的高甲基化、杂合性缺失及染色体缺失有关。人类肿瘤中RASSF1A基因失活的频率非常高。例如，RASSF1A基因在70％以上的小细胞肺癌，91％的肾细胞癌，62％的膀胱癌，71％的甲状腺癌，84％的鼻咽癌及70％以上的前列腺癌等中处于高甲基化状态进而失活。

PTGER4(Prostaglandin E Receptor 4)基因编码G蛋白偶联受体家族的成员，该蛋白是为前列腺素E2(PGE2)鉴定的四个受体之一。该受体可以激活T细胞因子信号传导。它已被证明可以介导PGE2诱导的早期生长反应1(EGR1)的表达，调节环氧合酶2mRNA的水平和稳定性，并导致糖原合酶激酶3的磷酸化。其相关途径包括类二十烷酸配体结合受体和GPCR信号转导。PTGER4的活性由刺激腺苷酸环化酶的G(s)蛋白介导。对平滑肌有松弛作用。可能在调节肾脏血液动力学，肠上皮运输，肾上腺醛固酮分泌和子宫功能中起重要作用。与PTGER4相关的疾病包括恶性上皮间皮瘤和阴茎基底细胞癌。在小鼠中进行的基因敲除研究表明，该受体可能与循环系统的新生儿适应，骨质疏松以及皮肤免疫反应的启动有关。

CDKN2A(Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 2A，P16)基因家族及其相关因子所组成的庞大调控体系是细胞周期最关键的调节通路之一，与其他正负调控因子协调合作，决定着细胞周期的正常运转和细胞增殖、分化、老化及调亡，并与多种人类肿瘤的发生、发展、治疗与预后密切相关。在大多数情况下，CDKN2A通过纯合缺失而失活。CDKN2A可能发生失活的机制之一是该基因启动子区域的甲基化。

目前，肺癌甲基化早期检测仍然无法找到一种结果准确、时效性快，检测通量高、特异性好、敏感性好的核酸组合物和试剂盒，本发明解决这样的问题，能够间接为人肺癌的早期诊断提供有效的信息，为肺癌的早发现早治疗以及治疗效果监控提供一种简便易行的方法。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法，本发明发现的核酸组合物配置成的试剂盒具有检测检测肺癌相关基因甲基化结果准确、时效性快，检测通量高、特异性好、敏感性好等优点。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物，包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针；

RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGGGGTCGTTTTTGGTTTC-3＇SEQ ID 01，

反向引物：5＇-CCGATAAATCCGTATTCGC-3＇SEQ ID 02，

检测探针：5＇标记物-TCGCTTTGTTACGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03；

CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-ACGTCTGAGCGATGTTC-3＇SEQ ID 04，

反向引物：5＇-TACCACGCTAACTCTACGAA-3＇SEQ ID 05，

检测探针：5＇标记物-CTTCGACTAATACCCCGAAA-3＇标记物SEQ ID 06；

PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TGAGACGGTTTTGGAAGTC-3＇SEQ ID 07，

反向引物：5＇-ATCTCACCATAACGACAAAACG-3＇SEQ ID 08，

检测探针：5＇标记物-ACCCCCAAATCAACCTCAAATATCCTAA-3＇标记物SEQ ID 09；

SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TCGTCGCGTTTTCGTTTTTTC-3＇SEQ ID10，

反向引物：5＇-CGACCGCTACACCAAACGA-3＇SEQ ID 11，

检测探针：5＇标记物-CGTCGTTTTGTCGGTCGTCGGATTGTC-3＇标记物SEQ ID 12；

ACTB内参基因特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGAGGAGGAGGTTAGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，

反向引物：5＇-GCACTTTCCGAAAACGAACG-3＇SEQ ID 14，

检测探针：5＇标记物-ACCACCCCCAACACACAATACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15。

一种用于检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR buffer，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本，Taq酶；

RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGGGGTCGTTTTTGGTTTC-3＇SEQ ID 01，

反向引物：5＇-CCGATAAATCCGTATTCGC-3＇SEQ ID 02，

检测探针：5＇标记物-TCGCTTTGTTACGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03；

CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-ACGTCTGAGCGATGTTC-3＇SEQ ID 04，

反向引物：5＇-TACCACGCTAACTCTACGAA-3＇SEQ ID 05，

检测探针：5＇标记物-CTTCGACTAATACCCCGAAA-3＇标记物SEQ ID 06；

PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TGAGACGGTTTTGGAAGTC-3＇SEQ ID 07，

反向引物：5＇-ATCTCACCATAACGACAAAACG-3＇SEQ ID 08，

检测探针：5＇标记物-ACCCCCAAATCAACCTCAAATATCCTAA-3＇标记物SEQ ID 09；

SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TCGTCGCGTTTTCGTTTTTTC-3＇SEQ ID10，

反向引物：5＇-CGACCGCTACACCAAACGA-3＇SEQ ID 11，

检测探针：5＇标记物-CGTCGTTTTGTCGGTCGTCGGATTGTC-3＇标记物SEQ ID 12；

ACTB内参基因特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGAGGAGGAGGTTAGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，

反向引物：5＇-GCACTTTCCGAAAACGAACG-3＇SEQ ID 14，

检测探针：5＇标记物-ACCACCCCCAACACACAATACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15。

前述的一种用于检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，PCR反应液的成分终浓度为：1X PCR buffer、0.4～0.6μM RASSF1A正向引物、0.4～0.6μM RASSF1A反向引物、0.2～0.3μMRASSF1A检测探针、0.4～0.6μM CDKN2A正向引物、0.4～0.6μM CDKN2A反向引物、0.2～0.3μM CDKN2A检测探针、0.4～0.6μM PTGER4正向引物、0.4～0.6μM PTGER4反向引物、0.2～0.3μM PTGER4检测探针、0.4～0.6μM SHOX2正向引物、0.4～0.6μM SHOX2反向引物、0.2～0.3μM SHOX2检测探针、0.1～0.3μM ACTB正向引物、0.1～0.3μM ACTB反向引物、0.05～0.15μM ACTB检测探针、0.2～0.5mM dNTP、无核酸酶水、基因组DNA样本、0.05-0.2U/μlTaq酶。

前述的一种用于检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA。

前述的一种用于检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA。

前述的一种用于检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，无模板对照为不含有人类基因组DNA。

一种用于检测肺癌相关基因甲基化的检测方法，包括如下步骤：

步骤一：抽提待检测样本的DNA，经过转化处理后的DNA作为PCR的模板的基因组DNA样本；

步骤二：使用用于检测肺癌相关基因甲基化检测的试剂盒对基因组DNA样本进行PCR扩增；

试剂盒包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR buffer，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本，Taq酶；

RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGGGGTCGTTTTTGGTTTC-3＇SEQ ID 01，

反向引物：5＇-CCGATAAATCCGTATTCGC-3＇SEQ ID 02，

检测探针：5＇标记物-TCGCTTTGTTACGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03；

CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-ACGTCTGAGCGATGTTC-3＇SEQ ID 04，

反向引物：5＇-TACCACGCTAACTCTACGAA-3＇SEQ ID 05，

检测探针：5＇标记物-CTTCGACTAATACCCCGAAA-3＇标记物SEQ ID 06；

PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TGAGACGGTTTTGGAAGTC-3＇SEQ ID 07，

反向引物：5＇-ATCTCACCATAACGACAAAACG-3＇SEQ ID 08，

检测探针：5＇标记物-ACCCCCAAATCAACCTCAAATATCCTAA-3＇标记物SEQ ID 09；

SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TCGTCGCGTTTTCGTTTTTTC-3＇SEQ ID10，

反向引物：5＇-CGACCGCTACACCAAACGA-3＇SEQ ID 11，

检测探针：5＇标记物-CGTCGTTTTGTCGGTCGTCGGATTGTC-3＇标记物SEQ ID 12；

ACTB内参基因特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGAGGAGGAGGTTAGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，

反向引物：5＇-GCACTTTCCGAAAACGAACG-3＇SEQ ID 14，

检测探针：5＇标记物-ACCACCCCCAACACACAATACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15；

步骤三：根据RASSF1A、CDKN2A、PTGER4、SHOX2和ACTB基因扩增结果的荧光Ct值来确定待测样本是否发生甲基化。

前述的一种用于检测肺癌相关基因甲基化的检测方法，步骤一中，转化处理采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐。

前述的一种用于检测肺癌相关基因甲基化的检测方法，步骤二中，PCR扩增的反应程序为：变性95℃10min；循环45cycles，95℃15sec，60℃30sec。

本发明的有益之处在于：

本发明发现RASSF1A、CDKN2A、SHOX2和PTGER4特异性的正向引物、特异性的反向引物以及特异性探针的核酸组合物在检测肺癌相关基因甲基化的敏感性和特异性上具有协同作用；

本发明使用基因ACTB作为内参基因对样本的质量进行控制，考虑到管家基因可能甲基化的情况，在设计内参引物和探针时选择不含有CpG位点的位置，针对其亚硫酸氢盐处理后的序列进行设计，保证管家基因对样本的质控；

本发明通过设计特异性高的引物和探针，并配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，再结合科学合理的PCR反应体系，使得本发明具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点，利用本发明试剂盒进行肺癌筛查时，阳性检出率(敏感性)为100％，阴性检出率(特异性)为90％，实现对肺癌相关基因甲基化程度快速及准确测量，以便对肺癌间接进行及时、有效的诊断和治疗，降低医疗成本，节约社会资源，提升生活品质。

附图说明

图1是本发明RASSF1A基因甲基化阳性样本扩增曲线图；

图2是本发明CDKN2A基因甲基化阳性样本扩增曲线图；

图3是本发明PTGER4基因甲基化阳性样本扩增曲线图；

图4是本发明SHOX2基因甲基化阳性样本扩增曲线图；

图5是本发明阴性样本扩增曲线图；

图6是本发明目的基因和内参基因均无扩增的曲线示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一种用于检测肺癌相关基因甲基化的检测方法，包括如下步骤：

步骤一：抽提待检测样本的DNA，经过转化处理后的DNA作为PCR的模板的基因组DNA样本；

转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐，采用亚硫酸氢盐处理后的序列进行设计，可以保证管家基因对样本的质控；这里的举例并非穷举，只要是能够对序列进行前处理的均适用于本发明。

步骤二：使用用于检测肺癌相关基因甲基化检测的试剂盒对基因组DNA样本进行PCR扩增，作为一种优选，PCR扩增的反应程序为：变性95℃10min；循环45cycles，95℃15sec，60℃30sec，需要说明的是：PCR的扩增程序并不受限制，只要能够对基因组DNA样本进行扩增的程序都适用于本发明；

试剂盒包括：PCR反应液，阴性质控品，阳性质控品和无模板对照；PCR反应液包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针，ACTB内参基因的特异性引物和探针，2X PCR buffer，dNTP，无核酸酶水，基因组DNA样本，Taq酶。

作为一种优选，阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA，阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA，无模板对照表示不含有人类基因组DNA。

作为一种实施例，PCR反应液的成分终浓度为：1X PCR buffer、0.4～0.6μMRASSF1A正向引物、0.4～0.6μM RASSF1A反向引物、0.2～0.3μM RASSF1A检测探针、0.4～0.6μMCDKN2A正向引物、0.4～0.6μM CDKN2A反向引物、0.2～0.3μM CDKN2A检测探针、0.4～0.6μM PTGER4正向引物、0.4～0.6μM PTGER4反向引物、0.2～0.3μM PTGER4检测探针、0.4～0.6μM SHOX2正向引物、0.4～0.6μM SHOX2反向引物、0.2～0.3μM SHOX2检测探针、0.1～0.3μMACTB正向引物、0.1～0.3μM ACTB反向引物、0.05～0.15μM ACTB检测探针、0.2～0.5mM dNTP、无核酸酶水、基因组DNA样本、0.05-0.2U/μlTaq酶，需要说明的是：反应液的试剂配方不受限制，这里提供的只是一种优选实施例，其他能够配合样本DNA扩增的反应液配方也适用于本发明。

RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGGGGTCGTTTTTGGTTTC-3＇SEQ ID 01，

反向引物：5＇-CCGATAAATCCGTATTCGC-3＇SEQ ID 02，

检测探针：5＇标记物-TCGCTTTGTTACGTTTAAAGT-3＇标记物SEQ ID 03，作为一种优选，5＇标记物为FAM，3＇标记物为BHQ1；

CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-ACGTCTGAGCGATGTTC-3＇SEQ ID 04，

反向引物：5＇-TACCACGCTAACTCTACGAA-3＇SEQ ID 05，

检测探针：5＇标记物-CTTCGACTAATACCCCGAAA-3＇标记物SEQ ID 06，作为一种优选，5＇标记物为ROX，3＇标记物为BHQ2；

PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TGAGACGGTTTTGGAAGTC-3＇SEQ ID 07，

反向引物：5＇-ATCTCACCATAACGACAAAACG-3＇SEQ ID 08，

检测探针：5＇标记物-ACCCCCAAATCAACCTCAAATATCCTAA-3＇标记物SEQ ID 09，作为一种优选，5＇标记物为TAmRA，3＇标记物为BHQ2；

SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TCGTCGCGTTTTCGTTTTTTC-3＇SEQ ID10，

反向引物：5＇-CGACCGCTACACCAAACGA-3＇SEQ ID 11，

检测探针：5＇标记物-CGTCGTTTTGTCGGTCGTCGGATTGTC-3＇标记物SEQ ID 12，作为一种优选，5＇标记物为VIC，3＇标记物为BHQ1；

ACTB内参基因特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGAGGAGGAGGTTAGTAAGTT-3＇SEQ ID 13，

反向引物：5＇-GCACTTTCCGAAAACGAACG-3＇SEQ ID 14，

检测探针：5＇CY5-ACCACCCCCAACACACAATACAAACACA-3＇标记物SEQ ID 15，作为一种优选，5＇标记物为CY5，标记物为BHQ2；

备注：引物的纯度应达PAGE或HPLC级。

BHQ1、BHQ2作为淬灭标记基团只是一种优选，荧光标记物也只是一种优选，只要是可以用于标记的产品都可以应用于本发明。

步骤三：根据RASSF1A、CDKN2A、PTGER4、SHOX2和ACTB基因扩增结果的荧光Ct值来确定待测样本是否发生甲基化。

这里需要强调的是：本发明的检测方法不受限制，只要是运用了本发明的核酸组合物的检测方法都在本发明的保护范围内，这里不一一列举。

以下通过实验验证本发明的技术效果：

(一)先使用以下步骤制备用于实验的试剂盒。

一、材料：用于检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，其中包括：RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和水解探针；CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和水解探针；PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和水解探针；SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和水解探针；ACTB内参基因的引物和水解探针；

RASSF1A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-CGGGGTTCGTTTTGTGGTTTC-3＇(SEQ ID NO.1)

反向引物：5＇-CCGATTAAATCCGTACTTCGC-3＇(SEQ ID NO.2)

检测探针：5＇FAM-TCGCGTTTGTTAGCGTTTAAAGT-3＇BHQ1(SEQ ID NO.3)

CDKN2A基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-ACGTCGTGAGCGAGTGTTC-3＇(SEQ ID NO.4)

反向引物：5＇-TACCAACGCTAACTCTAACGAA-3＇(SEQ ID NO.5)

检测探针：5＇ROX-CTTCCGACTAATACCCCCGAAA-3＇BHQ2(SEQ ID NO.6)

PTGER4基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TGAGATCGGTTTTGAGAAGTC-3＇(SEQ ID NO.7)

反向引物：5＇-ATCTCACCTATAACGACAACAACG-3＇(SEQ ID NO.8)

检测探针：5＇TAMRA-ACCCCCAAAATCAACCCTCAAATATCCTAA-3＇BHQ2(SEQ ID NO.9)

SHOX2基因目的位点的甲基化特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-TCGTCGTCGTTTTCGTTTTTTTC-3＇(SEQ ID NO.10)

反向引物：5＇-CGACCGACTACACCGAAACGA-3＇(SEQ ID NO.11)

检测探针：5＇VIC-CGTCGTTTTCGTCGGTCGTTCGGATTGTC-3＇BHQ1(SEQ ID NO.12)

ACTB内参基因特异性引物和探针包括：

正向引物：5＇-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT-3＇(SEQ ID NO.13)

反向引物：5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇(SEQ ID NO.14)

检测探针：5＇CY5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3＇BHQ2(SEQ ID NO.15)

二、阳性质控品和阴性质控品选择：

阳性质控品、阴性质控品。阳性质控品为经SssI甲基化酶处理的Hct116细胞系的基因组DNA，可使基因组中所有CpG序列中的C在C5位置山甲基化；阴性质控品为敲除了基因DNMT1和DNMT3b后的Hct116细胞系的基因组DNA；

三、PCR反应液组成：

包括含有上述特异性引物及探针的PCR反应液，PCR反应液包括：

RASSF1A正向引物：5＇-CGGGGTTCGTTTTGTGGTTTC-3＇

RASSF1A反向引物：5＇-CCGATTAAATCCGTACTTCGC-3＇

RASSF1A检测探针：5＇FAM-TCGCGTTTGTTAGCGTTTAAAGT-3＇BHQ1

CDKN2A正向引物：5＇-ACGTCGTGAGCGAGTGTTC-3＇

CDKN2A反向引物：5＇-TACCAACGCTAACTCTAACGAA-3＇

CDKN2A检测探针：5＇ROX-CTTCCGACTAATACCCCCGAAA-3＇BHQ2

PTGER4正向引物：5＇-TGAGATCGGTTTTGAGAAGTC-3＇

PTGER4反向引物：5＇-ATCTCACCTATAACGACAACAACG-3＇

PTGER4检测探针：5＇TAMRA-ACCCCCAAAATCAACCCTCAAATATCCTAA-3＇BHQ2

SHOX2正向引物：5＇-TCGTCGTCGTTTTCGTTTTTTTC-3＇

SHOX2反向引物：5＇-CGACCGACTACACCGAAACGA-3＇

SHOX2检测探针：5＇VIC-CGTCGTTTTCGTCGGTCGTTCGGATTGTC-3＇BHQ1

ACTB正向引物：5＇-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT-3＇

ACTB反向引物：5＇-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3＇

ACTB检测探针：5＇CY5-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3＇BHQ2

2X PCR buffer，Taq酶，dNTP及无核酸酶水。均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

PCR反应液成分的终浓度为：

1X PCR buffer、0.6μM(μmol/L)RASSF1A正向引物、0.6μM(μmol/L)RASSF1A反向引物、0.3μM(μmol/L)RASSF1A检测探针，0.6μM(μmol/L)SHOX2正向引物、0.6μM(μmol/L)SHOX2反向引物、0.3μM(μmol/L)SHOX2检测探针，0.6μM(μmol/L)CDKN2A正向引物、0.6μM(μmol/L)CDKN2A反向引物、0.3μM(μmol/L)CDKN2A检测探针，0.6μM(μmol/L)PTGER4正向引物、0.6μM(μmol/L)PTGER4反向引物、0.3μM(μmol/L)PTGER4检测探针，0.2μM(μmol/L)ACTB正向引物、0.2μM(μmol/L)ACTB反向引物、0.1μM(μmol/L)ACTB检测探针，0.25mM(mmol/L)dNTP；

(二)利用上文制备得到的试剂盒样品进行肺癌相关基因甲基化的检测：

一、技术原理

通过在人基因组中肺癌相关基因和内参基因的启动子区设计一对特异性引物和探针。然后使用该引物及探针去扩增经亚硫酸氢盐转化的样本DNA,根据相关基因的PCR扩增结果的相对荧光值Ct值来确定待测样本的是否发生甲基化，根据甲基化来间接判定肺癌的风险。

二、检测方法

步骤一：待测样本的DNA抽提，并对其进行亚硫酸氢盐转化处理，转化后的DNA作为PCR的模板进行qPCR扩增。

其中，转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐，及其他辅助试剂(相应试剂购自于德国QIAGEN公司的Epitect Fast Bisulfite Conversion Kit)；

步骤二：提供上述用于肺癌相关基因甲基化检测的试剂盒，并对模板进行PCR扩增；

步骤三：根据相关基因的PCR扩增结果的相对荧光值Ct来确定待检测样本是否发生甲基化；

具体的检测方法，如下：

一)血浆分离

1、利用游离DNA采样管抽取10ml外周血，到达实验室后第一时间进行血浆分离工作。

2、4℃，1600rpm离心力离心20min，取血浆分装到无菌离心管内。

3、初步分离后的血浆在4℃条件下以16,000rpm离心10min，以去除残余细胞。离心结束后将血浆分装到无菌离心管内。

二)提取血浆DNA:

1、取2ml的血浆样本，按照以下体系加入相应的试剂量如表1所示：

表1

2、样本和试剂充分混匀后，室温孵育20min，期间每3-5min上下颠倒混匀10sec，使磁珠和核酸充分结合。孵育结束后简短离心去除管壁内壁的液滴；

3、离心管放置于磁力加上静置2min，待磁珠完全吸附时小心去除液体，取下离心管；

4、加入1ml Buffer RBP，振荡混匀1min，使磁珠充分悬浮，简短离心以去除内壁的滴液；

5、将离心管放置于磁力加上静置1min，待磁珠完全吸附时小心去除液体，取下离心管；

6、加入1ml的80％的乙醇(现配现用)，每次振荡混匀1min，使磁珠充分悬浮，简短离心以去除内壁的滴液。

7、将离心管放置于磁力加上静置1min，待磁珠完全吸附时小心去除液体，取下离心管。

8、重复步骤6-7一次，共计2次乙醇洗脱。

9、将离心管放置于磁力加上，室温晾干5–10min。

10、将离心管从磁力加上取下，加入45μl Buffer EB，震荡混匀使磁珠悬浮，56℃孵育5min，期间每2min轻轻晃动离心管，使核酸充分吸脱，后可短暂离心以去除管壁及管盖上的液体。

11、将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至1.5ml收集管中，并于适当条件保存。

12、取1μl的DNA洗脱液进行Qubit HS浓度测定，并记录数据结果，剩余样本如不继续进行实验保存在-20℃冰箱。

三)DNA转化流程：

1、将提取的DNA按照以下配方配置亚硫酸氢盐的转化体系如表2所示；

表2

2、转化体系配置完成后，按照以下反应条件，置于PCR仪中反应，反应程序如表3所示；

表3

3、亚硫酸氢盐转化后DNA纯化：

4、瞬离PCR管，将亚硫酸氢盐转化后的产物转移至1.5ml的EP管中。

5、向每个样品中加310μl的Buffer BL试剂

6、向每个样品中加250μl的无水乙醇，震荡涡旋混匀溶液15秒，并短暂离心。

7、将混合物转移到离心柱中,14000rpm离心1min

8、弃滤液，加500μl的Buffer BW,14000rpm离心1min

9、弃滤液，加500μl的Buffer BD静止孵育15min，14000rpm离心1min

10、弃滤液，加500μl的Buffer BW，14000rpm离心1min

11、重复步骤10

12、弃滤液，加250μl的无水乙醇，14000rpm离心1min

13、弃滤液，14000rpm空离1min

14、室温下干燥3-5min去除残留乙醇

15、加15μl Buffer EB室温孵育洗脱1min，14000rpm离心1min，收集的DNA保存于-20℃。

四)qPCR反应配置

1、使用的qPCR仪器为美国ABI 7500型实时荧光定量PCR系统(购自于lifetechnology公司)，反应体系为20μl

2、qPCR反应体系配置及条件，如下表4所示：

表4

3、PCR反应加样布局：

待测DNA样本、阳性质控品、阴性质控品和无模板对照均进行3个平行检测，PCR仪的96孔加样布局见下表5。表中PC代表阳性质控品(Positive Control)，NC代表阴性质控品(Negative Control)，NTC代表无模板对照(No Template Control)，S代表检测样本(sample)

表5

4、PCR反应程序如表6所示：

表6

5、检测结果如表7所示，分析如下

1)运行无模板对照(NTC)的扩增曲线分析，应无扩增曲线，说明实验无污染，可以继续分析；

2)质控品的内参基因(ACTB)应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，内参Ct值应符合下表7的结果；阴性质控品的目的基因应无扩增曲线升起，阳性质控品目的基因的Ct值应符合下表，质控品检测满足以下条件时，证明实验有效，可继续分析；

表7

3)样品的内参基因均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，样品PCR检测结果应按照下表8进行判读；

表8

基于本发明的具体实验数据参见图1-图6，其中，图1为RASSF1A基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图2为CDKN2A基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图3为PTGER4基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图4为SHOX2基因甲基化阳性样本扩增曲线图，图5为阴性样本扩增曲线图，可以看出不同甲基化样本肺癌相关甲基化基因与ACTB内参基因的扩增曲线关系，如果目的基因和内参基因均无扩增曲线,见图6，表示该样本不合格需要重复检测或者重新采样。

(三)利用上文的试剂盒样品进行肺癌、正常人血浆的灵敏度和特异性检测：

以20例正常人和20例肺癌患者的血浆样本为监测对象。提取各样本的游离DNA。DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段进行，具体而言，在本案例中，所用的样本DNA是通过使用具体的提取方案按照案例2中的检测体系进行提取。

然后将DNA样本进行预处理使得5’位未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。在本实验案例中，通过亚硫酸氢盐试剂处理来实现该预处理。亚硫酸氢盐DNA的修饰是通过使用案例2中的检测体系进行转化预处理的。

然后，将上述的预处理的20正常人和20例肺癌的DNA样本中加入上述案例2中的检测体系，多元化的检测RASSF1A、SHOX2、PTGER4、CDKN2A和内参基因ACTB。在亚硫酸氢盐转化的DNA上进行实时PCR。

其中，在实验案例中采用的PCR条件按照上文(二)利用上文制备得到的试剂盒样品进行肺癌相关基因甲基化的检测中的qPCR条件进行。

最后，下表1和表2显示的是使用本发明的多重测定对20例正常人和20例肺癌患者样本进行检测的结果。由表9和表10可见，本方案的阳性检测率和阴性检测率很高。

表9利用本发明试剂盒对肺癌患者血浆样本的检测结果

表10利用本发明试剂盒对正常人血浆样本的检测结果

根据上表的检测结果，利用本发明试剂盒进行肺癌筛查时，其阳性检出率(敏感性)为100％，阴性检出率(特异性)为90％。

由以上验证实验可知：RASSF1A、CDKN2A、SDC和PTGER4特异性的正向引物、特异性的反向引物以及特异性探针的核酸组合物在检测肺癌相关基因甲基化的敏感性和特异性上具有协同作用，将RASSF1A、CDKN2A、SDC和PTGER4的特异性的正向引物、特异性的反向引物以及特异性探针组合在一起进行检测肺癌甲基化是一个创新性的发现，并非机械化的实验可以得到的结果。

本发明并非以诊断疾病为目的，且得到的检测也无法直接判断是否具有疾病，间接为人肺癌的早期诊断提供有效信息，为人肺癌早发现早治疗提供一种简便易行的方法。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 杭州圣庭医疗科技有限公司

<120> 一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法

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