一种呋塞米及其制剂中2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的HPLC检测方法

摘要

本发明公开了一种呋塞米及其制剂中2‑呋喃甲胺及其缩合反应杂质的HPLC检测方法，包括步骤使用高效液相色谱仪采用梯度洗脱方法对呋塞米及其制剂中的2‑呋喃甲胺及其缩合反应杂质进行分离测定，其中检测波长为220nm、270nm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，并以体积份数比为9:1的磷酸二氢钾水溶液、有机相组成的混合溶液为流动相A，以体积份数比为3:7的磷酸二氢钾水溶液、有机相组成的混合溶液为流动相B。本发明能够对呋塞米及其制剂中的2‑呋喃甲胺及其缩合反应杂质降解杂质进行质量控制，保证产品质量和用药安全。

说明书

技术领域

本发明涉及医药制备检测技术领域，具体来说，涉及一种呋塞米及其制剂中2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的HPLC检测方法。

背景技术

呋塞米，又名呋喃苯胺酸、速尿，是一种广泛应用于治疗充血性心力衰竭和水肿的袢利尿药。呋塞米化学结构如下图1所示，图2呋塞米的合成路线及2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的产生途径。由图中可以看出，整个合成过程是2-呋喃甲胺与2，4-二氯-5氨磺酰基苯甲酸缩合反应生产呋塞米粗品，然后经精制得到目标产物。呋塞米制备过程中使用的起始物料2，4-二氯-5氨磺酰基苯甲酸可能带入2，4-二氯苯甲酸，其与2-呋喃甲胺缩合反应产生的杂质以及起始物料2-呋喃甲胺则可能残留在成品中。

现行的呋塞米注射液和呋塞米中国药典质量标准中未明确规定特定杂质，但2-呋喃甲胺以及部分缩合反应物作为潜在的工艺杂质应用该分析方法无法有效检出。呋塞米及其制剂中2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的含量水平的高低直接决定了产品的质量及后续临床用药的安全。

因此，根据杂质需从源头控制的理念考虑，有必要建立一种新的用于呋塞米原料药及其制剂的2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的HPLC(高效液相色谱法(High PerformanceLiquid Chromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等，高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用)分析方法，使杂质能得到有效控制，保证后续产品的质量。

该方法有利于加强呋塞米原料药及其制剂产品内控质量，为工艺条件的优化提供必要的理论和实践依据。

发明内容

针对相关技术中的问题，本发明提出一种呋塞米及其制剂中2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的HPLC检测方法，以对呋塞米及其制剂中的2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质降解杂质进行质量控制，保证产品质量和用药安全。

为此，本发明采用的具体技术方案如下：

一种呋塞米及其制剂中2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的HPLC检测方法，包括步骤使用高效液相色谱仪采用梯度洗脱方法对呋塞米及其制剂中的2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质进行分离测定，其中检测波长为双波长220nm和270nm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，并以体积份数比为9:1的磷酸二氢钾水溶液、有机相组成的混合溶液为流动相A，以体积份数比为3:7的磷酸二氢钾水溶液、有机相组成的混合溶液为流动相B。

优选的，所述梯度洗脱方法按下表进行，

。

优选的，所述磷酸二氢钾水溶液由以下方式配制：用磷酸将浓度为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液调整PH值至2.5。

优选的，有机相为乙腈、甲醇中的一种。

优选的，所述有机相为乙腈。

优选的，所述高效液相色谱仪型号为Shimadzu LC-20AT。

优选的，所述高效液相色谱仪色谱柱的柱温为30-40℃。

优选的，色谱柱的柱温为35℃。

优选的，所述流动相A、B的流速为0.9-1.1mL/min。

优选的，所述流动相A、B的流速为1.0mL/min。

本发明的有益效果为：

本发明的建立的一种用于呋塞米及其制剂中2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的HPLC检测方法，本发明具有分离度好、专属性强、灵敏度高的特点，能够对呋塞米原料药及其制剂的2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质进行质量控制，保证整个产品的质量和临床用药安全。故该法可以作为呋塞米原料药及其制剂中的2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的监测手段。

其中，在色谱柱填料的选择方面，色谱柱选择为十八烷基硅烷键合硅胶。在洗脱步骤方面，采用梯度洗脱方法，是由于各物质的极性相差较大，相比等度洗脱方法，采用梯度条件更易实现目标杂质与其相关主成分和各杂质的有效分离，空白无干扰，杂质之间的分离度均在1.5以上，由于梯度洗脱改善了峰形，杂质的灵敏度和分离度得到显著提高。

在流动相中添加缓冲盐，其原因是，2-呋喃甲胺与2，4-二氯苯甲酸缩合反应产生的杂质中含氨基和羧基，通过在流动相中添加缓冲盐可使被测物增强离子化，提高溶解度，从而有助于分离。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了现有技术中呋塞米的结构分子式；

图2示出了现有技术中呋塞米的合成路线及2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的产生途径示意图；

图3示出了本发明实施例一中的检测色谱图；

图4示出了本发明实施例二中的检测色谱图；

图5示出了本发明实施例三中的检测色谱图。

具体实施方式

为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点，图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通常用来表示类似的组件。

呋塞米原料药制备过程中由于起始物料和缩合反应过程中残留会引入2-呋喃甲胺及2-呋喃甲胺与2，4-二氯苯甲酸缩合反应过程产生的杂质，现行的中国药典质量标准中未明确规定特定杂质，但该分析方法无法有效检出上述杂质，2-呋喃甲胺及2-呋喃甲胺与2，4-二氯苯甲酸缩合反应过程产生的杂质是在呋塞米原料药制备过程中产生，若不对其进行检测和控制可能导致不良反应的发生。因此，通过建立HPLC方法对其进行检测和控制，有利于保证产品质量和临床用药安全。本发明的建立的一种用于呋塞米及其制剂中2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质的HPLC的分析方法，该方法具有分离度好、专属性强、灵敏度高，能够对2-呋喃甲胺及其缩合反应杂质进行质量控制，保证产品质量和用药安全。

实施例一：

本实施例中所采用的仪器以及设置条件如下：

高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT；

色谱柱：Ultimate AQ-C18，4.6×250mm，5μm；

流动相A、B的流速：1.0mL/min；

检测波长：220nm、270nm；

色谱柱柱温：35℃；

稀释剂：95％乙腈；

进样量：10uL；

其中流动相A：将磷酸二氢钾水溶液与乙腈按照体积份数比9：1配置为流动相A，其中磷酸二氢钾水溶液由以下方式配制：用磷酸将浓度为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液调整PH值至2.5；

流动相B：将磷酸二氢钾水溶液与乙腈按照体积份数比3：7配置为流动相B，其中磷酸二氢钾水溶液由以下方式配制：用磷酸将浓度为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液调整PH值至2.5。

按表进行梯度洗脱：

梯度洗脱的具体步骤可以为：

0min，流动相A为100％，流动相B为0％；10min，流动相A为100％，流动相B为0％；20min，流动相A为67％，流动相B为33％；40min，流动相A为67％，流动相B为33％；50min，流动相A为0％，流动相B为100％；60min，流动相A为0％，流动相B为100％；62min，流动相A为100％，流动相B为0％；75min，流动相A为100％，流动相B为0％。

实验步骤：

步骤一：溶液配制

系统适应性溶液：取4-氯-2-[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2,4-二[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2-呋喃甲胺、呋喃甲醛和呋塞米对照品各适量，加溶剂溶解并稀释制成每lml中分别约含4-氯-2-[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2,4-二[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2-呋喃甲胺、呋喃甲醛、呋塞米各2μg的溶液。

供试品溶液：避光操作，取本品适量，用溶剂(95％的乙腈水溶液)溶解并定量稀释制成每1ml中约含呋塞米1mg的溶液。

对照溶液：取呋塞米对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释为1ml约含呋塞米2ug的溶液。

步骤二：测定

精密量取系统适应性溶液、供试品溶液和对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述测定色谱条件测试，供试品检测典型图谱见下图3。

实施例2

本实施例中所采用的仪器以及设置条件如下

高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT；

色谱柱：Ultimate AQ-C18，4.6×250mm，5μm；

流动相A、B的流速：0.9mL/min；

检测波长：220nm、270nm；

色谱柱柱温：35℃；

稀释剂：95％乙腈；

进样量：10uL；

其中流动相A：将磷酸二氢钾水溶液与乙腈按照体积份数比9：1配置为流动相A，其中磷酸二氢钾水溶液由以下方式配制：用磷酸将浓度为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液调整PH值至2.5；

流动相B：将磷酸二氢钾水溶液与乙腈按照体积份数比3：7配置为流动相B，其中磷酸二氢钾水溶液由以下方式配制：用磷酸将浓度为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液调整PH值至2.5。

按表进行梯度洗脱：

梯度洗脱的具体步骤可以为：

0min，流动相A为100％，流动相B为0％；10min，流动相A为100％，流动相B为0％；20min，流动相A为67％，流动相B为33％；40min，流动相A为67％，流动相B为33％；50min，流动相A为0％，流动相B为100％；60min，流动相A为0％，流动相B为100％；62min，流动相A为100％，流动相B为0％；75min，流动相A为100％，流动相B为0％。

实验步骤：

步骤一：溶液配制

系统适应性溶液：取4-氯-2-[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2,4-二[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2-呋喃甲胺、呋喃甲醛和呋塞米对照品各适量，加溶剂溶解并稀释制成每lml中分别约含4-氯-2-[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2,4-二[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2-呋喃甲胺、呋喃甲醛、呋塞米各2μg的溶液。

供试品溶液：避光操作，取本品适量，用溶剂(95％的乙腈水溶液)溶解并定量稀释制成每1ml中约含呋塞米1mg的溶液。

对照溶液：取呋塞米对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释为1ml约含呋塞米2ug的溶液。

步骤二：测定

精密量取系统适应性溶液、供试品溶液和对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述测定色谱条件测试，供试品检测典型图谱见下图4。

实施例3

本实施例中所采用的的仪器以及设置条件：

高效液相色谱仪：Shimadzu LC-20AT

色谱柱：Ultimate AQ-C18，4.6×250mm，5μm

流动相A、B的流速：1.0mL/min

检测波长：220nm、270nm

色谱柱柱温：35℃

稀释剂：95％乙腈

进样量：10uL

其中流动相A：将磷酸二氢钾水溶液与乙腈按照体积份数比9：1配置为流动相A，其中磷酸二氢钾水溶液由以下方式配制：用磷酸将浓度为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液调整PH值至2.5；

流动相B：将磷酸二氢钾水溶液与乙腈按照体积份数比3：7配置为流动相B，其中磷酸二氢钾水溶液由以下方式配制：用磷酸将浓度为0.03mol/L磷酸二氢钾水溶液调整PH值至2.5。

按表进行梯度洗脱：

梯度洗脱的具体步骤可以为：

0min，流动相A为100％，流动相B为0％；10min，流动相A为100％，流动相B为0％；20min，流动相A为67％，流动相B为33％；40min，流动相A为67％，流动相B为33％；50min，流动相A为0％，流动相B为100％；60min，流动相A为0％，流动相B为100％；62min，流动相A为100％，流动相B为0％；75min，流动相A为100％，流动相B为0％。

实验步骤：

步骤一：溶液配制

系统适应性：取4-氯-2-[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2,4-二[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2-呋喃甲胺、呋喃甲醛和呋塞米对照品各适量，加溶剂溶解并稀释制成每lml中分别约含4-氯-2-[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2,4-二[(呋喃-2-甲基)氨基]苯甲酸、2-呋喃甲胺、呋喃甲醛、呋塞米各2μg的溶液。

供试品溶液：避光操作，取本品适量，用溶剂(95％的乙腈水溶液)溶解并定量稀释制成每1ml中约含呋塞米1mg的溶液。

对照溶液：取呋塞米对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释为1ml约含呋塞米2ug的溶液。

步骤二：测定

精密量取系统适应性溶液、供试品溶液和对照溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述测定色谱条件测试，供试品检测典型图谱见下图5。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。