核酸分子、PCR引物对及用于检测禽毛滴虫TBP基因的试剂盒

摘要

本发明公开了一种核酸分子、PCR引物对及用于检测禽毛滴虫TBP基因的试剂盒。发明人通过广泛研究，在禽毛滴虫中克隆得到如SEQ ID NO:1所示的禽毛滴虫TBP全长基因编码序列，并利用该TBP全长基因编码序列进一步设计得到能够检测禽毛滴虫TBP基因及其转录水平的PCR引物对和相应的PCR反应条件，进而组装成用于检测禽毛滴虫TBP基因的试剂盒，从而可以满足寄生生物学、生命科学研究者的检测需要，以及促进对该病原的基因水平检测及其转录调控信号的研究进展，为基因功能研究和药物开发等研究工作提供有利技术支撑。上述PCR引物对重复性高，特异性强，灵敏度高，对非目的基因没有扩增信号。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种核酸分子、PCR引物对及用于检测禽毛滴虫TBP基因的试剂盒。

背景技术

我国养鸽历史悠久，将鸽子作为商品生产也有100多年历史，现阶段肉鸽养殖业已经遍布我国各个地区，并且规模不断壮大，鸽感染性疾病的有效防控也越发重要。其中，鸽毛滴虫病(又称“鸽癀”)也是养鸽场高发的消耗性寄生虫病，对肉鸽生产性能和幼鸽存活率均具有重要危害性。最常见的特征变化是口腔和咽喉黏膜形成粗糙钮扣状的黄色沉着物；湿润者，称为湿性溃疡；呈干酪样或痂块状则称为干性溃疡。脐部感染时，皮下形成肿块，呈干酪样或溃疡性病变；波及内脏器官时，便引起黄色粗糙界线明显的干酪样病灶，结果导致实质器官组织坏死。病鸽因口腔溃疡而妨害采食，在幼鸽和生长期鸽中可引起很高的死亡率。鸽毛滴虫病的病原是禽毛滴虫，属鞭毛亚门，动鞭毛纲，多鞭毛目，毛滴虫科，毛滴虫属。实验室诊断一般通过显微镜检查口腔、食道、嗉囊分泌物涂片发现虫体，或刮取病变处黏液制成涂片，染色镜检见到典型虫体。禽毛滴虫虫体呈瓜子形或梨形，虫体前端有毛基体伸出4根鞭毛，使虫体可迅速移动。在虫体的一侧有波动膜，其起始于虫体的前端，终止于虫体稍后方虫体前部有1椭圆形的核，虫体前部与波动膜相对，一侧有胞口，虫体中央有一根细长的轴柱自前向后伸延至虫体后缘之外。虫体凭借在体液中作螺旋式运动，以分裂方式增殖，约4小时便可增殖一世代。目前对于该病原的致病机制研究仍很少，究其原因，在于缺乏有效的基因水平检测手段。

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。其中，荧光定量PCR是一种常见的核酸定量技术，也是低成本，重复性高，便于操作的基因水平检测手段。该技术在PCR反应系统中引入了SYBR、TB Green等核酸荧光标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的增加情况，进而实时监测PCR的扩增情况，并拟合出每个样本的荧光定量变化曲线，从而获得每个反应管的Ct值(荧光变化达到阈值时的循环数)，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。

TBP蛋白，全称TATA binding protein，是广泛存在于真核细胞的重要转录因子。该蛋白可以高亲和力结合RNA pol I、RNA pol II和RNA pol III等遗传信息的翻译转录调控关联蛋白的TATA盒区域，从而确保细胞正常增殖生长。因此，TBP基因及其转录水平检测，可以有助于研究生物体的遗传代谢情况，也是潜在的药物靶标之一。

但是，禽毛滴虫作为肉鸽重要致病性寄生虫，对于其转录调控信号的研究报道极为匮乏，TBP基因也没有在NCBI、Uniprot等核酸序列数据库公开，这阻碍了对该病原的基因水平检测及其转录调控信号的研究进展。

发明内容

基于此，有必要提供一种展示禽毛滴虫的TBP全长基因编码序列的核酸分子。

一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种PCR引物对，所述PCR引物对能够通过PCR扩增反应检测如上所述的核酸分子。

在其中一个实施例中，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的下游引物，或核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的下游引物。

本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的核酸分子。

在其中一个实施例中，所述重组载体基于pMD18T载体、pUC18载体或PBR322载体构建得到。

本发明还提供了一种如上所述的核酸分子、PCR引物对或重组载体在制备用于检测、扩增或表达禽毛滴虫TBP基因的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于检测禽毛滴虫TBP基因的试剂盒，其包括如上所述的核酸分子、如上所述的PCR引物对和如上所述的重组载体中的一种或多种。

在其中一个实施例中，试剂盒还包括荧光PCR染料、DNA聚合酶、dNTPs和水中的一种或多种。

在其中一个实施例中，试剂盒还包括逆转录酶和逆转录引物。

本发明还提供了一种禽毛滴虫TBP基因的检测方法，其包括以下步骤：

提取待测样本的核酸，得到核酸样本；

以提取的核酸样本作为模板，加入如上所述的PCR引物对进行PCR扩增反应；

获取PCR扩增反应的结果。

发明人通过广泛研究，在禽毛滴虫中克隆得到如SEQ ID NO:1所示的禽毛滴虫TBP全长基因编码序列，并利用该TBP全长基因编码序列进一步设计得到能够检测禽毛滴虫TBP基因及其转录水平的PCR引物对和相应的PCR反应条件，进而组装成用于检测禽毛滴虫TBP基因的试剂盒，从而可以满足寄生生物学、生命科学研究者的检测需要，以及促进对该病原的基因水平检测及其转录调控信号的研究进展，为基因功能研究和药物开发等研究工作提供有利技术支撑。上述PCR引物对、试剂盒和检测方法可以通过使用实时荧光定量PCR技术，实现对禽毛滴虫TBP基因及其转录水平的荧光定量检测，且该PCR引物对用于禽毛滴虫TBP基因及其转录水平的检测，使用方法快速简便，重复性高，特异性强，灵敏度高，对非目的基因没有扩增信号。

附图说明

图1为实施例4中禽毛滴虫TBP基因的扩增曲线；

图2为实施例4中禽毛滴虫TBP基因的熔解曲线。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语解释

“实时荧光定量PCR”(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。Real-time PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。根据检测原理包括荧光染料法和荧光探针法。荧光染料法通过在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，该染料只与双链DNA小沟结合，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光，因此在PCR体系中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。荧光探针法通过PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR仪检测不到荧光信号；PCR扩增时(在延伸阶段)，Taq酶的5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

“载体”(vector)是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。

“逆转录”即反转录，是以RNA为模板，通过逆转录酶，合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，按5’→3’方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA,cDNA)，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在逆转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。

本发明一实施例的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

发明人通过广泛研究，在禽毛滴虫中克隆得到如SEQ ID NO:1所示的禽毛滴虫TBP全长基因编码序列，利用该TBP全长基因编码序列可以进一步设计得到能够检测禽毛滴虫TBP基因及其转录水平的PCR引物对，并组装成用于检测禽毛滴虫TBP基因的各种类型试剂盒，从而满足寄生生物学、生命科学研究者的检测需要，促进对该病原的基因水平检测及其转录调控信号的研究进展，为基因功能研究和药物开发等研究工作提供有利技术支撑。

本发明一实施例的PCR引物对，其能够通过PCR扩增反应检测如上所述的核酸分子。

PCR引物对是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR(聚合酶链式反应)技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在耐高温DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。

在一个具体示例中，上述PCR引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的下游引物，或核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的下游引物。可以理解，能够扩增上述核酸分子的PCR引物对不限于此，可以根据设计规则设计得到其他序列的PCR引物对。

本发明一实施例的重组载体，其含有如上所述的核酸分子。

载体的作用是运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达。也就是说，离开染色体的外源DNA不能复制，而插入到复制子(replicon)DNA的外源DNA可作为复制子的一部分在受体菌中进行复制，这种复制子就是外源基因的载体。因此，利用该重组载体可以运载禽毛滴虫TBP基因进入宿主细胞，使之能得到复制或表达，从而为基因功能研究和药物开发等研究工作提供有利技术支撑。

可以理解，载体还可包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子等及其他表达控制元件(例如转录终止信号、或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

在一个具体示例中，重组载体基于pMD18T载体、pUC18载体或PBR322载体构建得到。可以理解，载体的具体种类并不限于此，可根据具体需要进行选择。

本发明一实施例的宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸分子。利用该宿主细胞可以进行禽毛滴虫TBP基因的大量复制或蛋白表达，从而为基因功能研究和药物开发等研究工作提供有利技术支撑。

在一个具体示例中，宿主细胞为大肠杆菌。可以理解，宿主细胞的类型不限于此，可根据需要选择。

本发明一实施例的用于检测禽毛滴虫TBP基因的试剂盒，其包括如上所述的核酸分子、如上所述的PCR引物对和如上所述的重组载体中的一种或多种。例如，可以将上述核酸分子或重组载体作为阳性参照品。阳性参照品可以为后续软件分析提供定量的对照基础，如可以对经定值后的阳性参照品用缓冲液稀释为多个浓度，后续软件通过多个浓度梯度定量参考品绘制的标准曲线，可以自动求得各样本的定值结果。可以理解，该试剂盒也可用于检测禽毛滴虫TBP基因的转录水平。

在一个具体示例中，上述试剂盒还包括荧光PCR染料、DNA聚合酶、dNTPs和水中的一种或多种，从而可通过染料法荧光定量PCR检测禽毛滴虫TBP基因。可以理解，根据检测方式的不同试剂盒的组分可以根据需要调整。

在一个具体示例中，上述试剂盒还包括逆转录酶和逆转录引物，从而便于提取待测样本的RNA并进行逆转录得到cDNA，进而用于检测禽毛滴虫TBP基因的转录水平。

进一步地，该试剂盒还包括阴性对照品，阴性对照品可以采用但不限于超纯水、生理盐水等物质。

在一个可选的具体示例中，该试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs试剂中的至少一种。

在一个可选的具体示例中，10×PCR扩增缓冲液包括pH 7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、30mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2％(体积/体积)曲拉通溶液和10％(体积/体积)甲酰胺溶液。DNA聚合酶可以是但不限于热启动Taq酶，其使用浓度为1U/μL～5U/μL。

在一个可选的具体示例中，dNTPs包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP以及dUTP，进一步，该试剂盒中还包括UNG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)，其使用浓度为0.05U/μL～0.2U/μL。UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。进一步，在一个具体的实施例中，可以将DNA聚合酶与UNG酶混合构成酶混合液使用。

在一个具体示例中，试剂盒包括TB Green Premix Ex Taq(2×)(Tli RNaseHPlus)、禽毛滴虫TBP基因模板(即上述核酸分子或重组载体)、PCR引物对和超纯水。其中，TBGreen Premix Ex Taq(2×)(Tli RNaseH Plus)购自TAKARA公司，PCR引物对分别为8μmol/L，超纯水为纯度不低于18.25MΩ·CM的反渗透用水。

本发明一实施例的禽毛滴虫TBP基因的检测方法，其包括以下步骤S1～S3：

S1、提取待测样本的核酸，得到核酸样本；

S2、以提取的核酸样本作为模板，加入上述PCR引物对进行PCR扩增反应；

S3、获取PCR扩增反应的结果。

可选地，PCR扩增反应的结果通过荧光信号对PCR进程进行实时检测获取。

在一个具体示例中，PCR扩增反应的体系为：TB Green Premix Ex Taq(2×)(TliRNaseH Plus)5μL、PCR引物对1μL、待测样本cDNA或禽毛滴虫TBP基因模板1μL、超纯水8μL。

实时荧光PCR扩增反应的条件可以根据缓冲液盐离子浓度以及变性核酸的长度和核苷酸组成、反应特征和核酸长度等具体确定和调整，如在一个优选的具体示例中，可按照如下程序进行：瞬时离心后，上机到荧光定量PCR仪中，95℃预变性30s，然后按95℃变性3s、60℃退火30s热循环40次，并在60℃时检测记录荧光信号，最后在65℃～95℃进行熔解曲线分析。在实时荧光PCR扩增过程中，通过实时荧光采集，在PCR扩增结束后，通过曲线形状及Ct值可以很容易判断禽毛滴虫TBP基因检测的阴、阳性，从而为禽毛滴虫的检测和研究提供可靠的实验依据。

在一个具体示例中，禽毛滴虫TBP基因的检测方法还包括使用上述核酸分子或重组载体进行与待测样本同样处理的步骤，以作为阳性对照或制备标准曲线。

进一步地，在一个具体示例中，检测方法还包括使用超纯水或生理盐水等阴性对照品进行与待测样本同样处理的步骤，以作为阴性对照。

在一个具体示例中，检测方法包括以下步骤：提取待测样本的RNA，进行逆转录反应得到cDNA样本，以提取的cDNA样本作为模板，加入上述PCR引物对进行PCR扩增反应，然后获取PCR扩增反应的结果。如此，检测的结果即为禽毛滴虫TBP基因的转录水平。

发明人通过广泛研究，在禽毛滴虫中克隆得到如SEQ ID NO:1所示的禽毛滴虫TBP全长基因编码序列，并利用该TBP全长基因编码序列进一步设计得到能够检测禽毛滴虫TBP基因及其转录水平的PCR引物对和相应的PCR反应条件，进而组装成用于检测禽毛滴虫TBP基因的试剂盒，从而可以满足寄生生物学、生命科学研究者的检测需要，以及促进对该病原的基因水平检测及其转录调控信号的研究进展，为基因功能研究和药物开发等研究工作提供有利技术支撑。上述PCR引物对、试剂盒和检测方法可以通过使用实时荧光定量PCR技术，实现对禽毛滴虫TBP基因及其转录水平的荧光定量检测，且该PCR引物对用于禽毛滴虫TBP基因及其转录水平的检测，使用方法快速简便，重复性高，特异性强，灵敏度高，对非目的基因没有扩增信号。

以下为具体实施例部分。

实施例1禽毛滴虫总cDNA制备

步骤(1)：提取禽毛滴虫RNA

取(1～5)×10

步骤(2)：逆转录制备禽毛滴虫总cDNA

取上述禽毛滴虫总RNA 1.0μg，参照TAKARA PrimeScript

实施例2禽毛滴虫TBP全长编码基因序列克隆

参照TOYOBO KOD FX说明书，按比例配制禽毛滴虫TBP全长编码基因序列的克隆PCR反应体系，具体如表1所示。震荡混匀，瞬时离心后，进行PCR反应，反应条件为94℃2min；98℃10s，51.5℃30s，68℃40s，30个循环；68℃7min。将PCR产物进行核酸电泳，切胶回收729bp左右目的条带，连接pMD18T载体，送三方公司测序，得到禽毛滴虫TBP全长编码基因，序列如SEQ ID NO:1所示。上游引物序列为：5’-ATGGAAGCATCATCATTCTTTG-3’，下游引物序列为：5’-TTATGAGTTATATTTGCTGTCCTC-3’。

表1

实施例3禽毛滴虫TBP基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒组装

本试剂盒由TB Green Premix Ex Taq(2×)(Tli RNaseH Plus)、禽毛滴虫TBP基因模板、荧光定量引物混合物和超纯水组成。具体组成如表2所示。

表2

试剂盒中，TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X)购自TaKaRa公司，荧光定量引物混合物为上游引物8μM和下游引物8μM，上游引物序列为5’-GGGAGCCAAAAGCTACAGGT-3’，下游引物序列为5’-TCCGAGGATTTGAACGAGCA-3’，超纯水为纯度不低于18.25MΩ·CM的反渗透用水。

实施例4禽毛滴虫TBP转录水平荧光定量PCR检测试剂盒的特异性检测

参照TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2X)说明书，按比例配制禽毛滴虫TBP基因转录水平荧光定量PCR反应体系，具体见表3。瞬时离心后，上机到荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96)中，95℃预变性30s，然后按95℃变性3s、60℃退火30s热循环40次，并在60℃时检测记录荧光信号，最后在65℃～95℃进行熔解曲线分析。每个样品重复三次。

利用Bio-Rad CFX Maestro软件对仪器读取结果，其中基因荧光信号值符合标准的“S”型曲线，如图1所示，熔解曲线仅见单独的峰，表明该荧光定量具有高度的检测专一性，如图2所示。所有孔的扩增曲线和熔解曲线保持一致，说明试剂盒具有可重复性。

表3

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 核酸分子、PCR引物对及用于检测禽毛滴虫TBP基因的试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaagcat catcattctt tgataaagat ggttcattca aagagatcaa tcttgatgat 60

gcagaatcag tgaaatggta ttctcagtta gaagaaaatg gaaatgaagt cgtttcttca 120

atcgatggta tcgaatcaat gaaaccaaaa gttgttaatg ttatcggcgt tgcacaatac 180

gatcagagtg attttgacct tattagtatc gctcaggccg ttcgtaatgc agaatataag 240

ccaaagagaa tgaaagctgt aattgttcgt ataagggagc caaaagctac aggtctcatc 300

ttcactaacg gtaaaatcaa catcgttgga tgtaagagta tcgaagactc aaagcgtgca 360

gctaaaaaat ttggaaaatt gctcgttcaa atcctcggaa caaacgtaaa actcatcgat 420

ttcaagattt catcaatcgt tgctgtagtt aatgcccagt ttaacattca aattggagct 480

attgctgtcg ctgatggtca ctccaagttc tgcgactata gaccagatcg ttttgctggt 540

cttgtataca gacttgtgca accaaaagtt acaatgctta tttttcagtc aggaagcatc 600

atcttaaatg caaaatcagt agatgatctt gattatgctt cagaatgggt atatccaatt 660

cttcagaact tcaagaagca aactactgaa caaatcagac aagctgagga cagcaaatat 720

aactcataa 729

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaagcat catcattctt tg 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttatgagtta tatttgctgt cctc 24

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggagccaaa agctacaggt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccgaggatt tgaacgagca 20