子宫内膜癌中抑癌基因甲基化及其表观遗传调控的研究

摘要

研究目的:为子宫内膜癌(endometrialcarcinoma，EC)诊断寻找新的甲基化标志物，并进一步探索其表观遗传调控机制。
　　 研究方法:(1)运用甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR，MSP)法检测166例子宫内膜标本（包括正常内膜27例，单纯性增生25例，复杂性增生30例，不典型增生24例和子宫内膜样腺癌60例）中4个抑癌基因(tumorsuppressorgenes，TSGs)(SOCS1，SOCS3，3OST2，DLC1)启动子的甲基化状态。(2)单独或联合应用5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)和曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)处理子宫内膜样腺癌Ishikawa细胞株，实验分为4组（未处理组、5-Aza-CdR组、TSA组和5-Aza-CdR+TSA组）。运用MSP和实时荧光定量PCR(reversetranscriptionreal-timequantitativePCR,qRT-PCR)法分别检测4组细胞中SOCS3和3OST2基因甲基化状态及mRNA表达水平的变化。(3)通过免疫组化(immunohistochemistry，IHC)、蛋白印迹(westernblot，WB)和qTR-PCR技术检测4组细胞中UHRF1蛋白及mRNA表达水平的改变。(4)运用WB和染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation，ChIP)-qPCR技术检测4组细胞中UHRF1和不同甲基化状态的H3R8的表达变化及与甲基化的SOCS3和3OST2基因启动子的相互作用。
　　 结果:(1)在EC中，SOCS3和3OST2启动子存在着较高的甲基化率（分别为88.3％和78.3％），而SOCS1和DLC1基因的甲基化率较低(分别为13.3％和21.7％)。SOCS3不仅在EC中的甲基化率较高，在复杂性增生和不典型增生中也出现较高的甲基化率（分别为53.3％和54.2％），两组之间相比无显著统计学差异，但与其它各组相比均有显著统计学差异(p均＜0.05）。3OST2仅在EC中存在高甲基化率，其余各组中的甲基化率均较低，且与子宫内膜癌患者的年龄和肿瘤分化程度相关(p＜0.05）。(2)未处理组中SOCS3和3OST2启动子均呈完全甲基化状态。5-Aza-CdR或TSA单独处理后SOCS3和3OST2启动子甲基化被部分逆转，同时mRNA表达增加(P＜0.01)，且TSA的作用比5-Aza-CdR更为显著。联合应用组中SOCS3和3OST2甲基化被完全逆转，mRNA水平显著升高(P＜0.01)。(3)未加药组Ishikawa细胞中UHRF1呈高表达状态，5-Aza-CdR处理后UHRF1的表达水平有所下调，而TSA处理后UHRF1表达显著下调。两药联用具有协同作用。(4)未加药组中发现，UHRF-1和H3R8me2s富集于甲基化的SOCS3和3OST2基因启动子区，而H3R8me2a富集较少。5-Aza-CdR和/或TSA处理后，UHRF1和H3R8me2s与启动子区脱离，与之同时，H3R8me2a富集明显增加。
　　 结论:SOCS3和3OST2基因启动子甲基化在子宫内膜样腺癌中具有重要作用，并可被UHRF1直接调控。同一组蛋白氨基酸的不同甲基化形式可发挥相反的生物学功能:H3R82s与基因抑制密切相关，而H3R82a却是基因活化的一个标志。

目录

声明

摘要

中英文缩写词对照表

前言

1 DNA甲基化

2 组蛋白修饰

3 DNA甲基化与组蛋白修饰的相互作用

4 表观遗传药物治疗肿瘤的优势

材料和方法

1 临床资料

2 实验方法

结果

1 SOCS1，SOCS3，3OST2和DLC1基因启动子在子宫内膜病变组织的甲基化状态

2 SOCS3和3OST2基因启动子甲基化状态在临床病理中的相关性分析

3 5-Aza-dC或／和TSA应用对Ishikawa细胞株中SOCS3和3OST2基因启动子的甲基化状态影响

4 5-Aza-CdR或／和TSA应用对Ishikawa细胞株中SOCS3和3OST2基因mRNA表达的影响

5 5-Aza-CdR或／和TSA应用对Ishikawa细胞中UHRF1表达的影响

6 Western Blot技术分析药物处理前后Ishikawa细胞株中H3R8me1，H3R8me2s和H3R8me2a蛋白水平的变化

7 ChIP-qPCR分析药物处理前后Ishikawa细胞株中SOCS3和3OST2基因启动子区UHRF1、H3R8me2a和H3R8me2s的富集情况

讨论

1 抑癌基因启动子甲基化作为子宫内膜癌早期诊断标记物的意义

2 DNMT抑制剂和HDAC抑制剂在逆转DNA甲基化及增加抑癌基因表达中的作用

3 子宫内膜癌中UHRF1在表观遗传调控中的作用

4 子宫内膜癌中H3R8甲基化在表观遗传调控中的作用

结论

附图表

参考文献

致谢

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