基于固态纳米孔的HIV-1抗体+抗原检测装置及方法

摘要

本发明涉及基于固态纳米孔的HIV‑1抗体+抗原检测装置及方法，属于生物检测领域。检测装置包括可拆卸连接的第一绝缘板和第二绝缘板；第一绝缘板和第二绝缘板上设有相连通的通道，通道内嵌设带有窗口的芯片，芯片上设有与窗口连通的纳米孔，纳米孔的孔径为14～15nm，芯片将通道分隔成顺式腔和反式腔，芯片的窗口朝向顺式腔；顺式腔和反式腔内注有同体积的易位电解缓冲液，其中顺式腔内的易位电解缓冲液含有HIV‑1抗体样品；顺式腔和反式腔内分别插有电极，两个电极与数据采集系统相连。检测过程简单、快速，检测灵敏度高、信噪比高。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种基于固态纳米孔的HIV-1抗体+抗原检测装置及方法。

背景技术

HIV是攻击免疫系统的病毒，也是艾滋病(获得性免疫缺陷综合征，AIDS)的病原体，因此对HIV感染者早期诊断、靶向治疗、延长寿命至关重要。纳米孔单分子检测技术起源于库尔特计数器的发明以及单通道电流的记录技术，1996年开始发展起来的单分子分析手段，是具有非标记、实时监测、灵敏度高、检测速度快和操作简单等优点的新型传感检测技术。该方法应用于HIV组分单分子的检测，能够进一步缩短窗口期，为HIV感染者争取较短诊断时间。迄今为止，HIV实验室诊断主要依据血清学试验进行初筛试验和确认试验，第一代初筛检测试剂检测血清中的抗体容易出现假阳性和假阴性的诊断；第二代初筛检测试剂同时检测HIV-1和HIV-2但容易漏检；第三代初筛检测试剂使用双抗原检测抗体，灵敏度相对以前较高但窗口期较长；第四代初筛检测试剂缩短了窗口期4～7天，但仍需要2周左右的窗口期。单独检测HIV核酸序列虽能缩短窗口期，但需专业人员检测，步骤繁琐且价格昂贵，不利于医院普及。因此，需要探索更为简单、快速、高灵敏度和高信噪比的HIV检测手段。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于固态纳米孔的HIV-1抗体+抗原检测装置及方法，以解决现有检测技术存在的不足。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于固态纳米孔的HIV-1抗体+抗原检测装置，包括可拆卸连接的第一绝缘板和第二绝缘板；第一绝缘板和第二绝缘板相互背离的一面分别设有圆形的容腔，相互朝向的一面分别设有方形的凸台和用于卡入凸台的方形的凹槽，第一绝缘板和第二绝缘板的容腔的底部分别设有贯穿凸台和贯穿凹槽的圆形的开口，开口的孔径小于容腔，第一绝缘板的容腔和开口依次与第二绝缘板的开口和容腔形成相连通的通道；在凸台和凹槽配合后形成的间隙内设置方形的带有窗口的芯片，并且在芯片的两面设有弹性O型圈；芯片上设有与窗口连通的纳米孔，纳米孔的孔径为14～15nm，芯片将通道分隔成顺式腔和反式腔，芯片的窗口朝向顺式腔；顺式腔和反式腔内注有同体积的易位电解缓冲液，其中顺式腔内的易位电解缓冲液含有HIV-1抗体+抗原样品；顺式腔和反式腔内分别插有电极，两个电极与数据采集系统相连。

进一步，第一绝缘板上均布有沉孔，第二绝缘板板上均布有与沉孔相对应的螺纹孔，通过插入沉孔和螺纹孔的螺钉将第一绝缘板和第二绝缘板连接。

进一步，芯片具有中间的硅基层和覆在硅基层两面的SiNx薄膜层，纳米孔设在芯片其中一面的SiNx薄膜层上。

进一步，通道沿第一绝缘板和第二绝缘板的轴线布置。

使用基于固态纳米孔的HIV-1抗体+抗原检测装置的方法，包括以下步骤：

S1.预处理：先用无水乙醇将带有窗口的芯片浸泡30分钟，对其窗口表面进行亲疏水性的处理；再用去离子水浸泡10分钟，洗去其表面的无水乙醇以及溶解表面的无机盐；最后再用无水乙醇浸泡10分钟；

S2.制备纳米孔：在第一绝缘板的凸台和第二绝缘板的凹槽配合后形成的间隙内设置好芯片及位于芯片两面的O型圈，先用无水乙醇润洗顺式腔和反式腔；再向顺式腔和反式腔内注入200μL打孔电解缓冲液；然后用电极分别将顺式腔和反式腔与外接电源连接，形成闭合回路；顺式腔接地，反式腔施加电流脉冲击穿芯片形成初孔，然后施加电压脉冲将初孔扩至目标孔径14～15nm，得到所需与窗口连通的纳米孔；

S3.检测样品：制备好纳米孔后，先用去离子水清洗顺式腔和反式腔，并用无水乙醇进行润洗；再向顺式腔和反式腔内加入200μL的易位电解缓冲液，并向顺式腔内加入HIV-1抗体+抗原样品；顺式腔和反式腔的电极与数据采集系统相连，先测纳米孔的I-V曲线，计算出纳米孔的孔径；再向顺式腔和反式腔施加100mV电压以测空白信号；然后再检测HIV-1抗体+抗原样品，其中向顺式腔施加100mV电压以驱使HIV-1抗体+抗原通过纳米孔，并记录过孔所产生的离子阻塞电流脉冲信号。

进一步，制备纳米孔中，进行电流脉冲打初孔的参数包括：输出电流为3E-8，步长为3E-9，正参数为1，负参数为0；进行电压脉冲扩孔的参数包括：输出电压为6V，步长为0.1V，正参数为1，负参数为1，目标孔径为14～15nm，其中输出电压逐渐增大到6V，当输出电压达到6V时，循环扩孔至目标孔径。

进一步，打孔电解缓冲液由氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和去离子水混合而成，比例是氯化钾：三羟甲基氨基甲烷：乙二胺四乙酸＝1M：10mM：1mM，并将该打孔电解缓冲液的pH调至8；易位电解缓冲液由氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和去离子水混合而成，比例是氯化钠：三羟甲基氨基甲烷：乙二胺四乙酸＝1M：10mM：1mM，并将该易位电解缓冲液的pH调至8。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的检测装置，结构简单，方便操作，制作成本较低，易于实施和推广。通过第一绝缘板和第二绝缘板对芯片提供支撑，并形成位于芯片两侧的顺式腔和反式腔，在芯片上加工纳米孔，利用纳米孔实现对HIV-1抗体和HIV-1抗原的同时检测。这一检测方法的检测过程简单快速，缩短了HIV检测窗口期，能够检测出较低浓度的HIV-1抗体和HIV-1抗原，检测灵敏度高、信噪比高，还能推断出样品在易位时有空间结构的变化。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为基于固态纳米孔的HIV-1抗体+抗原检测装置的俯视示意图；

图2为图1中的B-B剖视图；

图3a为纳米孔的I-V曲线；

图3b为HIV-1P24抗体+抗原分子易位事件统计图；

图3c为HIV-1P24抗体+抗原分子时间衰减分布图以及指数衰减拟合；

图3d为HIV-1P24抗体+抗原分子易位电流幅值统计图。

附图标记：第一绝缘板1、容腔2、开口3、沉孔4、螺钉5、第二绝缘板6、螺纹孔7、芯片8、窗口9、纳米孔10、弹性O型圈11、电极12、数据采集系统13。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本发明的限制；为了更好地说明本发明的实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。

本发明实施例的附图中相同或相似的标号对应相同或相似的部件；在本发明的描述中，需要理解的是，若有术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此附图中描述位置关系的用语仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

请参阅图1～图2，为一种基于固态纳米孔10的HIV-1抗体+抗原检测装置，包括呈方形的第一绝缘板1和第二绝缘板6，采用聚四氟乙烯或者其他绝缘材料制成。第一绝缘板1的四周均布四个沉孔4，第二绝缘板6的四周均布四个与沉孔4相对应的螺纹孔7，通过插入沉孔4和螺纹孔7的螺钉5实现第一绝缘板1和第二绝缘板6的可拆卸连接。

第一绝缘板1和第二绝缘板6相互背离的一面分别沿轴线设有圆形的容腔2，相互朝向的一面分别沿轴线设有方形的凸台和用于卡入凸台的方形的凹槽，第一绝缘板1和第二绝缘板6的容腔2的底部分别沿轴线设有贯穿凸台和贯穿凹槽的圆形的开口3，开口3的孔径小于容腔2，第一绝缘板1的容腔2和开口3依次与第二绝缘板6的开口3和容腔2形成相连通的通道。

在凸台和凹槽配合后形成的间隙内设置方形的带有窗口9的芯片8，芯片8将通道分隔成顺式腔和反式腔，芯片8的窗口9朝向顺式腔。芯片8具有中间的硅基层和覆在硅基层两面的SiNx薄膜层，其中一面的SiNx薄膜层上开设与窗口9连通的纳米孔10，纳米孔10的孔径为14～15nm。此外，芯片8的两面设有弹性O型圈，在拧紧螺钉5时，通过两弹性O型圈夹紧芯片8，以防划伤芯片8。

顺式腔和反式腔内分别插有电极12，本实施例采用Ag/Ag Cl电极12。

使用该检测装置同时检测HIV-1抗体+抗原的方法，本实施例中检测样品具体是浓度为0.023μm的HIV-1P24抗体样品，以及浓度为1.509μm的HIV-1P24抗原样品，包括以下步骤：

S1.预处理：先用无水乙醇将带有窗口9的芯片8浸泡30分钟，对其窗口9表面进行亲疏水性的处理；再用去离子水浸泡10分钟，洗去其表面的无水乙醇以及溶解表面的无机盐；最后再用无水乙醇浸泡10分钟；

S2.制备纳米孔10：在第二绝缘板6的凹槽内依次放置弹性O型圈、芯片8和另一弹性O型圈，将第一绝缘板1的凸台对准凹槽，沉孔4对准螺纹孔7，拧紧螺钉5，完成安装；分别取200μL无水乙醇润洗顺式腔和反式腔，防止后期加液时顺式腔和反式腔内产生气泡；再向顺式腔和反式腔内注入200μL打孔电解缓冲液；然后用电极12分别将顺式腔和反式腔与外接电源连接，形成闭合回路；顺式腔接地，反式腔施加电流脉冲击穿芯片8形成初孔，然后施加电压脉冲将初孔扩至目标孔径14～15nm，得到所需与窗口9连通的纳米孔10；

其中，打孔电解缓冲液由氯化钾、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和去离子水混合而成，比例是氯化钾：三羟甲基氨基甲烷：乙二胺四乙酸＝1M：10mM：1mM，并将该打孔电解缓冲液的pH调至8；

进行电流脉冲打初孔的参数包括：输出电流为3E-8，步长为3E-9，正参数为1，负参数为0；进行电压脉冲扩孔的参数包括：输出电压为6V，步长为0.1V，正参数为1，负参数为1，目标孔径为14～15nm，其中输出电压逐渐增大到6V，当输出电压达到6V时，循环扩孔至目标孔径；

S3.检测样品：制备好纳米孔10后，先用去离子水清洗顺式腔和反式腔，并用无水乙醇进行润洗，防止后期加液时顺式腔和反式腔内产生气泡；再向顺式腔和反式腔内加入200μL的易位电解缓冲液；顺式腔和反式腔的电极12与数据采集系统13相连，先测纳米孔10的IV曲线，计算出纳米孔10的孔径；再向顺式腔和反式腔施加50mV电压以测空白信号；然后再检测不同浓度HIV-1抗体样品，其中向顺式腔施加50mV电压以驱使HIV-1抗体通过纳米孔10，并记录过孔所产生的离子阻塞电流脉冲信号；

其中，易位电解缓冲液由氯化钠、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和去离子水混合而成，比例是氯化钠：三羟甲基氨基甲烷：乙二胺四乙酸＝1M：10mM：1mM，并将该易位电解缓冲液的pH调至8。

完成检测步骤后，对检测结果进行多维度分析，具体而言：

如图3a所示，根据如下公式计算出纳米孔10的孔径：

其中，d表示指纳米孔10的孔径，σ表示纳米孔10所在的Si Nx薄膜层厚度，G

结合图3b、3c和3d，图中事件分布符合指数衰减分布，其衰减时间为0.83863ms。电流幅值集中在120pA，分布较为集中，说明本实施例提供的检测方法能很好地检测到HIV-1抗体+抗原分子，并且还能推断出样品在易位时有空间结构的变化。此外，该检测方法可用于检测不同浓度的HIV-1抗体+抗原分子，而且在同浓度条件下，检测结果重复性好。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。