用于子宫内膜癌早期筛查人外周血循环肿瘤DNA中TMEM101基因甲基化检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于子宫内膜癌早期筛查的人外周血循环肿瘤DNA中TMEM101基因甲基化检测试剂盒，应用于子宫内膜癌的早期筛查，试剂盒中包括：TMEM101基因目的位点的甲基化特异引物；TMEM101基因特异的水解探针；内参基因的引物和内参基因的水解探针；所述TMEM101基因目的位点为TMEM101基因转录起始位点上下游2000bp的区间中的至少一个CpG位点；所述内参基因为GAPDH和β‑actin中的一种或者多种；所述试剂盒包括PCR预扩增反应体系和PCR扩增反应体系。本发明克服了现有技术过程繁琐，检测时间长，假阳性高，子宫内膜癌血液早期筛查无法溯源等技术上的不足，提供一种用于子宫内膜癌早期筛查的人外周血循环肿瘤DNA中TMEM101基因甲基化检测的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于子宫内膜癌早期筛查的人外周血循环肿瘤DNA 中TMEM101 基因甲基化的检测试剂盒。

背景技术

子宫内膜癌是一种常见的女性生殖道恶性肿瘤。随着人口平均寿命的增加以及生活习惯的改变，其发病率近20年呈持续上升和年轻化的趋势。在西方国家，子宫内膜癌发病率已经占据女性生殖系统恶性肿瘤的首位。在我国，作为继宫颈癌之后第二个常见的妇科恶性肿瘤，其发病率约占妇科恶性肿瘤的20%~30%，部分发达城市子宫内膜癌发病率已达妇科恶性肿瘤第一位。

按照《第4 版WHO 女性生殖器官肿瘤组织学分类》，子宫内膜癌被分为以下组织学类型：子宫内膜样腺癌、黏液性癌、浆液性癌、透明细胞癌、未分化癌、去分化癌、神经内分泌肿瘤及混合性癌。其中子宫内膜样腺癌按肿瘤细胞分化程度分为高、中及低分化（G1、G2 和G3），按照二分类法，G1 和G2 属于I型内膜癌，为雌激素依赖型，预后良好，而G3 及其他非子宫内膜样腺癌类型的肿瘤均属于II 型内膜癌，为非雌激素依赖型，预后较差。

子宫内膜癌诊断的金标准为子宫外转移灶或手术切除组织标本病理学检查，目前的方法均为侵入式的检查，会对病人造成一定的损伤。同时临床上缺少早期发现子宫内膜癌的特异性标志物。鉴于传统的子宫内膜癌筛查方法存在侵入性及低效性，所以现急需一种更加方便，更加精确的筛查方法来提高子宫内膜癌的筛查率。

DNA 甲基化是一个在胞嘧啶或腺嘌呤上添加一个甲基基团的生化过程，它在细胞由干细胞分裂、分化为特异组织时改变基因的转录和表达。DNA 甲基化主要发生在CpG 位点。哺乳动物中60％ -90％的CpG 位点是呈甲基化状态的。甲基化的CpG 位点经常成簇的存在，这些成簇的CpG 位点被称作CpG 岛。DNA 甲基化通过两种方式抑制基因的转录。第一种，DNA 甲基化阻断某基因转录因子的结合。第二种，甲基-CpG- 结合域蛋白(MBDs) 结合甲基化的DNA来招募其他蛋白至其位点，如组蛋白去乙酰化酶和其他染色质重塑蛋白，形成致密、失活的染色质( 异染色质)。

DNA 甲基化是肿瘤发展的重要要素，它与众多恶性肿瘤相关。在癌症中存在着低甲基化和超甲基化两种形式，他们在癌症发生机制中扮演着不同的角色。异常的超甲基化经常发生在基因的启动子区的CpG 岛，它可导致抑癌基因的转录沉默或失活。相反地，低甲基化则与染色体不稳定和失去遗传印记相关。

膜蛋白占蛋白质的很大一部分，构成约30％的蛋白质组。膜蛋白可以通过配体与受体的固定或小生物分子的内在化，使细胞与细胞环境进行通讯。目前，许多尚未被解析的跨膜蛋白被归入跨膜蛋白（TMEM）家族。人类TMEM101（transmembrane protein 101）基因定位于染色体17q21.31位置，也叫做putative NF-kappa-B-activating protein 130，能够编码一类跨膜蛋白TMEM101，在子宫内膜（RPKM 12.8）、肾脏（RPKM 8.2）和其他25种组织中广泛表达。该基因具有5种转录本，存在4种潜在的蛋白异构体形式，可能参于positiveregulation of I-kappaB kinase/NF-kappaB 信号途径的调控。TMEM101蛋白全长257aa，质量为28795Da，通过酵母双杂交和Affinity Capture-RNA 共发现19个互作蛋白。TMEM蛋白是重要的预后标志物，并有可能成为癌症治疗的重要靶标。

在细胞凋亡、坏死和增殖过程中，细胞内DNA 会释放或分泌到循环血液当中成为游离循环DNA(cfDNA)。在癌症患者的血清中的含量有所升高。血清中cfDNA 的浓度不稳定，含量易受创伤、炎症、中风、甚至剧烈运动等多种因素的影响。随着cfDNA 中肿瘤特异的突变被发现，基于突变分析的肿瘤早期诊断成为可能。cfDNA 突变检测诊断产品存在一些技术障碍：在疾病发展的早期突变序列的低含量；无法透过突变检测指示肿瘤的位置以及突变检测本身的技术难题。不过，肿瘤特异的碱基突变不是cfDNA 携带的唯一的序列信息。表观遗传学信息，如某些富含GC 序列的片段的DNA 甲基化也能从cfDNA的检测分析中获得。

cfDNA 甲基化标记要成为一种疾病筛查或诊断产品需要满足：1. 标记物在血清中的含量要足够持续稳定且可被检测到。2. 标志物应具有独特、稳定的甲基化模式，可溯源。3.敏感性和特异性必须优化到能区分目标肿瘤和其他肿瘤甲基化状态。4. 抗干扰性强，不受感染、怀孕、其他肿瘤和消炎药物等干扰因素的影响。最后，测试本身应具有可操作性，可分析性，简单，和便捷等特点。

目前检测甲基化的方法主要有以下几种：(1)直接测序法(bisulfite sequencingPCR、BSP)。(2) 甲基化特异性PCR 法(Methylmion Specific PCR、MSP)。(3) 甲基化敏感性解链曲线分析法(MS-High Resolution Melting Curve、MS-HRM)。(4)甲基化敏感性限制性内切酶法(Methylation-sensitive Restriction Endonuclease，MS-RE 法)。直接测序法方法实验过程长，需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，实验检测的费用高。甲基化特异性PCR 法对甲基化和非甲基化的目的片段分别进行扩增，该方法检测时间相对较长，不能及时获得检测结果。甲基化敏感性解链曲线分析法需要不同甲基化程度的标准品，实验结果读取复杂繁琐，并且该方法用的荧光染料为饱和荧光染料，结果只能检测一个荧光信号通道，不能同时分析样本内参基因的扩增情况，不能推断硫化修饰的效果，容易出现重亚硫酸盐处理不完全的问题以及假阴性。甲基化敏感性限制性内切酶法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA 消化为不同大小的片段后再进行分析。这是一种经典的甲基化研究方法，其优点是：相对简单, 成本低廉，甲基化位点明确, 实验结果易解释；缺点是：1.非CCGG序列中的CG 将被忽略； 2. 存在酶不完全消化引起的假阳性的问题。

中国发明专利申请CN201910791040.5公开了用于子宫内膜癌诊断的试剂盒以及应用，该专利申请存在如下缺陷：1、存在一定局限性，只能区分子宫内膜癌和子宫内膜正常组织，无法区分子宫内膜癌和其他肿瘤；2、子宫内膜癌血液早期筛查无法溯源；3、无法用于术后病人的疗效监测。

目前子宫内膜癌临床早期筛查缺乏特异性的标志物，目前主要依靠诊断性刮宫，取样过程中可能导致患者子宫穿孔、大出血、刮宫不全损伤及宫腔粘连、感染等。

Association of variably methylated tumour DNA regions with overallsurvival for invasive lobular breast cancer（文献1）记载了“VMR区域可以作为侵袭性小叶乳腺癌预后相关的标志物”，但没有涉及任何子宫内膜癌相关的内容。文献1中提到的VMR区域指的是一段区域中的CpG位点的平均值跟预后相关，不涉及侵袭性小叶乳腺癌跟正常样本之间的差异比较，并不是乳腺癌的标志物。而本发明要保护的是子宫内膜癌区别其他肿瘤患者的早筛标志物，其难点在于找到区别子宫内膜癌和其他肿瘤的位点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术过程繁琐，检测时间长，假阳性高，子宫内膜癌血液早期筛查无法溯源等技术上的不足，提供一种用于子宫内膜癌早期筛查的人外周血循环肿瘤DNA 中TMEM101 基因甲基化检测的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种用于子宫内膜癌早期筛查的人外周血循环肿瘤DNA中TMEM101基因甲基化检测试剂盒，所述人外周血循环肿瘤DNA 中TMEM101基因甲基化的检测试剂盒中包括：TMEM101 基因目的位点的甲基化特异引物； TMEM101基因特异的水解探针；内参基因的引物和内参基因的水解探针；所述TMEM101基因目的位点为TMEM101 基因转录起始位点上下游2000bp的区间中的至少一个CpG位点；所述内参基因为GAPDH、β-actin中的一种或者多种；所述试剂盒包括PCR预扩增反应体系和PCR 扩增反应体系。

优选地，所述试剂盒所检测的靶区域选自TMEM101基因的转录起始位点上下游2000bp的全长区域或其中的部分区域。

优选地，所述靶区域选自chr17: 42091709 - 42092100；所述靶区域适用于采用如下方法中的任意一种进行甲基化检测：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法或荧光定量法。

优选地，所述TMEM101 基因目的位点的甲基化特异引物(其终浓度为：0.1 ～ 1µM)包括：

正向引物：5’-GAAATATAGGTAAGGTATTGGGATGT-3’(SEQ ID NO.1) ；

反向引物：5’-TTCCCCCACCRCTTCATTCTAT-3’(SEQ ID NO.2) ；

所述TMEM101 基因特异的水解探针(其终浓度为：0.1 ～ 1µM) 为：

5’-TTTTGCGAGTCGGGAG-3’(SEQ ID NO.3)。

优选地，所述内参基因的引物和内参基因的水解探针如下：

GAPDH ：

正向引物：5’-TTTGGAAGGGTTTSGTATGATTG-3’(SEQ ID NO.4) ；

反向引物：5’-AACTTCCCTACCAAACTAACCTAACTTAAA-3’(SEQ ID NO.5) ；

探针：5’-TGGGTAGTTTTGGAGTTTT-3’(SEQ ID NO.6) ；

β-actin ：

正向引物：5’-GGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTTT-3’(SEQ ID NO.7) ；

反向引物：5’-CACCACCCAACACACAATAACAA-3’(SEQ ID NO.8) ；

探针：5’-TGGATTGTGAATTTGTG-3’(SEQ ID NO.9) ；

优选地，所述TMEM101 基因的探针和内参基因的探针5'端报告荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、TAMRA、TEXAS RED、ROX、CY5、CY3中的一种或多种；所述TMEM101 基因的探针和内参基因的探针3'端的猝灭基团为MGB、BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、ECLIPSE中一种或多种。

优选地，所述试剂盒中还包括阴性质控品、阳性质控品和无模板对照，所述无模板对照是指不含人类基因组DNA 的反应体系。优选地，所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。

优选地，所述试剂盒包括PCR 预扩增反应体系和PCR 扩增反应体系；

优选地，所述PCR 预扩增反应体系的终浓度组成为：1 ～ 10×PCR 缓冲液、0.1～ 1mM dNTPs、0.1 ～ 1µM TMEM101基因目的位点的甲基化特异引物、0.1 ～ 1µM内参基因引物、0.05 ～ 2ng/µL 模板DNA、0.01 ～ 0.10U/µL Taq DNA 聚合酶、1 ～ 5mM 氯化镁；

所述PCR 扩增反应体系的终浓度组成为：1 ～ 10×PCR 缓冲液、0.1 ～ 1mMdNTPs、0.1 ～ 1µM TMEM101基因目的位点的甲基化特异引物、0.1 ～ 1µM内参基因引物、0.05 ～ 2ng/µL 模板DNA、0.1 ～ 1µM TMEM101基因特异的水解探针、0.1 ～ 1µM 内参基因 水解探针、0.01 ～ 0.10U/µL Taq DNA 聚合酶、1 ～ 5mM 氯化镁。

优选地，所述dNTPs 中包括2.5 ～ 10mM dATP、2.5 ～ 10mM dCTP、2.5 ～ 10mMdTTP 和2.5 ～ 10mM dGTP，所述PCR 体系中还包含Tris·Cl、氯化钾、硫酸镁。

优选地，所述PCR 预扩增反应体系的反应具体过程为：92 ℃～ 98℃预变性5 ～35 分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，92℃ ～ 98℃变性10 ～ 30s，50℃ ～ 65℃退火10 ～ 60s，并进行15 ～ 55 个循环；

优选地，所述PCR 扩增反应体系的反应具体过程为：92℃ ～ 98℃预变性5 ～ 35分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，92℃ ～ 98℃变性10 ～ 30s，50℃ ～ 65℃退火10 ～ 60s，并进行15 ～ 55 个循环。

优选地，所述试剂盒通过TMEM101基因与内参基因PCR 扩增结果来对检测结果给出判定的方式是:

TMEM101基因Ct ≤ 40，内参基因Ct ≤25判定结果：甲基化阳性；

TMEM101基因无扩增，内参基因Ct ≤25 判定结果：甲基化阴性。

优选地，所述TMEM101 基因目的位点为TMEM101基因转录起始位点上下游2000bp的区间中的至少一个CpG位点，其采用训练集和测试集筛选得到，所述训练集筛选方法包括如下步骤：

1.1 利用TCGA中的284例子宫内膜癌和46例癌旁的450K芯片甲基化数据，数据预处理后，进行差异分析，设阈值q value< 0.01, Δβ≥ 0.2, mean β≥ 0.1, SNP_DISTANCE ≥ 10或SNP_MinorAlleleFrequency ≤ 0.05，得到满足阈值条件的显著差异位点17187个；

1.2 为了排除全血中单核细胞中甲基化位点的干扰，与共有数据集中健康人群的全血甲基化数据做差异分析，保留甲基化差异值大于20%位点，即7948个位点；

1.3 对7948个位点所在基因进行IPA分析，发现由26个甲基化位点所在基因富集在肥胖、雌激素和昼夜节律等相关通路；

1.4 为提高甲基化位点区分不同癌症的特异性，又分别与不同类型的癌症做差异分析，求交集，得到了组织类型特异性的214个CpG位点；

1.5 为了进一步面向临床，精简CpG位点，使用机器学习中的LASSO和随机森林算法分别得到4个和21个甲基化位点，求并集得到24个候选CpG位点标志物；

1.6 通过逐步回归，得到由3个CpG位点组成的最优模型，并通过ROC曲线评价模型的特异性和灵敏度；

1.7 扩大样本，使用TCGA中的141例子宫内膜癌(1/3)和46例癌旁450K芯片甲基化数据进行验证，通过ROC曲线进行评价；

所述测试集筛选方法包括如下步骤：

2.1 技术验证：收集中国人群的子宫内膜癌样本和癌旁样本，各50例，使用焦磷酸测序靶向检测模型中3个CpG位点的甲基化值，使用ROC曲线进行验证；

2.2 多中心验证：收集GEO中临床信息一致样本的甲基化芯片数据作为多中心的验证集，分别使用ROC曲线评价模型的准确度。

本发明通过TMEM101 基因与内参基因PCR 扩增结果，来对检测结果给出判定，提高了检测结果的敏感性和可靠性。TMEM101 基因与内参基因PCR 扩增结果指其Ct 值，即TMEM101 基因与内参基因的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。通过TMEM101基因与内参基因PCR 扩增结果来对检测结果给出判定的方式是: TMEM101基因Ct ≤ 40，内参基因Ct ≤25判定结果：甲基化阳性； TMEM101基因无扩增，内参基因Ct ≤25 判定结果：甲基化阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1 .目前子宫内膜癌临床早期筛查缺乏特异性的标志物，目前主要依靠诊断性刮宫，取样过程中可能导致患者子宫穿孔、大出血、刮宫不全损伤及宫腔粘连、感染等。本发明可以只需抽取患者6-8ml血液，操作简便、患者依从性好；

2 .传统的诊断方法无法特异性的检测出早期的子宫内膜癌，而DNA甲基化是癌症发生中的早期事件且具有一定的稳定性，可以作为子宫内膜癌早期筛查的生物标志，本发明提供了一种基于DNA甲基化的子宫内膜癌早期筛查方法，能准确快速判断受试者是否罹患子宫内膜癌。

3 .现有技术多利用子宫内膜组织和子宫颈抹片细胞的检测且需要至少两个分子标志才能取得较好的检测效果，本发明仅需一个分子标志(即一个基因)即可用于血液cfDNA的检测，并且能达到较高的灵敏性和特异性。

4.本发明利用单个标志物TMEM101灵敏性和特异性高，判读简单，并且能够溯源子宫内膜癌组织。

本申请与直接测序法的不同之处在于此申请所用方法为直接通过PCR( 聚合酶链式反应) 得到的荧光信号直接判断“CpG 位点的甲基化”的状态；而直接测序法需要通过PCR对目标区域扩增后进行测序反应方能得到“CpG 位点的甲基化”的状态。

本发明所述试剂盒的组份设置及其结果判读方案使得检测过程简便，可操作性强。检测结果可靠、特异性好。经实验验证，通过20例健康人对照和26例上海市某医院样本的cfDNA检测，本发明的检测敏感性为87%，特异性为100, 准确率为96%。

cfDNA 突变检测诊断产品存在一些技术障碍：在疾病发展的早期突变序列的低含量；无法透过突变检测指示肿瘤的位置以及突变检测本身的技术难题。肿瘤的体细胞突变信息虽然可以在cfDNA中检测到，但其具有以下两个明显的缺点：1.不具有肿瘤特异性，无法在血液中溯源疾病发生的部位。2.生物学进程一般发生在肿瘤发生的晚期，无法在肿瘤发生的早期检测到。而甲基化信息的改变是在肿瘤发生的早期或极早期，并且甲基化的信息同样可以在cfDNA中携带。通过分析10000+例肿瘤组织样本的甲基化数据，证明本发明中涉及的甲基化位点具有极强的子宫内膜癌特异性，并且通过增加预扩增这一环节极大提高了检测的灵敏度，因此本发明克服了cfDNA 突变检测诊断产品存在的技术障碍，在子宫内膜癌的早期筛查中达到了预料不到的技术效果。中国发明专利申请CN105331727A（文献2）公开了一种人外周血循环肿瘤DNA中septin 9基因甲基化的检测试剂盒，其方法与本发明方法不同，本发明的独特之处在于为了提高检测的灵敏度，因此本发明中有预扩增的设计。

与中国发明专利申请CN201910791040.5相比，本发明具有以下特点：1.本专利中涉及的TMEM101基因CpG位点具有组织特异性，不仅可以区分子宫内膜癌和子宫内膜正常组织，而且可以区分子宫内膜癌和其他肿瘤，具有组织特异性。2. 该发明应用于血液中cfDNA的检测，可以做子宫内膜癌的早期筛查，比发明专利申请CN201910791040.5中的应用大大提前，具有极高的早期筛查价值。3. 本发明还可应用于术后病人的疗效监测，避免反复侵入性、辐射性的检查对病人造成伤害。

附图说明

图1是本发明实施例1中子宫内膜癌位点筛选流程图。

图2是本发明实施例1中位点筛选过程中的候选位点展示示意图。

图3是本发明实施例1中候选位点在所有肿瘤中的特异性展示示意图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，例如按照分子克隆实验指南( 第三版，J. 萨姆布鲁克等著) 中所述的条件或制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例1

本发明的难点在于找到区别子宫内膜癌和其他肿瘤的位点，为了锁定本发明中提出的区别子宫内膜癌和其他肿瘤的位点，在研发过程中利用了数据库中超过33种肿瘤的近13000例肿瘤的甲基化数，而且自己开发了分析的流程，并利用焦磷酸测序实际检测了大量的肿瘤组织数据。部分结果展示如图1所示，具体为：

1. 本专利在锁定候选区域的过程中标志物筛选思路分两大部分：1.训练集，2.测试集

1.训练集

1.1 利用TCGA中的284例子宫内膜癌（2/3）和46例癌旁的450K芯片甲基化数据，数据预处理后，进行差异分析，设阈值q value< 0.01, Δβ≥ 0.2, mean β≥ 0.1, SNP_DISTANCE ≥ 10或SNP_MinorAlleleFrequency ≤ 0.05，得到满足阈值条件的显著差异位点17187个。

1.2 为了排除全血中单核细胞中甲基化位点的干扰，与共有数据集中健康人群的全血甲基化数据做差异分析，保留甲基化差异值大于20%位点，即7948个位点。

1.3 对7948个位点所在基因进行IPA分析，发现由26个甲基化位点所在基因富集在肥胖、雌激素和昼夜节律等相关通路。

1.4 为提高甲基化位点区分不同癌症的特异性，又分别与不同类型的癌症做差异分析，求交集，得到了组织类型特异性的214个CpG位点。

1.5 为了进一步面向临床，精简CpG位点，使用机器学习中的LASSO和随机森林算法分别得到4个和21个甲基化位点，求并集得到24个候选CpG位点标志物。

1.6 通过逐步回归，得到由3个CpG位点组成的最优模型，并通过ROC曲线评价模型的特异性和灵敏度。

1.7 扩大样本，使用TCGA中的141例子宫内膜癌(1/3)和46例癌旁450K芯片甲基化数据进行验证，通过ROC曲线进行评价。

2.测试集

2.1 技术验证：收集中国人群的子宫内膜癌样本和癌旁样本，各50例，使用焦磷酸测序靶向检测模型中3个CpG位点的甲基化值，使用ROC曲线进行验证。

2.2 多中心验证：收集GEO中临床信息一致样本的甲基化芯片数据作为多中心的验证集，分别使用ROC曲线评价模型的准确度。

位点筛选过程中的候选位点展示如图2所示，图2中从左到右依次展示的是候选CpG位点在子宫内膜癌样本，癌旁样本和正常全血样本中的甲基化程度。每一列代表一个样本，每一行代表一个CpG位点。甲基化的程度由黑到白的变化，代表的是甲基化程度由0%到100%的变化（图2中右侧图注展示，-2，-1，0，1，2分别代表甲基化程度由0%到100%的变化，-2代表甲基化程度为0%，2代表甲基化程度为100%，颜色越浅代表甲基化程度越高）。从图2中可以清晰的看出，候选的CpG位点在子宫内膜癌样本中甲基化程度显著高于癌旁样本和正常全血样本。由图2明显可见24个位点可将3组样本（子宫内膜癌样本，癌旁样本和正常全血样本）明显区分。

本专利通过步骤1.5，和步骤1.6的分析锁定了TMEM101转录起始位点上下游2kb的位点。图3展示了该区域中beta值的总体分布。图3中横坐标为为不同类型癌症、癌旁分组信息，纵坐标为样本beta值（从小到大排序后的数值）。矩形盒对应数据的上下四分位数（Q1和Q3），矩形盒内部中位线为中位数，上划线为Q1－1.5IQR处，下划线为Q3+1.5IQR，其中IQR为四分位间距，IQR=Q3-Q1。每个矩形盒下方是该组的样本数量。

本发明共设计焦磷酸引物6对，表1验证的位点为子宫内膜癌分析中准确度最高的6个位点，均属于TMEM101转录起始位点上下游2000bp的位点。

综上，本发明是经过一系列的研发工作，克服了种种技术困难，才找到了子宫内膜癌的早筛位点TMEM101（即所述TMEM101 基因目的位点为TMEM101基因转录起始位点上下游2000bp的区间中的至少一个CpG位点）, 该工作包含了发明人的创造性劳动，且与现有技术（文献1 Association of variably methylated tumour DNA regions with overallsurvival for invasive lobular breast cancer和文献2中国发明专利申请CN105331727A）相比具有突出的实质性特点。

实施例2

材料：待检血浆样本、阳性质控品、阴性质控品。所述阳性质控品为亚硫酸氢盐修饰的全甲基化人类基因组DNA，所述阴性质控品为亚硫酸氢盐修饰的非甲基化人类基因组DNA。

人外周血循环肿瘤DNA 中TMEM101 基因甲基化的检测试剂盒，其中包括：TMEM101基因目的位点的甲基化特异引物； TMEM101 基因特异的水解探针；内参基因的引物和内参基因的水解探针；

所述TMEM101 基因目的位点为TMEM101转录起始位点上下游2000bp的区间中的至少一个CpG位点；所述内参基因为GAPDH、β-actin、中的一种或者多种。

所述TMEM101 基因目的位点的甲基化特异引物(其终浓度为：0.1 ～ 1µM)包括：

正向引物：5’-GAAATATAGGTAAGGTATTGGGATGT-3’(SEQ ID NO.1) ；

反向引物：5’-TTCCCCCACCRCTTCATTCTAT-3’(SEQ ID NO.2) ；

所述TMEM101 基因特异的水解探针(其终浓度为：0.1 ～ 1 µM) 为：

5’-TTTTGCGAGTCGGGAG-3’(SEQ ID NO.3)。

优选地，所述内参基因的引物和内参基因的水解探针如下：

GAPDH ：

正向引物：5’-TTTGGAAGGGTTTSGTATGATTG-3’(SEQ ID NO.4) ；

反向引物：5’-AACTTCCCTACCAAACTAACCTAACTTAAA-3’(SEQ ID NO.5) ；

探针：5’-TGGGTAGTTTTGGAGTTTT-3’(SEQ ID NO.6) ；

β-actin ：

正向引物：5’-GGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTTT-3’(SEQ ID NO.7) ；

反向引物：5’-CACCACCCAACACACAATAACAA-3’(SEQ ID NO.8) ；

探针：5’-TGGATTGTGAATTTGTG-3’(SEQ ID NO.9) ；

仪器：AB7500、nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。

试剂：cfDNA提取试剂盒( 凯杰)、转化试剂（Zymo）、DNA 聚合酶(TaKaRa)、

10×PCR Buffer(TaKaRa)、MgCl2(TaKaRa)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。

引物：所有引物纯度应达到电泳级(PAGE) 或HPLC 级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE 电泳结果或HPLC 分析图谱，证明使用PAGE 或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE 或者HPLC 纯化图谱，浓度为10ng/μl 备用。

实验步骤具体包括如下：

(1)cfDNA提取

采用Qiagen的cfDNA提取试剂盒（货号：55114）提取病人cfDNA。

(2)PCR 反应的体系和反应条件

所述PCR 预扩增反应体系的终浓度组成为：1 ～ 10×PCR 缓冲液、0.1 ～ 1mMdNTPs、0.1 ～ 1µM TMEM101基因目的位点的甲基化特异引物、0.1 ～ 1µM内参基因引物、0.05 ～ 2ng/µL 模板DNA、0.01 ～ 0.10U/µL Taq DNA 聚合酶、1 ～ 5mM 氯化镁。

所述PCR 扩增反应体系的终浓度组成为：1 ～ 10×PCR 缓冲液、0.1 ～ 1mMdNTPs、0.1 ～ 1µM TMEM101基因目的位点的甲基化特异引物、0.1 ～ 1µM内参基因引物、0.05 ～ 2ng/µL 模板DNA、0.1 ～ 1µM TMEM101基因特异的水解探针、0.1 ～ 1µM 内参基因水解探针、0.01 ～ 0.10U/µL Taq DNA 聚合酶、1 ～ 5mM 氯化镁。

所述检测基因为TMEM101基因，所述内参基因为GAPDH、β-actin(ACTB)、中的一种或者多种。所述TMEM101 基因的探针和内参基因的探针5' 端报告荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、TAMRA、Texas Red、Rox、Cy5、Cy3中的一种或多种；所述TMEM101基因的探针和内参基因的探针3' 端的猝灭基团为MGB、BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、ECLIPSE中一种或多种。

所述dNTPs 中包括2.5 ～ 10mM dATP、2.5 ～ 10mM dCTP、2.5 ～ 10mM dTTP 和2.5 ～ 10mM dGTP，所述PCR 体系中包含Tris·Cl、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。

所述PCR 预扩增反应的具体过程为：92 ℃～ 98℃预变性5 ～ 35 分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，92℃ ～ 98℃变性10 ～ 30s，50℃ ～ 65℃退火10 ～ 60s，并进行15 ～ 55 个循环。

所述PCR 扩增反应的具体过程为：92℃ ～ 98℃预变性5 ～ 35 分钟，再进行聚合酶链式反应扩增阶段，92℃ ～ 98℃变性10 ～ 30s，50℃ ～ 65℃退火10 ～ 60s，并进行15 ～ 55 个循环。

(3)PCR 反应的加样布局(见表2)

待测DNA 样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3 个复孔检测，PCR仪96 孔板加样布局见下表2。表2中PC 代表阳性质控品(Positive Control)，NC 代表阴性质控品(Negative Control)，NTC 代表无模板对照(No template control)，S 代表检测样本(sample)。

表 2 PCR加样布局

(4) 实验结束以后，按以下步骤进行检测结果的分析、判定：

进行无模板对照(NTC) 的扩增曲线分析，TMEM101 和内参基因( 最优选：β-actin) 此时应无扩增曲线明显扩增信号，说明实验无污染，可以继续分析。质控品的内参基因(β-actin) 应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，质控品内参基因(β-actin) 的Ct值应符合下表中参数范围；阴性质控品的TMEM101应无明显扩增曲线变化，阳性质控品TMEM101的Ct值应符合下表3中质控品的参数范围。质控品检测满足以上条件时，证明实验有效，可继续分析。

表 3 质控品分析判定表

样本的内参基因(β-actin 应均有扩增信号，且呈S 型扩增曲线，样本单个PCR 检测结果应按照表4 样本检测单个PCR 结果判读。

表 4 子宫内膜癌阳性结果判定

若不符合表4 中的要求，则建议重新检测。

实施例3

通过20例健康人对照和26例上海市xx医院样本的cfDNA检测（检测方法参考实施例1），本发明试剂盒的检测敏感性为87%，特异性为100%, 准确率为96%，见表5和表6。

表 5上海市xx医院26例样本临床病理信息和实验结果的比对。

表 6本发明所涉及区域在46个样本的检测结果。

从表5和表6可见，采用本发明的检测试剂盒，其检测结果可靠、灵敏性高、特异性好，准确率高，判读简单，并且能够溯源子宫内膜癌组织，达到了现有技术所预料不到的技术效果。

综上，本发明实施例的试剂盒或试剂具有如下优点：

1 .目前子宫内膜癌临床早期筛查缺乏特异性的标志物，目前主要依靠诊断性刮宫，取样过程中可能导致患者子宫穿孔、大出血、刮宫不全损伤及宫腔粘连、感染等。本发明可以只需抽取患者6-8ml血液，操作简便、患者依从性好；

2 .传统的诊断方法无法特异性的检测出早期的子宫内膜癌，而DNA甲基化是癌症发生中的早期事件且具有一定的稳定性，可以作为子宫内膜癌早期筛查的生物标志，本发明提供了一种基于DNA甲基化的子宫内膜癌早期筛查方法，能准确快速判断受试者是否罹患子宫内膜癌。

3 .现有技术多利用子宫内膜组织和子宫颈抹片细胞的检测且需要至少两个分子标志才能取得较好的检测效果，本发明仅需一个分子标志(即一个基因)即可用于血液cfDNA的检测，并且能达到较高的灵敏性和特异性。

5.本发明利用单个标志物TMEM101灵敏性和特异性高，判读简单，并且能够溯源子宫内膜癌组织。

实施例4 引物和水解探针筛选实验

本发明所述一种人外周血循环肿瘤DNA中TMEM101 基因甲基化检测试剂盒，应用于子宫内膜癌的早期筛查。在TMEM101 基因中共筛选了7个位点，设计了11组特异性引物和水解探针,实验结果见表7。在内参基因β-actin和Gapdh中共设计了8组引物和水解探针,实验结果见表8。经过大量样本测试，以及焦磷酸测序验证见表9，最终筛选出了1组TMEM101基因和2组内参基因的引物探针（即引物探针3、引物探针15、引物探针18），所述引物探针灵敏性和特异性高，判读简单，并且能够溯源子宫内膜癌组织。

子宫内膜癌特异性基因TMEM101基因特异性引物和水解探针序列：

引物探针1：

正向引物：5’- AGTGGAGTTTGTGGGAATTTAAGG -3’ ；(SEQ ID NO.10)

反向引物：5’- CCCCCATATCGAAATACAAATAAAA -3’ ；(SEQ ID NO.11)

探针：5’- TTTCGGTTCGTAGGAAGT -3’ ；(SEQ ID NO.12)

引物探针2：

正向引物：5’- TTGAGGTTTTATTTTAGTTAGAGAAGTAGG -3’ ；(SEQ ID NO.13)

反向引物：5’- AAACTAAACTTCCCAACTAAATCACCTT -3’ ；(SEQ ID NO.14)

探针：5’- TTAGAGAAGTAGGCGCGGG -3’ ；(SEQ ID NO.15)

引物探针3：

正向引物：5’- GAAATATAGGTAAGGTATTGGGATGT -3’ ；(SEQ ID NO.1)

反向引物：5’- TTCCCCCACCRCTTCATTCTAT -3’ ；(SEQ ID NO.2)

探针：5’- TTTTGCGAGTCGGGAG -3’ ；(SEQ ID NO.3)

引物探针4：

正向引物：5’- TTGSGGTTTTATTTTAGTTAGAGAAGTAGG -3’ ；(SEQ ID NO.16)

反向引物：5’- AAACTAAACTTCRCAACTAAATCACCTT -3’ ；(SEQ ID NO.17)

探针：5’- AAGTAGGCGCGGGGA -3’ ；(SEQ ID NO.18)

引物探针5：

正向引物：5’- TTGSGGTTTTATTTTAGTTAGAGAAGTAGG -3’ ；(SEQ ID NO.19)

反向引物：5’- AAACTAAACTTCRCAACTAAATCACCTT -3’ ；(SEQ ID NO.20)

探针：5’- TATTTTCGCGTTTGTTTTTTTGATTGGG -3’ ；(SEQ ID NO.21)

引物探针6：

正向引物：5’- ATAGTATGAGTTGGTTGAAGTAGTT -3’ ；(SEQ ID NO.22)

反向引物：5’- AACTACCCTTTCCCAAAATA -3’ ；(SEQ ID NO.23)

探针：5’- AGGGGTAGCGTGTGAGTA -3’ ；(SEQ ID NO.24)

引物探针7：

正向引物：5’- GAGASGGTGGATGTTGTAGTTGATTATGT -3’ ；(SEQ ID NO.25)

反向引物：5’- ACCCTCTCAACRTACAACATAAACTAACTA -3’ ；(SEQ ID NO.26)

探针：5’- TGTTGTTTATACGTTGTTTT -3’ ；(SEQ ID NO.27)

引物探针8：

正向引物：5’- ATATGGTTTTGAAGGTTTTATGAGTAGA -3’ ；(SEQ ID NO.28)

反向引物：5’- AAAAACTAAACTTCRCAACTAAATCACCTT -3’ ；(SEQ ID NO.29)

探针：5’- TTTTAGATTCGGAATTAGAG -3’ ；(SEQ ID NO.30)

引物探针9：

正向引物：5’- TTGTTTTTTTGATTGGGGTGAG -3’ ；(SEQ ID NO.31)

反向引物：5’- ACACCRAACCCAACTACATAATCAACT -3’ ；(SEQ ID NO.32)

探针：5’- TAAGATGGCGTCGAAGAT -3’ ；(SEQ ID NO.33)

引物探针10：

正向引物：5’- AGTTTATGTTGTASGTTGAGAGGGTTGAG -3’ ；(SEQ ID NO.34)

反向引物：5’- CCACTTCTAACCCCCAATTTCTT -3’ ；(SEQ ID NO.35)

探针：5’- TGAGGCACGCCGGTGA -3’ ；(SEQ ID NO.36)

引物探针11：

正向引物：5’- TTGTTTTTTTGATTGGGGTGAG -3’ ；(SEQ ID NO.37)

反向引物：5’- AACCCAACTACATAATCAACT -3’ ；(SEQ ID NO.38)

探针：5’- AGGTCGTAGCGGATT -3’ ；(SEQ ID NO.39)

表 7 子宫内膜癌TMEM101特异性基因引物探针实验结果对比

如表7所示，引物探针3的特异性、准确性和灵敏度优于其他引物探针，达到了其他引物探针所预料不到的技术效果，因此引物探针3是本发明要保护的引物探针序列。

内参基因的引物和水解探针序列：

引物探针12：

正向引物：5’- GATTTGGGAGAGGATTGGGTTAT -3’ ；(SEQ ID NO.40)

反向引物：5’- AACATCCCCCAAAATTCACAATA -3’ ；(SEQ ID NO.41)

探针：5’- TTTTAGGATGGTAAGGGATTT -3’ ；(SEQ ID NO.42)

引物探针13：

正向引物：5’- GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT-3’ ；(SEQ ID NO.43)

反向引物：5’- CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3’ ；(SEQ ID NO.44)

探针：5’- ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’ ；(SEQ ID NO.45)

引物探针14：

正向引物：5’- GGTAGTGAGGATTTTGGATGTGA -3’ ；(SEQ ID NO.46)

反向引物：5’- CACCCAACACAATAAAAATCAAA -3’ ；(SEQ ID NO.47)

探针：5’- AGTTTAGGTAGGAAAGATAT -3’ ；(SEQ ID NO.48)

引物探针15：

正向引物：5’- GGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTTT-3’ ；(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’- CACCACCCAACACACAATAACAA-3’ ；(SEQ ID NO.8)

探针：5’- TGGATTGTGAATTTGTG-3’ ；(SEQ ID NO.9)

引物探针16：

正向引物：5’- ATGATATTAAGAAGGTGGTGAAGT-3’ ；(SEQ ID NO.49)

反向引物：5’- AAATCAAAAAAAACCACCTAATACTCA-3’ ；(SEQ ID NO.50)

探针：5’- AAGGTGGTGAAGTAG-3’ ；(SEQ ID NO.51)

引物探针17：

正向引物：5’- ATATGGTTTTTAAGGAGTAAGAT -3’ ；(SEQ ID NO.52)

反向引物：5’- CTCTCTTCCTCTTATACTCTTACT -3’ ；(SEQ ID NO.53)

探针：5’- TAAATTATTAATTTTAGT -3’ ；(SEQ ID NO.54)

引物探针18：

正向引物：5’- TTTGGAAGGGTTTSGTATGATTG-3’ ；(SEQ ID NO.4)

反向引物：5’- AACTTCCCTACCAAACTAACCTAACTTAAA-3’ ；(SEQ ID NO.5)

探针：5’- TGGGTAGTTTTGGAGTTTT-3’ ；(SEQ ID NO.6)

引物探针19：

正向引物：5’- GGTTGGGGTTAGAGATTGGT-3’ ；(SEQ ID NO.55)

反向引物：5’- CCATAAAATCCACCACCCTATTAC-3’ ；(SEQ ID NO.56)

探针：5’- TTTAAAAAGTGTAGGGTTTG-3’ ；(SEQ ID NO.57)

表 8 内参基因的引物探针实验结果对比

如表8所示，引物探针15和引物探针18的特异性、准确性和灵敏度优于其他引物探针，达到了其他引物探针所预料不到的技术效果，因此引物探针15和引物探针18是本发明要保护的引物探针序列。

表 9 经焦磷酸测序验证的样本类型及样本数量

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>上海伯豪生物技术有限公司

<120>用于子宫内膜癌早期筛查人外周血循环肿瘤DNA中TMEM101基因甲基化检测试剂盒

<130> WH-NP-21-100894-2

<160> 57

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 1

gaaatatagg taaggtattg ggatgt 26

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 2

ttcccccacc rcttcattct at 22

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 3

ttttgcgagt cgggag 16

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 4

tttggaaggg tttsgtatga ttg 23

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 5

aacttcccta ccaaactaac ctaacttaaa 30

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 6

tgggtagttt tggagtttt 19

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 7

ggtgatggag gaggtttagt aagttt 26

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 8

caccacccaa cacacaataa caa 23

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 9

tggattgtga atttgtg 17

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 10

agtggagttt gtgggaattt aagg 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 11

cccccatatc gaaatacaaa taaaa 25

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 12

tttcggttcg taggaagt 18

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 13

ttgaggtttt attttagtta gagaagtagg 30

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 14

aaactaaact tcccaactaa atcacctt 28

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 15

ttagagaagt aggcgcggg 19

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 16

ttgsggtttt attttagtta gagaagtagg 30

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 17

aaactaaact tcrcaactaa atcacctt 28

<210> 18

<211> 15

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 18

aagtaggcgc gggga 15

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 19

ttgsggtttt attttagtta gagaagtagg 30

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 20

aaactaaact tcrcaactaa atcacctt 28

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 21

tattttcgcg tttgtttttt tgattggg 28

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 22

atagtatgag ttggttgaag tagtt 25

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 23

aactaccctt tcccaaaata 20

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 24

aggggtagcg tgtgagta 18

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 25

gagasggtgg atgttgtagt tgattatgt 29

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 26

accctctcaa crtacaacat aaactaacta 30

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 27

tgttgtttat acgttgtttt 20

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 28

atatggtttt gaaggtttta tgagtaga 28

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 29

aaaaactaaa cttcrcaact aaatcacctt 30

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 30

ttttagattc ggaattagag 20

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 31

ttgttttttt gattggggtg ag 22

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 32

acaccraacc caactacata atcaact 27

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 33

taagatggcg tcgaagat 18

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 34

agtttatgtt gtasgttgag agggttgag 29

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 35

ccacttctaa cccccaattt ctt 23

<210> 36

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 36

tgaggcacgc cggtga 16

<210> 37

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 37

ttgttttttt gattggggtg ag 22

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 38

aacccaacta cataatcaac t 21

<210> 39

<211> 15

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 39

aggtcgtagc ggatt 15

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 40

gatttgggag aggattgggt tat 23

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 41

aacatccccc aaaattcaca ata 23

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 42

ttttaggatg gtaagggatt t 21

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 43

gtgatggagg aggtttagta agtt 24

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 44

ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 45

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 46

ggtagtgagg attttggatg tga 23

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 47

cacccaacac aataaaaatc aaa 23

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 48

agtttaggta ggaaagatat 20

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 49

atgatattaa gaaggtggtg aagt 24

<210> 50

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 50

aaatcaaaaa aaaccaccta atactca 27

<210> 51

<211> 15

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 51

aaggtggtga agtag 15

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 52

atatggtttt taaggagtaa gat 23

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 53

ctctcttcct cttatactct tact 24

<210> 54

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 54

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<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 55

ggttggggtt agagattggt 20

<210> 56

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<220>

<221> misc_feature

<223>引物

<400> 56

ccataaaatc caccacccta ttac 24

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列（未知）

<400> 57

tttaaaaagt gtagggtttg 20