一种提升长双歧杆菌增殖效率的肽及其应用

摘要

本发明公开了一种提升长双歧杆菌增殖效率的肽及其应用，属于微生物技术领域。本发明为解决因氮源利用率低影响长双歧杆菌增殖的问题，提供了一种提升长双歧杆菌增殖效率的方法，该方法以分子量为1500～2000Da、富含脯氨酸的亲水性肽作为培养基的氮源培养长双歧杆菌。利用该方法培养长双歧杆菌，4g/L氮源培养浓度下发酵液OD600高于2.5，为其他氮源的1.8～2.5倍，代时小于2.1h，氮源利用率高于35％。该方法在实现高效促进菌株生长的同时，显著提高氮源利用效率，有效减少氮源的浪费。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提升长双歧杆菌增殖效率的肽及其应用，本发明属于微生物技术领域。

背景技术

双歧杆菌(Bifidobacteria)是存在于人和动物肠道中的益生菌，是肠道正常菌群之一，同时也是影响消化道生理环境的生理性细菌，目前已确定的双歧杆菌具有抗癌、免疫调节、防止便秘等功效，鉴于其具有上述有效的益生功能，双歧杆菌也越来越成为人们研究、开发、生产的重点，也被逐渐应用到益生菌乳制品生产中。但是目前商业化应用的双歧杆菌菌株种类较少，主要在于双歧杆菌的制备非常困难，氮源是制约其有效增殖的关键因素之一。

目前，国内外对于长双歧杆菌的培养优化，主要是通过单因素试验和正交试验筛选优质的氮源，主要包括酵母浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、鱼骨蛋白胨等多种氮源。但是前期研究发现，即使是具有有效促生长活性的酵母提取物氮源，即使添加0.25％的酵母提取物也不会刺激长双歧杆菌ATCC 15708的生长。此外，这类方法确定的氮源的添加量往往是过量的，生长过程中，培养基中会残留大量未被利用的肽和氨基酸，利用效率低，不仅会提高发酵液的渗透压从而抑制菌株的增殖，也会造成氮源的浪费。

基于现有技术中缺少适用于长双歧杆菌高效增殖的氮源，以提高在长双歧杆菌生长过程中的氮源的利用率，因此，找到一种适宜长双歧杆菌高效增值的氮源对于长双歧杆菌商业化应用变得尤为重要。

发明内容

本发明针对长双歧杆菌培养过程中因氮源利用率低影响长双歧杆菌增殖的问题，提供了一种提升长双歧杆菌增殖效率的方法，所述方法用脯氨酸含量介于16％～20％、分子量介于1500～2000Da的亲水性肽培养长双歧杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸含量介于16％～20％、分子量介于1500～2000Da的亲水性肽作为培养基的氮源。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH

本发明还提供了一种提升长双歧杆菌氮源利用率的方法，所述方法用脯氨酸含量介于16％～20％、分子量介于1500～2000Da的亲水性肽培养长双歧杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述脯氨酸含量介于16％～20％、分子量介于1500～2000Da的亲水性肽作为培养基的氮源。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH

本发明还提供了脯氨酸含量介于16％～20％、分子量介于1500～2000Da的亲水性肽的制备方法，具体步骤如下：

(1)将酪蛋白与水混匀后，加入蛋白酶，进行酶解，经灭酶处理后，沉淀未水解蛋白并离心收集蛋白酶解液，对蛋白酶解液真空冷冻干燥得到酪蛋白酶解物干粉；

(2)将酪蛋白酶解物干粉溶于水后，用截流量为2000Da的滤膜进行超滤处理并收集滤液；

(3)采用NAK-II大孔树脂对步骤(2)获得的滤液浓缩富集，最后采用超滤膜收集分子量介于1500～2000Da的组分，即得分子量为1500～2000Da的肽。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中配制的酪蛋白溶液的浓度为65～75g/L；酪蛋白酶解在恒温pH下进行，酶解温度为45～50℃，pH为6.5～7，酶解时间为0.5～1h；所述蛋白酶选用胰蛋白酶，添加量为3500～4000U/g pro。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中配制的酪蛋白溶液的浓度为70g/L，酪蛋白酶解在恒温恒pH下进行，温度为50℃，pH为7，酶解时间为0.5h，所述蛋白酶选用胰蛋白酶，添加量为4000U/g pro。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)对于酶解完成的酪蛋白水解物，采用沸水浴10min进行灭酶处理，并将pH调整至4.6沉淀未水解物的蛋白，并8000r/min，15min离心取上清。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)对酪蛋白肽混合组分进行NAK-II大孔树脂分离时，洗脱液依次选用浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80％(v/v)的乙醇，流速为1.5mL/min，检测波长为220nm。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)利用截流量为1500Da的超滤膜收集分子量介于1500～2000Da的组分。

在本发明的一种实施方式中，测定不同氮源对长双歧杆菌的增殖效果时，氮源的添加量为4g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述的长双歧杆菌菌液的制备方法是通过将长双歧杆菌接种至培养基中进行培养，接种量为2％。

在本发明的一种实施方式中，所述的长双歧杆菌最高生长量的测定是将长双歧杆菌接种至培养基中培养至对数期末期并测定OD

在本发明的一种实施方式中，所述的长双歧杆菌包括长双歧杆菌CGMCCNO:15032、长双歧杆菌GDMCCNO:60461、长双歧杆菌GDMCCNO:60926。

本发明还提供了一种培养基，所述培养基中的氮源为脯氨酸含量介于16％～20％、分子量介于1500～2000Da的亲水性肽。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基的成分还含有葡萄糖、无水乙酸钠、KH

本发明还提供了上述提升长双歧杆菌增殖效率的方法、提升长双歧杆菌氮源利用率的方法、脯氨酸含量介于16％～20％、分子量介于1500～2000Da的亲水性肽的制备方法和上述培养基在培养长双歧杆菌中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种提升长双歧杆菌增殖效率的方法，是利用以脯氨酸含量介于16％～20％、分子量介于1500～2000Da的亲水性肽为氮源的培养基培养长双歧杆菌。利用该方法培养长双歧杆菌时，4g/L氮源培养浓度下长双歧杆菌OD

本发明中，依据长双歧杆菌利用肽的分子量及结构特性，结合蛋白酶酶解技术、超滤以及NAK-II大孔树脂分离技术，依次对肽组分进行区分浓缩，获得了适宜长双歧杆菌高效增殖的肽，以所述肽为氮源的培养基培养长双歧杆菌，可使氮源利用率达35％以上，其他氮源的利用率仅在10％以下，有效提高了氮源的利用效率，有效减少氮源的浪费。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的酪蛋白购自于创赛生物科技有限公司；下述实施例中涉及的风味蛋白酶购自于江苏博美达科技有限公司；下述实施例中涉及的酵母浸粉FM888、牛肉浸粉、胰蛋白胨、鱼蛋白胨购自于安琪酵母股份有限公司；下述实施例中涉及的磷酸钾、2-脱氧葡萄糖、葡萄糖购自于国药化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的长双歧杆菌CCFM760购自于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.15032，公开于申请号为201711444295.1的专利中；

长双歧杆菌CCFM1029购自于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:60461，公开于申请号为201910137571.2的专利中；

长双歧杆菌CCFM1109购自于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号分别为GDMCCNO:60926，公开于申请号为202010161914.1的专利中。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS-L液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K

固体MRS-L培养基：在液体MRS-L培养基成分的基础上，添加1.5％的琼脂粉，115℃、20min高压灭菌。灭菌冷却至50～60℃后，向培养基中加入0.1％的莫匹罗星，混匀后，按每个培养皿15mL倒入培养基，待其凝固后采用保鲜膜包裹保藏于4℃冰箱中备用。

基础培养基：无水葡萄糖30g/L，无水乙酸钠4g/L，KH

下述实施例中涉及的检测方法如下：

发酵液中氮含量的测定方法：采用凯氏定氮法测定，具体可见参考文献：林艺华.硫酸蒽酮法测定风柜斗草粗多糖含量[J].福建分析测试,2017,26(06):52-55.。

实施例1：可提升长双歧杆菌增殖效率的肽的定向制备方法

本实施例中，通过实验鉴定可被长双歧杆菌利用的肽，总结其规律及肽的特征，制备获得可提升长双歧杆菌增殖效率的肽。本实施例中选用的长双歧杆菌分别为长双歧杆菌CGMCC NO.15032、长双歧杆菌GDMCC NO:60461、长双歧杆菌GDMCC NO:60926。

具体操作如下：

(1)将冷藏于-80℃的保菌管取出，待其融化后，用接种环蘸取少量菌液于MRS-L固体培养基上划线，于厌氧工作站中37℃恒温培养48h。待其长出菌落后，挑取单菌落接种于5mL MRS-L液体管中，厌氧培养18h～24h，按上述操作重复2-3次得到活化的菌液。

(2)将酪蛋白以70g/L的浓度与水混合，加入胰蛋白酶(添加量为4000U/g pro)，pH调整为7，温度为50℃恒温恒pH酶解0.5小时，酶解完成后，沸水浴10min进行灭酶处理，pH调整为4.6沉淀未水解的酪蛋白，8000r/min，15min离心取上清，冻干后收集菌粉备用。

(3)对于(2)中制备得到的胰蛋白酶水解物，采用截留分子量为2000Da的膜进行超滤处理，除去大分子蛋白及多肽，收集分子量小于2000Da的组分A，经旋蒸浓缩后冻干备用。

(4)采用肽转运实验测定A中可对三株长双歧杆菌有效转运的肽段。主要操作如下：离心去除培养基，收集菌泥，用100mM的磷酸钾(含5mM MgSO

综上可知，被长双歧杆菌高效转运的肽段主要为脯氨酸含量介于16％～20％、分子量介于1500～2000Da的亲水性肽。

表1长双歧杆菌转运肽特征分析

(5)基于上述分析，制备提升长双歧杆菌增殖效率的肽，选取步骤(3)收集到的组分A进行后续制备，主要操作如下：

配制浓度为50mg/mL的组分A溶液，利用5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80％(v/v)浓度的乙醇对溶液A进行NAK-II大孔树脂分离，根据组分亲疏水性进行分离洗脱，收集洗脱液并冷冻干燥收集。得到3个组分B1(5～20％)、B2(25～50％)、B3(55～80％)，收集分离组分B1。

(6)对于(5)中收集到的B1组分，选用截流量为1500Da的超滤膜对该组份进行分离处理，收集组分C(1500～2000Da)，真空冷冻干燥收集干粉。采用液质检测技术，测定组分C中肽段结构，结果表明组分C中肽段中脯氨酸含量占比达到17％。

实施例2：适宜长双歧杆菌高效增殖的肽的应用

本实施例中选用的长双歧杆菌分别为长双歧杆菌CGMCC NO.15032、长双歧杆菌GDMCC NO:60461、长双歧杆菌GDMCC NO:60926。

利用实施例1中制备得到的肽组分C培养三株长双歧杆菌，测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时及氮源利用率。

(1)将实施例1中制备得到的肽组分C，以4g/L的浓度添加至基础培养基中，分别培养三株长双歧杆菌，以2％接种量接种活化好的菌液，每隔2h测定OD

(2)通过凯氏定氮法测定发酵前后氮含量，计算发酵前后氮源利用率。

检测结果见表2，由结果可知，用实施例1制备得到的组分C培养长双歧杆菌时增殖效果较好，最终发酵液OD

表2长双歧杆菌利用实施例1中制备的肽组分C的增殖情况

对比例1

将实施例2中的肽组分C替换成酵母浸粉FM888，分别培养三株长双歧杆菌，并测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时以及氮源利用率。

检测结果见表3，由结果可知，三株长双歧杆菌酵母浸粉FM888为氮源增殖时，发酵液OD

表3长双歧杆菌利用酵母浸粉FM888的增殖情况

对比例2

将实施例2中的肽组分C替换成牛肉浸粉分别培养三株长双歧杆菌，并测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时以及氮源利用率。

检测结果见表4，由结果可知，三株长双歧杆菌以牛肉浸粉为氮源增殖时，发酵液液OD

表4长双歧杆菌利用牛肉浸粉的增殖情况

对比例3

将实施例2中的肽组分C替换成鱼蛋白胨分别培养三株长双歧杆菌，并测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时以及氮源利用率。

检测结果见表5，由结果可知，三株长双歧杆菌以鱼蛋白胨为氮源增殖时，发酵液液OD

表5长双歧杆菌利用鱼蛋白胨的增殖情况

对比例4

将实施例2中的肽组分C替换成胰蛋白胨分别培养三株长双歧杆菌，并测定菌株在该组分下的最高生物量、生长代时以及氮源利用率。

检测结果见表6，由结果可知，三株长双歧杆菌以胰蛋白胨为氮源增殖时，发酵液OD

表6长双歧杆菌利用胰蛋白胨的增殖情况

虽然本发明已在较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。