ENT家族转运蛋白的抑制剂在癌症治疗中的用途及其与腺苷受体拮抗剂的组合

摘要

本发明涉及ENT家族转运蛋白的抑制剂用于治疗癌症的用途。本发明进一步涉及ENT家族转运蛋白的此类抑制剂与腺苷受体拮抗剂用于治疗癌症的组合用途。本发明进一步涉及包含所述组合的药物组合物和成分试剂盒。

说明书

发明领域

本发明涉及ENT家族转运蛋白的抑制剂用于治疗癌症的用途。本发明进一步涉及ENT家族转运蛋白的此类抑制剂与腺苷受体拮抗剂用于治疗癌症的组合用途。本发明进一步涉及包含所述组合的药物组合物和成分试剂盒。

发明背景

平衡型核苷转运蛋白(ENT)家族，也称为SLC29，是一组将核苷底物转运到细胞中的质膜转运蛋白。有4种已知的ENT，指定为ENT1、ENT2、ENT3和ENT4。

ENT的内源性底物之一是腺苷，它是多种功能的强效生理和药理调节剂。由腺苷进行的细胞信号传导通过四种已知的G蛋白偶联腺苷受体A1、A2A、A2B和A3发生。通过影响这些受体可利用的腺苷的浓度，ENT在诸如调节冠状动脉血流量、炎症和神经传递的不同生理过程中发挥重要的调节作用(Griffith DA和Jarvis SM，Biochim Biophys Acta，1996，1286，153-181；Shryock JC和Belardinelli L，Am J Cardiol，1997，79(12A)，2-10；Anderson CM等人，J Neurochem，1999，73，867-873)。

多种药物(诸如地拉齐普(dilazep)、双嘧达莫(dipyridamole)和曲氟嗪(draflazine))与ENT相互作用并改变腺苷水平，并且因其心脏保护或血管舒张作用而开发。

腺苷还是一种有效的免疫抑制代谢物，经常在细胞外肿瘤微环境(TME)中被发现其升高(Blay J等人，Cancer Res，1997，57，2602-2605)。细胞外腺苷主要是通过胞外核苷酸酶CD39和CD73对ATP的转化而产生(Stagg J和Smyth MJ，Oncogene，2010，2，5346-5358)。腺苷激活4个G蛋白偶联受体亚型(A1、A2A、A2B和A3)。具体说来，A2A受体的激活据信是先天性和适应性免疫细胞抑制的主要驱动力，导致抗肿瘤免疫应答的抑制(Ohta和Sitkovsky，Nature，2001，414，916-920)(Stagg和Smyth，Oncogene，2010，2，5346-5358)(Antonioli等人，Nature Reviews Cancer，2013，13，842-857)(Cekic C和Linden J，Nature Reviews，Immunology，2016，16，177-192)(Allard B等人，Curr Op Pharmacol，2016，29，7-16)(Vijayan D等人，Nature Reviews Cancer，2017，17，709-724)。

为了评估腺苷是否可能通过ENT的细胞内摄取而降低T细胞活力，在公开可用的RNA-seq数据库中检查了人原代淋巴细胞中质膜定位的ENT转运蛋白(ENT1、ENT2和ENT4)的mRNA表达水平(Bonnal RJP等人，Nature，2015，2∶150051)。B细胞、CD4

本文的申请人表明，腺苷和ATP显著抑制T细胞增殖和细胞因子分泌(IL-2)，并且强烈降低T细胞生存力。使用ENT抑制剂成功地恢复了腺苷和ATP介导的对T细胞生存力和增殖的抑制。

此外，将ENT抑制剂与腺苷受体拮抗剂组合使用不仅能够恢复腺苷和ATP介导的对T细胞生存力和增殖的抑制，而且还能够恢复T细胞细胞因子的分泌。

因此，本发明提供了ENT家族转运蛋白的抑制剂用于治疗癌症的用途。本发明还提供了ENT家族转运蛋白的此类抑制剂与腺苷受体拮抗剂用于治疗癌症的组合用途。

发明内容

因此，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括：向有此需要的人受试者施用有效量的ENT家族转运蛋白的抑制剂。

在一个实施方案中，ENT家族转运蛋白是ENT1，且抑制剂选自由以下组成的组：小分子、核酸、肽和抗体。

在一个实施方案中，受试者用额外的治疗剂与所述ENT家族转运蛋白的抑制剂的组合治疗，或者已经在施用所述ENT家族转运蛋白的抑制剂的约14天内接受了所述额外的治疗剂。在一个实施方案中，额外的治疗剂包括腺苷受体拮抗剂。

在一个实施方案中，受试者先前已经接受了至少一种先前的治疗性治疗，并且在施用所述至少一种先前的治疗性治疗之后且在施用所述ENT家族转运蛋白的抑制剂之前已经进展。在一个实施方案中，先前的治疗性治疗选自由以下组成的组：化学疗法、免疫疗法、放射疗法、干细胞移植、激素疗法和手术。

本发明还提供了一种剂量制剂，其包含有效治疗人受试者的癌症的量的ENT家族转运蛋白的抑制剂。

在一个实施方案中，ENT家族转运蛋白的抑制剂在施用包括腺苷受体拮抗剂的额外的治疗剂之前、同时或之后施用。

本发明还涉及一种治疗癌症的方法，其包括：向有此需要的患者施用腺苷受体拮抗剂与ENT家族转运蛋白的抑制剂的组合。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是A2A或A2B受体拮抗剂。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂选自：

5-溴-2，6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；

(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(([四氢呋喃-3-基]氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-胺；

6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1，2，4-三嗪-3-胺；

3-(2-氨基-6-(1-((6-(2-羟丙烷-2-基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)嘧啶-4-基)-2-甲基苄腈；

2-(2-呋喃基)-7-(2-(4-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-哌嗪基)乙基)-7H-吡唑并(4，3-e)(1，2，4)三唑并(1，5-c)嘧啶-5-胺；

3-(4-氨基-3-甲基苄基)-7-(2-呋喃基)-3H-(1，2，3)三唑并(4，5-d)嘧啶-5-胺；以及

4-羟基-N-(4-甲氧基-7-吗啉代苯并[d]噻唑-2-基)-4-甲基哌啶-1-甲酰胺。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是如下文所限定的式(I)的化合物。

在一个实施方案中，ENT家族成员是ENT1。

在一个实施方案中，A2A或A2B受体拮抗剂和ENT1抑制剂在同一制剂中提供。

本发明进一步提供了一种制剂，其包含：有效量的腺苷受体拮抗剂与有效量的ENT家族成员抑制剂的组合，以及药学上可接受的赋形剂。

在一个实施方案中，在所述制剂中，腺苷受体拮抗剂是A2A或A2B受体拮抗剂。

在一个实施方案中，在所述制剂中，腺苷受体拮抗剂选自：

5-溴-2，6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；

(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(([四氢呋喃-3-基]氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-胺；

6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1，2，4-三嗪-3-胺；

3-(2-氨基-6-(1-((6-(2-羟丙烷-2-基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)嘧啶-4-基)-2-甲基苄腈；

2-(2-呋喃基)-7-(2-(4-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-哌嗪基)乙基)-7H-吡唑并(4，3-e)(1，2，4)三唑并(1，5-c)嘧啶-5-胺；

3-(4-氨基-3-甲基苄基)-7-(2-呋喃基)-3H-(1，2，3)三唑并(4，5-d)嘧啶-5-胺；以及

4-羟基-N-(4-甲氧基-7-吗啉代苯并[d]噻唑-2-基)-4-甲基哌啶-1-甲酰胺。

在一个实施方案中，在所述制剂中，腺苷受体是如下文所限定的式(I)的化合物。

在一个实施方案中，在所述制剂中，ENT家族成员抑制剂是ENT1抑制剂。

在一个实施方案中，所述制剂进一步包含额外的治疗剂。

定义

在本发明中，下列术语具有以下含义：

术语“醛”是指基团-CHO。

术语“烯基”是指不饱和烃基，其可以是直链或支链的，包含一个或多个碳-碳双键。合适的烯基包含2至6个碳原子，优选2至4个碳原子，再更优选2至3个碳原子。烯基的实例是乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-戊烯基及其异构体、2-己烯基及其异构体、2，4-戊二烯基等。

术语“烯基羰基”是指基团-(C＝O)-烯基，其中烯基如本文所定义。

术语“烯基羰基氨基”是指基团-NH-(C＝O)-烯基，其中烯基如本文所定义。

术语“烷氧基”是指基团-O-烷基，其中烷基如本文所定义。

术语“烷基”是指式C

术语“烷基氨基烷基”是指基团-烷基-NH-烷基，其中烷基如本文所定义。

术语“烷基氨基烷基氨基羰基”是指基团-(C＝O)-NH-烷基-NH-烷基，其中烷基如本文所定义。

术语“(烷基氨基烷基)(烷基)氨基羰基”是指基团-(C＝O)-NR

术语“烷基氨基烷基羰基”是指基团-(C＝O)-烷基-NH-烷基，其中烷基如本文所定义。

术语“烷基羰基”是指基团-(C＝O)-烷基，其中烷基如本文所定义。

术语“烷基杂芳基”是指被烷基取代的任何杂芳基，其中烷基如本文所定义。

术语“烷氧基羰基”是指基团-(C＝O)-O-烷基，其中烷基如本文所定义。

术语“烷基磺酰基”是指基团-SO

术语“烷基砜烷基”是指基团-烷基-SO

术语“烷基磺酰亚胺基”是指基团-S(＝O)(＝NH)-烷基，其中烷基如本文所定义。

术语“烷基亚砜”是指基团-(S＝O)-烷基，其中烷基如本文所定义。

术语“烷基亚砜烷基”是指基团-烷基-SO-烷基，其中烷基如本文所定义。

术语“炔烃”是指一类单价不饱和烃基，其中不饱和度是由于存在一个或多个碳-碳三键而引起的。炔基通常且优选具有与上述烷基相同的碳原子数。炔基的非限制性实例是乙炔基、2-丙炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、2-戊炔基及其异构体、2-己炔基及其异构体等。

术语“炔基烷基”是指基团-烷基-炔基，其中烷基和炔基如本文所定义。

术语“氨基”是指基团-NH

术语“氨基烷基”是指基团-烷基-NH

术语“氨基烷基氨基羰基”是指基团-(C＝O)-NH-烷基-NH

术语“氨基烷基羰基氨基”是指基团-NH-(C＝O)-烷基-NH

术语“氨基羰基”是指基团-(C＝O)-NH

术语“(氨基羰基烷基)(烷基)氨基”是指基团-NR

术语“氨基羰基烷基氨基”是指基团-NH-烷基-(C＝O)-NH

术语“氨基磺酰基”是指基团-SO

术语“芳基”是指具有单环(即苯基)或稠合在一起的多个芳环(例如萘基)的多不饱和芳族烃基，其通常含有5至12个原子；优选5至10个；更优选地，芳基是5或6元芳基。芳基的非限制性实例包括苯基、萘基。

术语“羰基”是指基团-(C＝O)-。

术语“羰基氨基”是指基团-NH-(C＝O)-。

术语“环烷基”是指环状烷基，即具有1或2个环状结构的单价、饱和或不饱和烃基。环烷基包括单环或双环烃基。环烷基可在环中包含3个或更多个碳原子，并且根据本发明，通常包含3至10个、更优选3至8个碳原子；还更优选地，环烷基是5或6元环烷基。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基。

术语“环烷氧基”是指基团-O-环烷基，其中环烷基如本文所定义。

术语“二烷基氨基”是指基团-NR

术语“二烷基氨基烷基”是指基团-烷基-NR

术语“二烷基氨基烷基氨基羰基”是指基团-(C＝O)-NH-烷基-NR

术语“二烷基氨基烷基羰基”是指基团-(C＝O)-烷基-NR

术语“二羟烷基”是指如本文所定义的烷基被两个羟基(-OH)取代。

术语“卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。

术语“杂芳基”是指如本文所定义的芳基，其中至少一个碳原子被杂原子置换。换句话说，它是指5至12个碳原子的芳族单环或包含2个稠合在一起的环的环系统，通常含有5至6个原子；其中一个或多个碳原子被氧、氮和/或硫原子置换，其中氮和硫杂原子可任选被氧化，而氮杂原子可任选被季铵化。这类杂芳基的非限制性实例包括：噁唑基、噻唑基、咪唑基、呋喃基和吡咯基。优选地，杂芳基是5或6元杂芳基，更优选地，5或6元杂芳基是呋喃基。

术语“杂环基”是指在至少一个含碳原子的环中具有至少一个杂原子的非芳族、完全饱和或部分不饱和的环状基团(例如3至7元单环、7至11元双环或含有总共3至10个环原子)。优选地，杂环基是5或6元杂环基。含有杂原子的杂环基的每个环可具有1、2、3或4个选自氮原子、氧原子和/或硫原子的杂原子，其中氮和硫杂原子可任选被氧化并且氮杂原子可任选被季铵化。杂环基可以在化合价允许的情况下连接在环或环系统的任何杂原子或碳原子上。多环杂环的环可以通过一个或多个螺原子稠合、桥连和/或连接。非限制性示例性杂环基包括氮丙啶基、环氧乙烷基、环硫乙烷基、哌啶基、氮杂环丁烷基、2-咪唑啉基、吡唑烷基咪唑烷基、异噁唑啉基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、哌啶基、琥珀酰亚胺基、3H-吲哚基、吲哚啉基、异吲哚啉基、2H-吡咯基、1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吡咯烷基、4H-喹嗪基、2-氧代哌嗪基、哌嗪基、高哌嗪基、2-吡唑啉基、3-吡唑啉基、四氢-2H-吡喃基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、3，4-二氢-2H-吡喃基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、3-二氧戊环基、1，4-二噁烷基、2，5-二氧杂咪唑烷基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、吲哚啉基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢喹啉基、四氢异喹啉-1-基、四氢异喹啉-2-基、四氢异喹啉-3-基、四氢异喹啉-4-基、硫代吗啉-4-基、1-氧桥-1-硫代吗啉-4-基、1-二氧桥-1-硫代吗啉-4-基、1，3-二氧戊环基、1，4-氧硫杂环己烷基、1，4-二噻烷基、1，3，5-三氧杂环己烷基、1H-吡咯嗪基，四氢-1，1-二氧代噻吩基、N-甲酰基哌嗪基和吗啉-4-基。

术语“杂环基烷基氨基羰基”是指基团-(C＝O)-NH-烷基-杂环基，其中烷基和杂环基如本文所定义。

术语“(杂环基)(烷基)氨基烷基”是指基团-烷基-NR

术语“杂环基羰基”是指基团-(C＝O)-杂环基，其中杂环基如本文所定义。

术语“杂环基烷基”是指基团-烷基-杂环基，其中烷基和杂环基如本文所定义。

术语“杂环氧基”是指基团-O-杂环基，其中杂环基如本文所定义。

术语“杂环基磺酰基”是指基团-SO

术语“羟烷基”是指基团-烷基-OH，其中烷基如本文所定义。

术语“羟烷基氨基烷基”是指基团-烷基-NH-烷基-OH，其中烷基如本文所定义。

术语“羟基羰基”是指基团-C(＝O)-OH，其中羰基如本文所定义。换句话说，“羟基羰基”对应于羧酸基团。

术语“氧代”是指＝O取代基。

术语“磺酰基氨基”是指基团-NH-SO

在数字之前的术语“约”涵盖所述数字的值的正或负10％或更少。应理解，术语“约”所涉及的值本身也被具体地且优选地公开。

术语“施用(administration)”或其变型(例如“施用(administering)”)是指向他/它的病状、症状或疾病将要得到治疗或预防的患者单独或作为药学上可接受的组合物的一部分提供活性剂或活性成分。

术语“拮抗剂”是指天然或合成的化合物，其与蛋白质结合并阻断蛋白质的生物活化，从而阻止所述蛋白质的作用。蛋白质可以是受体，即从细胞外部接收化学信号的蛋白质分子。因此，“腺苷受体拮抗剂”包括在向患者施用后导致与患者体内的腺苷受体激活相关的生物活性受抑制或下调的任何化学实体，包括另外由与其天然配体的腺苷受体结合引起的任何下游生物效应。这种腺苷受体拮抗剂包括可以阻断腺苷受体激活或腺苷受体激活的任何下游生物效应的任何剂。

术语“抑制剂”是指具有抑制或显著减少或下调基因和/或蛋白质表达的生物效应或具有抑制或显著降低蛋白质的生物活性的生物效应的天然或合成化合物。因此，“ENT抑制剂”或“ENT家族转运蛋白的抑制剂”是指具有抑制或显著降低或下调ENT家族转运蛋白的生物活性的生物效应的化合物。

如本文所用的术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们表现所需生物活性即可。

术语“化学疗法”是指一种类型的癌症治疗，其使用一种或多种抗癌药物(化学治疗剂)作为标准化学疗法方案的一部分。化学疗法可能具有治愈目的，或者可能旨在延长寿命或减轻症状。化学治疗剂例如选自抗癌烷化剂、抗癌抗代谢物、抗癌抗生素、植物来源的抗癌剂、抗癌铂配位化合物及其任何组合。

术语“激素疗法”是指激素在医学治疗中的使用。在一个实施方案中，激素疗法是肿瘤激素疗法。

术语“人”是指具有两种性别且处于任何发育阶段(即新生儿、婴儿、幼儿、青少年、成人)的受试者。

术语“患者”是指哺乳动物，更优选为人，他/它在等待接受或正在接受医疗护理，或是/将成为医疗程序的对象。术语“免疫疗法”是指旨在诱导和/或增强针对特定靶标例如针对癌细胞的免疫应答的疗法。免疫疗法可能涉及使用检查点抑制剂、检查点激动剂(也称为T细胞激动剂)、IDO抑制剂、PI3K抑制剂、腺苷受体抑制剂、产腺苷的酶抑制剂、过继转移、治疗性疫苗及其组合。

术语“核酸”是指通过磷酸二酯键共价连接的核苷酸的聚合物，诸如单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。除非特别限制，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该类似物具有与参照核酸类似的结合特性，并以类似于天然存在核苷酸方式进行代谢。

术语“肽”是指通过肽键连接在一起的少于50个氨基酸的氨基酸的线性聚合物。

表述“药学上可接受的”是指药物组合物的成分彼此相容并且对所施用的受试者无害。

表述“药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂”是指当施用于动物、优选人时，不会产生不利、过敏或其他不良反应的物质。它包括任何及所有非活性物质，例如像溶剂、助溶剂、抗氧化剂、表面活性剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、pH调节剂、防腐剂(preserving agent/preservating agent)、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、成粒剂或粘合剂、润滑剂、崩解剂、助流剂、稀释剂或填充剂、吸附剂、分散剂、悬浮剂、包衣剂、膨松剂、脱模剂、吸收延迟剂、甜味剂、调味剂等。对于人类施用，制剂应符合监管局(例如像FDA局或EMA)所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指延迟或排除病状或疾病和/或其伴随症状的发作、阻止患者患上病状或疾病、或降低患者患上病状或疾病的风险的方法。

如本文所用，术语“前药”是指式(I)的化合物的药理学上可接受的衍生物，例如像酯或酰胺，其体内生物转化产物生成生物活性药物。前药通常以增加的生物利用度为特征，并且在体内容易代谢成生物活性化合物。

术语“放射疗法”是指使用诸如X射线、γ射线、中子射线、电子束、质子束和放射线源的各种放射线来治疗癌症的方法。它被用作癌症治疗的一部分，以控制或杀死恶性细胞。如果将放射疗法定位于身体的一个区域，那么放射疗法可能会治愈许多类型的癌症。它也可以用作辅助疗法的一部分，以防止手术切除原发性恶性肿瘤后肿瘤的复发。放射疗法的三个主要部分是：外束放射疗法(EBRT或XRT)；近距离放射疗法或密封源放射疗法；以及全身放射性同位素疗法(RIT)或未密封源放射疗法。

术语“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效剂量”是指在不对受试者造成明显负面或不良副作用的情况下旨在实现以下目标的活性成分的量或剂量：(1)延迟或预防受试者的癌症发作；(2)降低癌症的严重程度或发生率；(3)减慢或停止影响受试者的癌症的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(4)改善影响受试者的癌症的症状；或(5)治愈影响受试者的癌症。可以在癌症发作之前施用治疗有效量以用于预防或预防作用。或者或另外，可以在癌症发作后施用治疗有效量以用于治疗作用。

术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗；其中目的是预防或减慢目标病理状况或疾病。如果在接受本发明的治疗后，受试者或哺乳动物在以下一项或多项存在或不存在的情况下显示出可观察到的和/或可测量的降低，则该受试者或哺乳动物成功地“治疗”了疾病或疾患或病状：减少癌细胞数量；和/或在某种程度上缓解与特定疾病或病状相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率以及改善生活质量问题。可易于通过医师熟悉的常规程序测量用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数。

术语“干细胞移植”是指患者接受健康的造血细胞(干细胞)以替换因疾病或作为程序的一部分而给予的放射线或高剂量的抗癌药而破坏的其自身的造血细胞的程序。健康的干细胞可来自患者的血液或骨髓、来自供体或来自新生婴儿的脐带血。干细胞移植可以是自体的(使用治疗前收集并保存的患者自己的干细胞)、同种异体的(使用非同卵双生者捐献的干细胞)或同基因的(使用同卵双生者捐献的干细胞)

术语“受试者”是指哺乳动物，优选是人。在一个实施方案中，受试者被诊断出患有癌症。在一个实施方案中，受试者是患者，优选是人患者，他/它在等待接受或正在接受医学护理，或者曾经/正在/将要成为医学程序的受试者，或者被监测疾病(诸如癌症)的发展或进展。在一个实施方案中，受试者是接受治疗和/或监测癌症的发展或进展的人患者。在一个实施方案中，受试者是男性。在另一实施方案中，受试者是女性。在一个实施方案中，受试者是成人。在另一实施方案中，受试者是儿童。

具体实施方式

用于治疗癌症的ENT抑制剂

本发明涉及ENT家族转运蛋白的抑制剂用于治疗癌症的用途。

在下文中，ENT家族转运蛋白的抑制剂也称为ENT抑制剂。

平衡型核苷转运蛋白(ENT)家族，也称为SLC29，是一组将核苷底物像腺苷转运到细胞中的质膜转运蛋白。有4种已知的ENT，指定为ENT1、ENT2、ENT3和ENT4。

在一个实施方案中，ENT抑制剂是ENT1的抑制剂。

在一个实施方案中，ENT抑制剂是对ENT1有选择性的抑制剂。在一个实施方案中，ENT抑制剂是相对于其他ENT抑制剂，特别是相对于ENT2和ENT4，对ENT1具有选择性的抑制剂。

在一个实施方案中，ENT抑制剂选自由以下组成的组：小分子、核酸、肽和抗体。

ENT抑制剂的实例包括地拉齐普、双嘧达莫、NBMPR(硝基苄基硫肌苷)、曲氟嗪、STI-571(Gleevec)、替格瑞洛、soluflazine、米氟嗪、decynium-22、洛匹那韦、奎尼丁、8MDP、TC-T 6000、5-碘代杀结核菌素、西洛他唑、其盐及其任何混合物。在一个特定的实施方案中，ENT抑制剂选自NBMPR、双嘧达莫、地拉齐普、替格瑞洛及其盐(包括盐酸地拉齐普)。在一个特定的实施方案中，ENT抑制剂选自双嘧达莫、地拉齐普、替格瑞洛及其盐(包括盐酸地拉齐普)。在一个实施方案中，ENT抑制剂是NBMP或其盐。在一个实施方案中，ENT抑制剂是双嘧达莫或其盐。在一个实施方案中，ENT抑制剂是地拉齐普或其盐(包括盐酸地拉齐普)。在一个实施方案中，ENT抑制剂是替格瑞洛或其盐。

ENT1抑制剂的实例包括地拉齐普、双嘧达莫、NBMPR(硝基苄基硫肌苷)、曲氟嗪、STI-571(Gleevec)、替格瑞洛、8MDP、5-碘代杀结核菌素、西洛他唑、其盐及其任何混合物。选择性ENT1抑制剂的实例包括NBMPR、STI-571(Gleevec)、替格瑞洛、其盐及其任何混合物。

本发明因此涉及一种ENT家族转运蛋白的抑制剂，其用于治疗人受试者的癌症。

在一个实施方案中，受试者用额外的治疗剂与所述ENT家族转运蛋白的抑制剂的组合治疗，或者已经在施用所述ENT家族转运蛋白的抑制剂的约14天内接受了所述额外的治疗剂。在一个实施方案中，额外的治疗剂包括腺苷受体拮抗剂。在一个实施方案中，ENT家族转运蛋白的抑制剂在施用包括腺苷受体拮抗剂的额外的治疗剂之前、同时或之后施用。

在一个实施方案中，受试者先前已经接受了至少一种先前的治疗性治疗，并且在施用所述至少一种先前的治疗性治疗之后且在施用所述ENT家族转运蛋白的抑制剂之前已经进展。在一个实施方案中，先前的治疗性治疗选自由以下组成的组：化学疗法、免疫疗法、放射疗法、干细胞移植、激素疗法和手术。

因此，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括：向有此需要的人受试者施用有效量的ENT家族转运蛋白的抑制剂。

在一个实施方案中，在本发明的方法中，受试者用额外的治疗剂与所述ENT家族转运蛋白的抑制剂的组合治疗，或者已经在施用所述ENT家族转运蛋白的抑制剂的约14天内接受了所述额外的治疗剂。在一个实施方案中，在本发明的方法中，额外的治疗剂包括腺苷受体拮抗剂。下面提供有关腺苷受体拮抗剂的更多细节。

在一个实施方案中，在本发明的方法中，受试者先前已经接受了至少一种先前的治疗性治疗，并且在施用所述至少一种先前的治疗性治疗之后且在施用所述ENT家族转运蛋白的抑制剂之前已经进展。在一个实施方案中，在本发明的方法中，先前的治疗性治疗选自由以下组成的组：化学疗法、免疫疗法、放射疗法、干细胞移植、激素疗法和手术。

本发明还涉及一种剂量制剂，其包含有效治疗人受试者的癌症的量的ENT家族转运蛋白的抑制剂。

在一个实施方案中，在本发明的制剂中，ENT家族转运蛋白的抑制剂在施用包括腺苷受体拮抗剂的额外的治疗剂之前、同时或之后施用。

组合用途：ENT抑制剂与腺苷受体拮抗剂

本发明进一步涉及ENT抑制剂与腺苷受体拮抗剂的组合用途。

本发明因此涉及一种组合，其包含：

(a)有效量的ENT抑制剂，和

(b)有效量的腺苷受体拮抗剂。

在本发明的上下文中，术语“组合”优选地意指ENT抑制剂与A2AR拮抗剂的组合出现。因此，本发明的组合可作为一种组合物存在，包括一种和同一混合物(例如药物组合物)中的所有组分，或者可作为成分试剂盒存在，其中不同的组分形成这种成分试剂盒的不同部分。ENT抑制剂和A2AR拮抗剂的施用可以同时或在时间上错开进行，在相同的施用部位或在不同的施用部位，在相似或不同的施用时机(即每种组分的相似或不同施用次数)下，以相似或不同的剂型。

本发明进一步涉及一种治疗癌症的方法，其包括：向有此需要的患者施用腺苷受体拮抗剂与ENT抑制剂的组合。

关于ENT抑制剂的以上实施方案也适用于本发明的组合。特别是，在一个实施方案中，在本发明的组合中，ENT抑制剂是ENT1抑制剂。

本发明的组合包含至少一种腺苷受体拮抗剂作为第二组分。

如上所定义，“腺苷受体拮抗剂”是指在向患者施用后导致与患者体内的腺苷受体激活相关的生物活性受抑制或下调的化合物，包括另外由与其天然配体的腺苷受体结合引起的任何下游生物效应。这种腺苷受体拮抗剂包括可以阻断腺苷受体激活或腺苷受体激活的任何下游生物效应的任何剂。

腺苷受体(或P1受体)是一类以腺苷为内源性配体的嘌呤能G蛋白偶联受体。在人中有四种已知类型的腺苷受体：A1、A2A、A2B和A3；其各自由不同的基因(分别是ADOARA1、ADORA2A、ADORA2B和ADORA3)编码。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是A1受体、A2A受体、A2B受体、A3受体或其组合的拮抗剂。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是A2A受体、A2B受体或其组合的拮抗剂。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是A2A或A2B受体拮抗剂。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是A2A受体拮抗剂(A2AR拮抗剂)。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是A2B受体拮抗剂(A2BR拮抗剂)。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是相对于其他腺苷受体对A2A受体具有选择性的拮抗剂。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是相对于A2B受体对A2A受体具有选择性的拮抗剂。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是相对于其他腺苷受体对A2B受体具有选择性的拮抗剂。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是相对于A2A受体对A2B受体具有选择性的拮抗剂。

在一个特定的实施方案中，本发明的组合包含至少一种如本文所限定的A2A受体拮抗剂和至少一种如上所限定ENT抑制剂，例如至少一种ENT1抑制剂。

A2A受体排抗剂

在一个实施方案中，本发明的组合包含至少一种A2AR拮抗剂。

“A2AR拮抗剂”是指在向患者施用后导致与患者中的A2A受体激活相关的生物活性受抑制或下调的化合物，包括另外由与其天然配体的A2A受体结合引起的任何下游生物效应。这种A2AR拮抗剂包括可以阻断A2A受体激活或A2A受体激活的任何下游生物效应的任何剂。

A2AR拮抗剂的实例包括：瑞德南特(Preladenant)(SCH-420，814)、Vipadenant(BIIB-014)、Tozadenant(SYK-115)、ATL-444、伊曲茶碱(KW-6002)、MSX-3、SCH-58261、SCH-412，348、SCH-442，416、ST-1535、咖啡因、VER-6623、VER-6947、VER-7835、ZM-241，385、茶碱。其还包括在WO2018/178338、WO2011/121418、WO2009/156737、WO2011/095626或WO2018/136700中公开的A2AR拮抗剂。

在一个实施方案中，A2AR拮抗剂是硫代氨基甲酸酯衍生物，尤其是如WO2018/178338中公开的那些硫代氨基甲酸酯衍生物。更优选地，A2AR拮抗剂是如下所述的式(I)的硫代氨基甲酸酯衍生物。

因此，在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种组合，其包含：

(a)ENT抑制剂，和

(b)A2AR拮抗剂，它是式(I)的硫代氨基甲酸酯衍生物

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R

在一个优选实施方案中，A2AR拮抗剂是式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：

R

R

其中杂芳基或芳基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、烷基、杂环基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧基、羰基、烷基羰基、氨基羰基、羟基羰基、杂环基羰基、烷基亚砜、烷基磺酰基、氨基磺酰基、杂环基磺酰基、烷基磺酰亚胺基、羰基氨基、磺酰基氨基和烷基砜烷基；

所述取代基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：氧代、卤基、羟基、氰基、烷基、烯基、醛、杂环烷基、羟烷基、二羟烷基、羟烷基氨基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、(杂环基)(烷基)氨基烷基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、炔烃、烷氧基、氨基、二烷基氨基、氨基烷基羰基氨基、氨基羰基烷基氨基、(氨基羰基烷基)(烷基)氨基、烯基羰基氨基、羟基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、氨基烷基氨基羰基、烷基氨基烷基氨基羰基、二烷基氨基烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基、(烷基氨基烷基)(烷基)氨基羰基、烷基氨基烷基羰基、二烷基氨基烷基羰基、杂环基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亚砜、烷基亚砜烷基、烷基磺酰基和烷基砜烷基；

或杂芳基或芳基任选地被两个取代基取代，所述两个取代基与它们所连接至的原子一起形成5或6元芳环、5或6元杂芳环、5或6元环烷基环或5或6元杂环基环；任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：氧代、卤基、羟基、氰基、烷基、烯基、醛、杂环烷基、羟烷基、二羟烷基、羟烷基氨基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、(杂环基)(烷基)氨基烷基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、炔烃、烷氧基、氨基、二烷基氨基、氨基烷基羰基氨基、氨基羰基烷基氨基、(氨基羰基烷基)(烷基)氨基、烯基羰基氨基、羟基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、氨基烷基氨基羰基、烷基氨基烷基氨基羰基、二烷基氨基烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基、(烷基氨基烷基)(烷基)氨基羰基、烷基氨基烷基羰基、二烷基氨基烷基羰基、杂环基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亚砜、烷基亚砜烷基、烷基磺酰基和烷基砜烷基。

在一个实施方案中，优选的式(I)的化合物具有式(Ia)：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：

R

X

当X

所述取代基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：氧代、卤基、羟基、氰基、烷基、烯基、醛、杂环烷基、羟烷基、二羟烷基、羟烷基氨基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、(杂环基)(烷基)氨基烷基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、炔烃、烷氧基、氨基、二烷基氨基、氨基烷基羰基氨基、氨基羰基烷基氨基、(氨基羰基烷基)(烷基)氨基、烯基羰基氨基、羟基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、氨基烷基氨基羰基、烷基氨基烷基氨基羰基、二烷基氨基烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基、(烷基氨基烷基)(烷基)氨基羰基、烷基氨基烷基羰基、二烷基氨基烷基羰基、杂环基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亚砜、烷基亚砜烷基、烷基磺酰基和烷基砜烷基；

R

所述取代基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：氧代、卤基、羟基、氰基、烷基、烯基、醛、杂环烷基、羟烷基、二羟烷基、羟烷基氨基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、(杂环基)(烷基)氨基烷基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、炔烃、烷氧基、氨基、二烷基氨基、氨基烷基羰基氨基、氨基羰基烷基氨基、(氨基羰基烷基)(烷基)氨基、烯基羰基氨基、羟基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、氨基烷基氨基羰基、烷基氨基烷基氨基羰基、二烷基氨基烷基氨基羰基、杂环烷基氨基羰基、(烷基氨基烷基)(烷基)氨基羰基、烷基氨基烷基羰基、二烷基氨基烷基羰基、杂环基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亚砜、烷基亚砜烷基、烷基磺酰基和烷基砜烷基；

或者R

当X

R

R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在本发明的一个特定实施方案中，X

在本发明的一个特定实施方案中，当X

在另一特定实施方案中，当X

在一个优选实施方案中，R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在一个优选实施方案中，R

在本发明的另一特定实施方案中，R

在本发明的一个特定实施方案中，当X

在本发明的一个特定实施方案中，R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在一个实施方案中，优选的式(Ia)的化合物是式(Ia-1)的那些化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R

在一个实施方案中，优选的式(Ia-1)的化合物是式(Ia-1a)的那些化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：

R

R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在一个优选实施方案中，R

在一个实施方案中，优选的式(Ia-1)的化合物是式(Ia-1b)的那些化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：

R

R

R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在一个优选实施方案中，R

在一个实施方案中，优选的式(Ia-1)的化合物是式(Ia-1c)或(Ia-1d)的那些化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中：

R

R

R

R

R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在一个优选实施方案中，R

在本发明的一个特定实施方案中，R

在一个实施方案中，优选的式(Ia)的化合物是式(Ia-2)或(Ia-3)的那些化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中R

本发明的尤其优选的式(I)的化合物是下表1中列出的那些。

及其药学上可接受的盐和溶剂合物。

在表1中，术语“Cpd”意指化合物。

表1的化合物是使用

在一个实施方案中，A2AR拮抗剂选自：

(R，S)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮(化合物7)；

(+)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮(化合物8a)，及

(-)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮(化合物8b)。

在一个特定实施方案中，A2AR拮抗剂选自：

(R，S)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮(化合物7)；和

(+)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮(化合物8a)。

在优选的实施方案中，A2AR拮抗剂是(+)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮(化合物8a)。

在另一个优选实施方案中，A2AR拮抗剂是(-)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮(化合物8b)。在一个实施方案中，本发明还涉及式(I)及其子式的化合物的对映异构体、盐、溶剂合物、多晶型物、多组分复合物和液晶。

在一个实施方案中，本发明还涉及式(I)及其子式的化合物、其前药和异构体(包括光学、几何和互变异构体)以及同位素标记的式(I)的化合物及其子式的多晶型物和晶体习性。

式(I)及其子式的化合物可含有不对称中心，且因此可以不同的立体异构形式存在。因此，本发明包括所有可能的立体异构体，并且不仅包括外消旋化合物，还包括单独的对映异构体及其非外消旋混合物。当需要作为单一对映异构体的化合物时，这类可通过如本领域中分别已知的立体特异性合成或通过拆分最终产物或任何适宜的中间物或通过手性色谱法获得。最终产物、中间物或起始材料的拆分可通过本领域中已知的任何合适的方法进行。

本发明化合物可呈药学上可接受的盐形式。式(I)及其子式的化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐和碱式盐。合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。实例包括乙酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、右旋樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环磺酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲硫酸盐、萘甲酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、焦谷氨酸盐、糖酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟醋酸盐和昔萘酸盐(xinofoate)。合适的碱式盐由形成无毒盐的碱形成。实例包括铝、精氨酸、苄星青霉素、钙、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、乙醇胺、钾、钠、氨丁三醇、2-(二乙氨基)乙醇、乙醇胺、吗啉、4-(2-羟乙基)吗啉和锌盐。还可形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。优选的药学上可接受的盐包括盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、硫酸氢盐/硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐、甲苯磺酸盐、乙磺酸盐和乙酸盐。在特别优选的实施方案中，式(I)的化合物呈HCl盐或乙磺酸盐的形式。

当本发明化合物既含有酸性基团，也含有碱性基团时，本发明化合物还可形成内盐，并且这类化合物在本发明的范围内。当本发明化合物含有供氢的杂原子(例如NH)时，本发明还涵盖通过将所述氢原子转移至分子内的碱性基团或原子而形成的盐和/或异构体。

式(I)及其子式的化合物的药学上可接受的盐可以通过以下这些方法中的一种或多种制备：

(i)通过使式(I)的化合物与所需酸反应；

(ii)通过使式(I)的化合物与所需碱反应；

(iii)通过从式(I)的化合物的合适的前体中除去对酸或碱不稳定的保护基，或通过使用所需的酸使合适的环状前体例如内酯或内酰胺开环；或者

(iv)通过与适当的酸反应或借助于合适的离子交换柱将式(I)的化合物的一种盐转化为另一种盐。

所有这些反应通常在溶液中进行。盐可以从溶液中沉淀出来，并且可以通过过滤收集，或者可以通过蒸发溶剂来回收。盐中的离子化程度可从完全离子化到几乎未离子化。

本发明化合物可以药学上可接受的盐形式施用。术语“药学上可接受的盐”旨在包括所有可接受的盐，诸如乙酸盐、乳糖醛酸盐、苯磺酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、苹果酸盐、碳酸氢盐、马来酸盐、硫酸氢盐、扁桃酸盐、酒石酸氢盐、甲磺酸盐、硼酸盐、甲基溴、溴化物、甲基硝酸盐、乙二胺四乙酸钙、甲基硫酸盐、樟脑磺酸盐、粘酸盐、碳酸盐、萘磺酸盐、氯化物、硝酸盐、克拉维酸盐、N-甲基葡糖胺、柠檬酸盐、铵盐、二盐酸盐、油酸盐、乙二胺四乙酸盐、草酸盐、乙二磺酸盐、双羟萘酸盐(思波酸盐)、丙酸酯十二烷基硫酸盐、棕榈酸盐、乙磺酸盐、泛酸盐、富马酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、葡庚糖酸盐、聚半乳糖醛酸盐、葡萄糖酸盐、水杨酸盐、谷氨酸盐、硬脂酸盐、乙醇酰基对氨基苯胂酸盐、硫酸盐、己基间苯二酚盐、碱式醋酸盐、海巴明、琥珀酸盐、氢溴酸盐、鞣酸盐、盐酸盐、酒石酸盐、羟基萘甲酸盐、茶氯酸盐、碘化物、甲苯磺酸盐、异硫代硫酸盐、三乙基碘、乳酸盐、泛酸盐(panoate)、戊酸盐等，其可用作用于改进溶解性或水解特征的剂型或可用于持续释放或前药制剂。取决于本发明化合物的具体官能度，本发明化合物的药学上可接受的盐包括由阳离子诸如钠、钾、铝、钙、锂、镁、锌以及由碱诸如氨、乙二胺、N-甲基-谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)氨基甲烷和氢氧化四甲铵形成的那些盐。

这些盐可通过标准程序，例如通过使游离酸与合适的有机碱或无机碱反应来制备。当存在诸如氨基的碱性基团时，酸式盐即盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、棕榈酸盐、乙磺酸盐、甲苯磺酸盐等可用作剂型。

另外，尽管通常就本发明化合物的盐而言，优选的是药学上可接受的盐，但是应注意，本发明在最广泛的意义上还包括非药学上可接受的盐，其可例如用于本发明化合物的分离和/或纯化。例如，与光学活性酸或碱形成的盐可用于形成非对映异构盐，其可促进上述式(I)的化合物的光学活性异构体的分离。

本发明化合物可呈药学上可接受的溶剂合物形式。式(I)及其子式的化合物的药学上可接受的溶剂合物含有化学计量或亚化学计量的一种或多种药学上可接受的溶剂分子诸如乙醇或水。术语“水合物”是指当所述溶剂是水时。

同样，在存在醇基的情况下，可以采用药学上可接受的酯，例如乙酸酯、马来酸酯、新戊酰氧基甲基等，以及本领域中已知的用于改进溶解性或水解特征用作持续释放或前药制剂的那些酯。

在另一实施方案中，A2AR拮抗剂是在WO2011/121418中公开的A2AR拮抗剂。A2AR拮抗剂尤其是WO2011/121418的实施例1的化合物，即5-溴-2，6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺，也称为NIR178：

在另一实施方案中，A2AR拮抗剂是在WO2009/156737中公开的A2AR拮抗剂。A2AR拮抗剂尤其是WO2009/156737的实施例1S的化合物，即(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(([四氢呋喃-3-基]氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-胺，也称为CPI-444：

在另一实施方案中，A2AR拮抗剂是在WO2011/095626中公开的A2AR拮抗剂。A2AR拮抗剂尤其是WO2011/095626的化合物(cxiv)，即6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1，2，4-三嗪-3-胺，也称为AZD4635：

在另一实施方案中，A2AR拮抗剂是在WO2018/136700中公开的A2AR拮抗剂。A2AR拮抗剂尤其是WO2018/136700的实施例1的化合物，即3-(2-氨基-6-(1-((6-(2-羟丙烷-2-基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)嘧啶-4-基)-2-甲基苄腈，也称为AB928：

在另一实施方案中，A2AR拮抗剂是瑞德南特(SCH-420，814)，即2-(2-呋喃基)-7-(2-(4-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-哌嗪基)乙基)-7H-吡唑并(4，3-e)(1，2，4)三唑并(1，5-c)嘧啶-5-胺：

在另一实施方案中，A2AR拮抗剂是Vipadenant(BIIB-014)，即3-(4-氨基-3-甲基苄基)-7-(2-呋喃基)-3H-(1，2，3)三唑并(4，5-d)嘧啶-5-胺：

在另一实施方案中，A2AR拮抗剂是Tozadenant(SYK-115)，即4-羟基-N-(4-甲氧基-7-吗啉代苯并[d]噻唑-2-基)-4-甲基哌啶-1-甲酰胺：

因此，在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂选自：

5-溴-2，6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；

(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(([四氢呋喃-3-基]氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-胺；

6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1，2，4-三嗪-3-胺；

3-(2-氨基-6-(1-((6-(2-羟丙烷-2-基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)嘧啶-4-基)-2-甲基苄腈；

2-(2-呋喃基)-7-(2-(4-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-哌嗪基)乙基)-7H-吡唑并(4，3-e)(1，2，4)三唑并(1，5-c)嘧啶-5-胺；

3-(4-氨基-3-甲基苄基)-7-(2-呋喃基)-3H-(1，2，3)三唑并(4，5-d)嘧啶-5-胺；以及

4-羟基-N-(4-甲氧基-7-吗啉代苯并[d]噻唑-2-基)-4-甲基哌啶-1-甲酰胺。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是5-溴-2，6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(([四氢呋喃-3-基]氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-胺。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1，2，4-三嗪-3-胺。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂是3-(2-氨基-6-(1-((6-(2-羟丙烷-2-基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)嘧啶-4-基)-2-甲基苄腈。

A2B受体拮抗剂

在一个实施方案中，本发明的组合包含至少一种A2BR拮抗剂。

“A2BR拮抗剂”是指在向患者施用后导致与患者中的A2B受体激活相关的生物活性受抑制或下调的化合物，包括另外由与其天然配体的A2B受体结合引起的任何下游生物效应。这种A2BR拮抗剂包括可以阻断A2B受体激活或A2B受体激活的任何下游生物效应的任何剂。

A2BR拮抗剂的实例包括：Vipadenant(BIIB-014)、CVT-6883、MRS-1706、MRS-1754、PSB-603、PSB-0788、PSB-1115、OSIP-339，391、ATL-801、茶碱、咖啡因，

特定组合

在一个实施方案中，本发明的组合包含：

(a)有效量的ENT抑制剂，优选是ENT1抑制剂，优选选自NBMPR、双嘧达莫、地拉齐普、替格瑞洛及其盐(包括盐酸地拉齐普)，知

(b)有效量的腺苷受体拮抗剂，优选是A2AR拮抗剂，优选选自：

(+)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮；

(-)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮；

5-溴-2，6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；

(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(([四氢呋喃-3-基]氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-胺；

6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1，2，4-三嗪-3-胺；

3-(2-氨基-6-(1-((6-(2-羟丙烷-2-基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)嘧啶-4-基)-2-甲基苄腈；

及其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本发明的组合包含：

(a)有效量的双嘧达莫作为ENT抑制剂，和

(b)有效量的腺苷受体拮抗剂，优选是A2AR拮抗剂，优选选自：

(+)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮；

(-)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮；

5-溴-2，6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；

(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(([四氢呋喃-3-基]氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-胺；

6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1，2，4-三嗪-3-胺；

3-(2-氨基-6-(1-((6-(2-羟丙烷-2-基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)嘧啶-4-基)-2-甲基苄腈；

及其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本发明的组合包含：

(a)有效量的ENT抑制剂，优选是ENT1抑制剂，优选选自NBMPR、双嘧达莫、地拉齐普、替格瑞洛及其盐(包括盐酸地拉齐普)，知

(b)有效量的(+)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮作为A2AR拮抗剂。

在一个实施方案中，本发明的组合包含：

(a)有效量的ENT抑制剂，优选是ENT1抑制剂，优选选自NBMPR、双嘧达莫、地拉齐普、替格瑞洛及其盐(包括盐酸地拉齐普)，知

(b)有效量的(-)-5-氨基-3-(2-(4-(2，4-二氟-5-(2-(甲基亚磺酰基)乙氧基)苯基)哌嗪-1-基)乙基)-8-(呋喃-2-基)噻唑并[5，4-e][1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2(3H)-酮作为A2AR拮抗剂。

制剂和药物组合物

本发明进一步涉及包含本发明的组合的制剂。特别地，本发明提供了一种制剂，其包含：有效量的腺苷受体拮抗剂与有效量的ENT家族成员抑制剂的组合以及药学上可接受的赋形剂。

以上列举的关于腺苷受体拮抗剂和ENT家族转运蛋白的抑制剂的特定实施方案也适用于本发明的制剂的情形中。

本发明进一步涉及一种药物组合物，其包含本发明的组合。

在一个实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)有效量的ENT抑制剂，

(b)有效量的腺苷受体拮抗剂；以及

(c)至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。

关于ENT抑制剂和腺苷受体拮抗剂的以上实施方案也适用于本发明的药物组合物。

在一个优选实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含：

(a)有效量的ENT抑制剂，例如像ENT1抑制剂；

(b)有效量的A2AR拮抗剂，它是硫代氨基甲酸酯衍生物，更优选是式(I)的硫代氨基甲酸酯衍生物

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，如上所限定；以及

(c)至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。

在一个实施方案中，本发明的制剂或药物组合物进一步包含额外的治疗剂。

用于制备施用形式的所述至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂对熟练技术人员而言是显而易见的；参考最新版的Remington’s PharmaceuticalSciences。

本发明的药物组合物尤其可任选地含有通常用于药物制剂中的这类非活性物质，例如像助溶剂、脂质载剂、抗氧化剂、表面活性剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂、pH调节剂、防腐剂(preserving agent/preservating agent)、等渗剂、稳定剂、成粒剂或粘合剂、沉淀抑制剂、润滑剂、崩解剂、助流剂、稀释剂或填充剂、吸附剂、分散剂、悬浮剂、膨松剂、脱模剂、甜味剂、调味剂等。

在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的助溶剂。优选的助溶剂选自辛酸、聚乙二醇(PEG)、丙二醇、乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、二甲基异山梨醇及其混合物。在一个特定实施方案中，本发明的药物组合物包含辛酸和/或PEG。有利地，当组合物包含PEG作为助溶剂时，PEG是低分子量的，PEG优选地是PEG 400。在一个替代实施方案中，当组合物包含PEG时，其具有中等分子量，优选为PEG 3350。

在一个特定实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的脂质载剂。在一个优选实施方案中，脂质载剂是月桂酰聚氧-32甘油酯。这种赋形剂对应于由Gattefossé(Saint-Priest-France)制造的

在另一实施方案中，脂质载剂是维生素E TPGS。这种赋形剂也根据以下参考文献为人所知：D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯；托可索仑(Tocophersolan)；托可索仑(Tocofersolan)；VEGS；α-[4-[[(2R)-3，4-二氢-2，5，7，8-四甲基-2-[(4R，8R)-4，8，12-三甲基十三烷基]-2H-1-苯并吡喃-6-基]氧基]-1，4-二氧代丁基]-ω-羟基-聚(氧基-1，2-乙二基)；维生素E PEG琥珀酸酯并且由维生素E形成，维生素E通过琥珀酸接头与聚乙二醇1000缀合。维生素E TPGS的熔点在37-41℃范围内且亲水/亲脂平衡(HLB)值为13。

在一个实施方案中，包含本发明的组合的药物组合物进一步包含一种或多种抗氧化剂；优选地，抗氧化剂选自丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、柠檬酸、焦亚硫酸钠、抗坏血酸、甲硫氨酸和维生素E；更优选地，抗氧化剂是BHT。

在一些实施方案中，添加表面活性剂，例如像聚乙二醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、脱水山梨糖醇酯、多库酯钠、月桂基硫酸钠、聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(188、407等)、复合多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(

在一些实施方案中，添加润湿剂，例如像十二烷基硫酸钠、维生素E TPGS、多库酯钠、聚山梨酯80、泊洛沙姆407。优选润湿剂是泊洛沙姆407。

在一些实施方案中，添加乳化剂，例如像卡波姆、卡拉胶、羊毛脂、卵磷脂、矿物油、油酸、油醇、果胶、泊洛沙姆、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、脱水山梨糖醇酯、三乙醇胺、丙二醇单月桂酸酯、丙二醇二月桂酸酯、丙二醇单辛酸酯。优选的乳化剂是例如泊洛沙姆、丙二醇单月桂酸酯、丙二醇二月桂酸酯和丙二醇单辛酸酯。

在一些实施方案中，缓冲剂用于帮助将pH维持在接近生理条件的范围内。合适的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲液(例如柠檬酸一钠-柠檬酸二钠的混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠的混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠的混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸一钠的混合物、琥珀酸-氢氧化钠的混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠的混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠的混合物、酒石酸-酒石酸钾的混合物、酒石酸-氢氧化钠的混合物等)、富马酸盐缓冲液(例如富马酸-富马酸一钠的混合物、富马酸-富马酸二钠的混合物、富马酸一钠-富马酸二钠的混合物等)、葡糖酸盐缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠的混合物、葡糖酸-氢氧化钠的混合物、葡糖酸-葡糖酸钾的混合物等)、草酸盐缓冲液(例如草酸-草酸钠的混合物、草酸-氢氧化钠的混合物、草酸-草酸钾的混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如乳酸-乳酸钠的混合物、乳酸-氢氧化钠的混合物、乳酸-乳酸钾的混合物等)以及醋酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸钠的混合物、乙酸-氢氧化钠的混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐，诸如Tris。

在一些实施方案中，添加pH调节剂，例如像氢氧化钠、碳酸氢钠、氧化镁、氢氧化钾、葡甲胺、碳酸钠、柠檬酸、酒石酸、抗坏血酸、富马酸、琥珀酸和苹果酸；

在一些实施方案中，添加防腐剂以延缓微生物的生长。用于本公开的合适的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、卤化苄烷铵(例如氯化苄烷铵、溴化苄烷铵和碘化苄烷铵)、氯化六甲铵以及对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。

在一些实施方案中，添加有时称为“稳定剂”的等渗剂，其包括多元糖醇，例如三元或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指一大类赋形剂，其功能范围从膨松剂至可溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附于容器壁上或有助于抑制活性成分的沉淀、颗粒生长或结块的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面已列举)；氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇诸如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫的还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如具有10个或更少残基的肽)；蛋白质，诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；泊洛沙姆407；纤维素衍生物，诸如羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素或醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；羧甲基纤维素(Na/Ca)；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；双糖，诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖以及三糖，诸如棉子糖；多糖，诸如葡聚糖；聚乙二醇甲醚-嵌段-聚(D-L-丙交酯)共聚物；聚(甲基丙烯酸丁酯-共-(2-二甲基氨基乙基)甲基丙烯酸酯-共-甲基丙烯酸甲酯)1：2：1。优选的稳定剂是例如甘油；聚乙二醇；聚乙烯吡咯烷酮；纤维素衍生物，诸如羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素或醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；羧甲基纤维素(Na/Ca)；聚乙二醇甲醚-嵌段-聚(D-L-丙交酯)共聚物；以及聚(甲基丙烯酸丁酯-共-(2-二甲基氨基乙基)甲基丙烯酸酯-共-甲基丙烯酸甲酯)1∶2∶1、聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚醋酸乙烯酯共聚物。

在一些实施方案中，添加成粒剂/粘合剂，例如淀粉、树胶(包括天然的、半合成的和合成的)、微晶纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚合物诸如聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮聚醋酸乙烯酯共聚物等。优选的成粒剂是例如甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚维酮和聚乙烯吡咯烷酮聚醋酸乙烯酯共聚物。

在一些实施方案中，添加沉淀抑制剂，例如像纤维素的水溶性衍生物，包括羟丙基甲基纤维素和甲基纤维素；和水溶性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮聚醋酸乙烯酯共聚物、聚乙烯己内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物或泊洛沙姆407。优选的沉淀抑制剂是羟丙基甲基纤维素。

在一些实施方案中，添加润滑剂，例如像硬脂酸镁、甘油酯、山嵛酰聚氧-8甘油酯Nf(Compritol HD5 ATO)、硬脂酰富马酸钠等。

在一些实施方案中，添加崩解剂，例如合成物，像羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠、聚乙烯比咯烷酮(kollidon)CL以及天然来源诸如槐豆胶等。

在一些实施方案中，添加助流剂，例如像滑石、硬脂酸镁、胶体二氧化硅、淀粉等。

在一些实施方案中，添加稀释剂(或填充剂)，例如像右旋糖、乳糖、甘露糖醇、微晶纤维素、山梨糖醇、蔗糖、磷酸氢钙、脱水硫酸钙、淀粉等。

在一些实施方案中，添加吸附剂，例如像二氧化硅、纯化的硅酸铝等。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物呈片剂形式，并且添加压片赋形剂，例如像成粒剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、助流剂、稀释剂、吸附剂等。

在一些实施方案中，本发明的药物组合物呈胶囊形式，其中胶囊壳由明胶或非动物来源的产物诸如纤维素及其衍生物诸如羟丙基甲基纤维素制成。胶囊壳中可包含其他成分，诸如聚乙二醇以用作增塑剂；色素诸如二氧化钛或氧化铁，以提供不透明性和颜色差异；润滑剂诸如巴西棕榈蜡；胶凝剂诸如卡拉胶和润湿剂诸如十二烷基硫酸钠。在一个实施方案中，本发明的药物组合物被配制成胶囊，其中胶囊壳是由明胶构成，且其中另外的组分任选地包含在胶囊壳中，例如像聚乙二醇和十二烷基硫酸钠。

通过非限制性实例，药物组合物可呈适于经口施用、肠胃外施用(诸如通过静脉内、肌肉内或皮下注射或静脉内输注)、局部施用(包括眼部)、直肠施用、通过吸入、通过皮肤贴剂、通过植入、通过栓剂等的施用形式。取决于施用方式，此类合适的施用形式可以是固体、半固体或液体，所述施用形式以及用于其制备的方法及载剂、稀释剂和赋形剂对熟练技术人员而言将是清楚的；参考最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences。

组合物可被配制以提供其中所含的一种或多种活性化合物的快速、持续或延迟释放。

根据一个实施方案，药物组合物呈适于经口施用的形式。适于经口施用的形式可以是固体、半固体或液体。这种形式的一些优选但非限制性实例包括液体、糊剂或固体组合物，且更具体的是片剂、配制用于延长或持续释放的片剂、胶囊(包括软和硬明胶胶囊)、丸剂、糖衣丸、锭剂、小药囊、扁囊剂、粉剂、液体、凝胶、糖浆、浆液、酏剂、乳剂、溶液和混悬液。

根据另一个实施方案，药物组合物呈适于注射的形式，尤其是通过静脉内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、皮下、经皮注射或输注而注射到受试者中。

本发明的药物组合物的无菌可注射形式包括无菌可注射溶液和无菌包装的粉剂(其通常在使用前复原)，以用于大丸剂施用和/或连续施用。

本发明的药物组合物的无菌可注射形式可以是溶液或水性或油性混悬液。这些混悬液可根据本领域中已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂及悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可为在药学上可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液。在可接受的媒介物和溶剂中，可以采用的是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油常规地用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可采用任何刺激性少的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，诸如油酸及其甘油酯衍生物适用于制备可注射剂，天然的药学上可接受的油诸如橄榄油或蓖麻油也如此，特别是它们的聚氧乙烯形式。这些油溶液或混悬液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬液)的配制中常用的类似分散剂。其他常用的表面活性剂诸如Tweens、Spans及其他乳化剂或在药学上可接受的固体、液体或其他剂型的制造中常用的生物利用度增强剂也可用于配制目的。

根据另一实施方案，本发明的药物组合物呈适于局部施用的形式。适于局部施用的形式的实例包括但不限于液体、糊剂或固体组合物，且更具体地是水溶液、滴剂、分散剂、喷雾剂、软膏剂、霜剂、洗剂、微胶囊、微米或纳米颗粒、聚合贴剂或控释贴剂等。

根据另一实施方案，本发明的药物组合物呈适于直肠施用的形式。适于直肠施用的形式的实例包括但不限于栓剂、微型灌肠剂、灌肠剂、凝胶、直肠泡沫体、乳膏、软膏等。

根据另一实施方案，本发明的药物组合物呈适于吸入施用的形式。适于通过吸入施用的形式的实例包括但不限于气溶胶。

本发明的药物制剂优选呈单位剂型，并且可以适当地被包装，例如在盒、泡罩、小瓶、瓶、小药囊、安瓿中或在任何其他合适的单剂量或多剂量保持器或容器(其可被适当地标记)中；任选具有一张或多张包含产品信息和/或使用说明书的活页。

成分试剂盒

本发明进一步涉及一种成分试剂盒，其包含本发明的组合。

在一个实施方案中，本发明的成分试剂盒包含：

(a)第一成分，其包含有效量的ENT抑制剂；和

(b)第二成分，其包含有效量的腺苷受体拮抗剂。

关于ENT抑制剂和腺苷受体拮抗剂的以上实施方案也适用于本发明的成分试剂盒。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种成分试剂盒，其包含：

(a)第一成分，其包含有效量的ENT抑制剂，例如像ENT1抑制剂；和

(b)第二成分，其包含有效量的A2AR拮抗剂，它是硫代氨基甲酸酯衍生物，更优选是式(I)的硫代氨基甲酸酯衍生物

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，如上所限定。

取决于ENT抑制剂和腺苷受体拮抗剂的类型，试剂盒的第一和第二成分可呈药物组合物的形式。这种药物组合物的赋形剂、剂型和施用途径对熟练技术人员将是清楚的(参考最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences)，并且尤其可以是以上关于本发明的药物组合物列出的那些。

在一个实施方案中，试剂盒的第二成分包含药物组合物，所述药物组合物包含A2AR拮抗剂，优选是如上所限定的式(I)的硫代氨基甲酸酯衍生物；以及至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。成分试剂盒的第二成分的药物组合物的药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂可以是以上关于本发明的药物组合物列出的那些。

如下所述，试剂盒的不同成分的施用可以在相同施用部位或不同施用部位以相似或不同剂型同时或在时间上错开进行。

在一个实施方案中，本发明的成分试剂盒进一步包含额外的治疗剂。

施用方案

在本发明的上下文中，ENT抑制剂和腺苷受体拮抗剂的施用可以在相同施用部位或不同施用部位以相似或不同的剂型同时或在时间上错开进行，如下面进一步概述。

在一个实施方案中，ENT抑制剂在施用腺苷受体拮抗剂之前、同时或之后施用。

为了确保由ENT抑制剂和腺苷受体拮抗剂引起的单独机制不会负面地彼此相互影响，腺苷受体拮抗剂和ENT抑制剂可以在时间上单独(以时间错开的方式)即依次施用和/或在不同的施用部位施用。这意味着腺苷受体拮抗剂可以在例如ENT抑制剂之前、同时或之后施用，或反之亦然。或者或另外，腺苷受体拮抗剂和ENT抑制剂可以在不同的施用部位或在相同的施用部位施用，优选地，当以时间错开的方式施用时。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂将要在ENT抑制剂之前和/或同时施用。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂将要在施用ENT抑制剂的前一天或当天施用。

在另一实施方案中，ENT抑制剂将要在腺苷受体拮抗剂之前和/或同时施用。在一个实施方案中，ENT抑制剂将要在施用腺苷受体拮抗剂的前一天或当天施用。

在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂将要在ENT抑制剂之前和/或同时施用，并在此后连续施用。

在另一实施方案中，ENT抑制剂将要在腺苷受体拮抗剂之前和/或同时施用，并在此后连续施用。

剂量

取决于要预防或治疗的病状和施用形式，ENT抑制剂和腺苷受体拮抗剂可以单个日剂量、分成一个或多个日剂量的形式施用。

应理解，腺苷受体拮抗剂和ENT抑制剂的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的具体剂量将取决于多种因素，诸如要治疗的癌症；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；以及医学领域中众所周知的类似因素。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且腺苷受体拮抗剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的剂量：约0.01毫克/公斤体重(mg/kg)至约5mg/kg、优选约0.08mg/kg至约3.3mg/kg、更优选约0.15mg/kg至约1.7mg/kg。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且腺苷受体拮抗剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的剂量：约0.01毫克/公斤体重/天(mg/kg/天)至约5mg/kg/天、优选约0.08mg/kg/天至约3.3mg/kg/天、更优选约0.15mg/kg/天至约1.7mg/kg/天。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且腺苷受体拮抗剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的剂量：约1mg至约500mg、优选约5mg至约200mg、更优选约10mg至约100mg。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且腺苷受体拮抗剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的剂量：每次施用约1mg至约500mg、优选每次施用约5mg至约200mg、更优选每次施用约10mg至约100mg。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且腺苷受体拮抗剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的日剂量：约1mg至约500mg、优选约5mg至约200mg、更优选约10mg至约100mg。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且腺苷受体拮抗剂的剂量(优选治疗有效剂量)是将以一次、两次、三次或更多次施用的日剂量。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且腺苷受体拮抗剂的剂量(优选治疗有效剂量)是将以一次或两次施用的日剂量。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且ENT抑制剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的剂量：约0.01毫克/公斤体重(mg/kg)至约5mg/kg。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且ENT抑制剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的剂量：约0.01毫克/公斤体重/天(mg/kg/天)至约5mg/kg/天。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且ENT抑制剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的剂量：约1mg至约500mg。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且ENT抑制剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的剂量：每次施用约1mg至约500mg。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且ENT抑制剂的剂量(优选治疗有效剂量)是在以下范围内的日剂量：约1mg至约500mg。

在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且ENT抑制剂的剂量(优选治疗有效剂量)是将以一次、两次、三次或更多次施用的日剂量。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选为人，并且ENT抑制剂的剂量(优选治疗有效剂量)是将以一次或两次施用的日剂量。

用途

本发明的另一个目标是所述组合作为药剂(即用于医学用途)的用途。因此，在一个实施方案中，本发明提供了本发明的组合用于制造药剂的用途。特别地，本发明提供了本发明的药物组合物或本发明的试剂盒用于制造药剂的用途。

特别地，本发明提供了本发明的组合、药物组合物或成分试剂盒，它们用于治疗和/或预防癌症。

本发明进一步提供了本发明的组合、药物组合物或成分试剂盒用于制造用于治疗和/或预防癌症的药剂的用途。

本发明进一步提供了一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的哺乳动物物种施用治疗有效量的本发明的组合、药物组合物或成分试剂盒。

特别地，本发明提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括：向有此需要的患者施用腺苷受体拮抗剂与ENT家族转运蛋白的抑制剂的组合。以上列举的关于腺苷受体拮抗剂和ENT家族转运蛋白的抑制剂的特定实施方案也适用于本发明的治疗方法的情形中。

本发明还提供了一种在患者中延迟癌症发作的方法，其包括向有此需要的患者施用药学有效量的本发明的组合、药物组合物或成分试剂盒。

本领域中已知各种癌症。可以使用本发明的方法治疗的癌症包括实体癌和非实体癌，尤其是良性和恶性实体肿瘤以及良性和恶性非实体肿瘤。癌症可以是转移性或非转移性的。癌症可以是家族性或散发性的。

在一个实施方案中，根据本发明待治疗的癌症是实体癌。如本文所用，术语“实体癌”涵盖形成离散的肿瘤胞块的任何癌症(也称为恶性肿瘤)，与扩散地浸润组织而不形成胞块的癌症(或恶性肿瘤)相反。

实体肿瘤的实例包括但不限于：胆管癌、脑癌(包括成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤)、乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、神经胶质瘤、头颈癌、上皮内肿瘤(包括鲍温氏病和佩吉特氏病)、肝癌、肺癌、神经母细胞瘤、口腔癌(包括鳞状细胞癌)、卵巢癌(包括来源于上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞的那些)、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌(包括腺癌和维尔姆氏肿瘤)、肉瘤(包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤、卡波西氏肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌)、睾丸癌包括胚组织肿瘤(精原细胞瘤和非精原细胞瘤，诸如畸胎瘤和绒毛膜癌)、基质肿瘤、生殖细胞肿瘤、甲状腺癌(包括甲状腺腺癌和髓样癌)以及尿路上皮癌。

在另一实施方案中，根据本发明待治疗的癌症是非实体癌。非实体肿瘤的实例包括但不限于血液肿瘤。如本文所用，血液肿瘤是本领域的术语，其包括淋巴病症、骨髓疾病和与AIDS相关的白血病。

淋巴病症包括但不限于急性淋巴细胞性白血病和慢性淋巴增生性病症(例如淋巴瘤、骨髓瘤和慢性淋巴性白血病)。淋巴瘤包括例如霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤和淋巴细胞性淋巴瘤)。慢性淋巴性白血病包括例如T细胞慢性淋巴性白血病和B细胞慢性淋巴性白血病。

在一个特定实施方案中，癌症选自乳腺癌、类癌瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、神经胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、甲状腺癌和尿路上皮癌。

在一个特定实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个特定实施方案中，癌症是类癌瘤。在一个特定实施方案中，癌症是子宫颈癌。在一个特定实施方案中，癌症是结肠直肠癌。在一个特定实施方案中，癌症是子宫内膜癌。在一个特定实施方案中，癌症是神经胶质瘤。在一个特定实施方案中，癌症是头颈癌。在一个特定实施方案中，癌症是肝癌。在一个特定实施方案中，癌症是肺癌。在一个特定实施方案中，癌症是黑素瘤。在一个特定实施方案中，癌症是卵巢癌。在一个特定实施方案中，癌症是胰腺癌。在一个特定实施方案中，癌症是前列腺癌。在一个特定实施方案中，癌症是肾癌。在一个特定实施方案中，癌症是胃癌。在一个特定实施方案中，癌症是甲状腺癌。在一个特定实施方案中，癌症是尿路上皮癌。

在另一特定实施方案中，癌症选自由以下组成的组：白血病和多发性骨髓瘤。

优选地，患者是温血动物，更优选是人。

在一个实施方案中，接受ENT家族转运蛋白的抑制剂的受试者用额外的治疗剂与ENT家族转运蛋白的抑制剂的组合进行治疗，或者已经在施用ENT家族转运蛋白的抑制剂的约14天内接受了额外的治疗剂。在一个实施方案中，额外的治疗剂包括腺苷受体拮抗剂。

在一个实施方案中，受试者先前已经接受了至少一种先前的治疗性治疗，并且在施用所述至少一种先前的治疗性治疗之后且在施用所述ENT家族转运蛋白的抑制剂之前已经进展。在一个实施方案中，先前的治疗性治疗选自由以下组成的组：化学疗法、免疫疗法、放射疗法、干细胞移植、激素疗法和手术。

本发明还涉及一种用于治疗癌症的药物制剂，其中所述药物制剂以有效治疗癌症的量向人受试者施用，且其中所述制剂包含：

(a)ENT家族转运蛋白的抑制剂；和

(b)任选的一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。

在一个实施方案中，在用于本发明的药物制剂中，ENT家族转运蛋白是ENT1，且抑制剂选自由以下组成的组：小分子、核酸、肽和抗体。

在一个实施方案中，在用于本发明的药物制剂中，药物制剂进一步包含额外的治疗剂。在一个实施方案中，额外的治疗剂包括腺苷受体拮抗剂。

在一个实施方案中，在用于本发明的药物制剂中，受试者先前已经接受了至少一种先前的治疗性治疗。在一个实施方案中，先前的治疗性治疗选自由以下组成的组：化学疗法、免疫疗法、放射疗法、干细胞移植、激素疗法和手术。

在一个实施方案中，在用于本发明的药物制剂中，药物制剂在施用包括腺苷受体拮抗剂的额外的治疗剂之前、同时或之后施用。

本发明还提供一种用于治疗癌症的药物制剂，其中所述药物制剂以有效治疗癌症的量向人受试者施用，且其中所述制剂包含：

(a)ENT家族转运蛋白的抑制剂

(b)腺苷受体拮抗剂；以及

(c)任选的一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。

在一个实施方案中，在包含腺苷受体拮抗剂的用于本发明的药物制剂中，腺苷受体拮抗剂包括A2A或A2B受体拮抗剂。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂选自：

5-溴-2，6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；

(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(([四氢呋喃-3-基]氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-胺；

6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1，2，4-三嗪-3-胺；

3-(2-氨基-6-(1-((6-(2-羟丙烷-2-基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)嘧啶-4-基)-2-甲基苄腈；

2-(2-呋喃基)-7-(2-(4-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-哌嗪基)乙基)-7H-吡唑并(4，3-e)(1，2，4)三唑并(1，5-c)嘧啶-5-胺；

3-(4-氨基-3-甲基苄基)-7-(2-呋喃基)-3H-(1，2，3)三唑并(4，5-d)嘧啶-5-胺；以及

4-羟基-N-(4-甲氧基-7-吗啉代苯并[d]噻唑-2-基)-4-甲基哌啶-1-甲酰胺。

在另一实施方案中，腺苷受体拮抗剂包括如先前所限定的式(I)的化合物。

本发明还提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括以有效治疗癌症的量向人受试者施用药物制剂，其中所述制剂包含：

(a)ENT家族转运蛋白的抑制剂；和

(b)任选的一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。

在一个实施方案中，在本发明的方法中，ENT家族转运蛋白是ENT1，且抑制剂选自由以下组成的组：小分子、核酸、肽和抗体。

在一个实施方案中，在本发明的方法中，药物制剂进一步包含额外的治疗剂。在一个实施方案中，额外的治疗剂包括腺苷受体拮抗剂。

在一个实施方案中，在本发明的方法中，受试者先前已经接受了至少一种先前的治疗性治疗。在一个实施方案中，先前的治疗性治疗选自由以下组成的组：化学疗法、免疫疗法、放射疗法、干细胞移植、激素疗法和手术。

在一个实施方案中，在本发明的方法中，药物制剂在施用包括腺苷受体拮抗剂的额外的治疗剂之前、同时或之后施用。

本发明还提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括以有效治疗癌症的量向人受试者施用药物制剂，其中所述制剂包含：

(a)ENT家族转运蛋白的抑制剂

(b)腺苷受体拮抗剂；以及

(c)任选的一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。

在一个实施方案中，在其中药物制剂包含腺苷受体拮抗剂的本发明的方法中，腺苷受体拮抗剂包括A2A或A2B受体拮抗剂。在一个实施方案中，腺苷受体拮抗剂选自：

5-溴-2，6-二-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-4-胺；

(S)-7-(5-甲基呋喃-2-基)-3-((6-(([四氢呋喃-3-基]氧基)甲基)吡啶-2-基)甲基)-3H-[1，2，3]三唑并[4，5-d]嘧啶-5-胺；

6-(2-氯-6-甲基吡啶-4-基)-5-(4-氟苯基)-1，2，4-三嗪-3-胺；

3-(2-氨基-6-(1-((6-(2-羟丙烷-2-基)吡啶-2-基)甲基)-1H-1，2，3-三唑-4-基)嘧啶-4-基)-2-甲基苄腈；

2-(2-呋喃基)-7-(2-(4-(4-(2-甲氧基乙氧基)苯基)-1-哌嗪基)乙基)-7H-吡唑并(4，3-e)(1，2，4)三唑并(1，5-c)嘧啶-5-胺；

3-(4-氨基-3-甲基苄基)-7-(2-呋喃基)-3H-(1，2，3)三唑并(4，5-d)嘧啶-5-胺；以及

4-羟基-N-(4-甲氧基-7-吗啉代苯并[d]噻唑-2-基)-4-甲基哌啶-1-甲酰胺。

在另一实施方案中，腺苷受体拮抗剂包括如先前所限定的式(I)的化合物。

附图说明

图1A、1B和1C是分别表示人原代淋巴细胞中ENT1、ENT2和ENT4的表达的图。FPKM：每千百万个碱基的片段数。来源：Bonnal RJP，Nature 2015。

图2A和2B是表示在不同处理下CD3+T细胞的生存力的图，并示出了由ENT抑制剂逆转腺苷/ATP介导的T细胞生存力降低。将人原代CD3+T细胞用抗CD3/抗CD28包被的微珠刺激，并用25μM腺苷(图2A)或200μM ATP(图2B)处理。在3天的孵育期后，通过流式细胞术分析T细胞的生存力。示出了生物复制品的平均值+/-SD。示出了1名健康供体的代表性数据。在2名健康供体中获得相似的数据。

图3A、3B、3C和3D是表示在不同处理下CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖的图，并示出了由ENT抑制剂挽救腺苷/ATP介导的T细胞增殖的抑制。将人原代CD3+T细胞用抗CD3/抗CD28包被的微珠刺激，并用25μM腺苷(图3A和3C)或200μM ATP(图3B和3D)处理。在3天的孵育期后，通过流式细胞术分析CD4+(图3A和3B)和CD8+(图3C和3D)T细胞的增殖。示出了生物复制品的平均值+/-SD。示出了1名健康供体的代表性数据。在2名健康供体中获得相似的数据。

图4A和4B是表示在不同处理下由CD3+T细胞分泌IL-2的图，并示出了通过ENT抑制剂与A

图5A示出了CD3+T细胞的生存力，如通过用可固定的生存力染料进行染色所确定的。图5B示出了增殖CD8+T细胞的比例，如通过CFSE稀释所确定的。图5C示出了存在于细胞培养上清液中的TNFα的浓度。将人原代CD3+T细胞用抗CD3/抗CD28包被的微珠刺激，并用100μM ATP或对照介质处理。在3天的孵育期后，通过流式细胞术分析CD3+T细胞的生存力(图5A)和CD8+T细胞的增殖(图5B)。通过AlphaLISA分析上清液中的TNFα分泌。灰色阴影条显示A2AR拮抗剂处理的孔，而透明条表示浓度匹配的DMSO处理的孔。结果显示为一式六份(DMSO)或一式两份(A2AR拮抗剂)孔的平均值±标准偏差。显示的数据代表在4次独立实验中从3个健康个体获得的数据。

图6示出了在用化合物8b(A2AR拮抗剂)或NBMPR(ENT1抑制剂)或其组合的先前治疗后，在小鼠中的体内LPS诱导的TNFα产生。在注射LPS(1mg/kg I.V)之前，用NBMPR(20mg/kg经口)或媒介物对BALB/c小鼠预治疗1h。30分钟前，将小鼠用单次剂量的化合物8b(3mg/kg经口)或媒介物治疗。LPS治疗后一小时，从小鼠收集血清。通过ELISA测定TNFα水平(n＝5)。使用Mann-Whitney检验指示P值，ns＝不显著。

图7示出了化合物8b(A2AR拮抗剂)与NBMPR(ENT1抑制剂)组合使用进行治疗后的MCA205肿瘤生长。图7A是表示皮下接种肿瘤细胞之后随时间变化的中值肿瘤体积的图。图7B-D是用媒介物(图7B)和20mg/kg BIDx22的NBMPR(第11天)单独(图7C)或以与3mg/kgBIDx22的化合物8b组合的形式(图7D)治疗的小鼠的个体肿瘤生长体积。(n＝10，*P＝0.0043，**P＝0.0015，***P＜0.0001，线性混合模型统计分析)。

实施例

参考以下实施例将更好地理解本发明。这些实施例旨在代表本发明的具体实施方案，而不意在限制本发明的范围。

使用以下缩写：

ATP：腺苷三磷酸

BSA：牛血清白蛋白

CFSE：羧基荧光素琥珀酰亚胺酯

DMSO：二甲亚砜

EDTA：乙二胺四乙酸

FACS：荧光激活细胞分选，

FBS：胎牛血清

mL：毫升

μL：微升

mM：毫摩尔

nM：纳摩尔

μM：微摩尔

PBS：磷酸盐缓冲盐水

rpm：每分钟的转数

RPMI：罗斯维尔公园纪念学院培养基

实施例1.ENT1抑制剂与A2AR拮抗剂的组合恢复T细胞中TNFα的产生

材料

用于以下测定中的试剂和化合物具有以下来源：

方法

PBMC和CD3+T细胞分离。来自健康志愿者的静脉血经由Unitéd’InvestigationClinique(Centre Hospitalier Universitaire de Tivoli，La Louviere，Belgium)获得，这些志愿者都签署了伦理委员会(FOR-UIC-BV-050-01-01 ICF_HBS_HD 5.0版)批准的知情同意书。根据制造商说明书，使用SepMate-50试管和Lymphoprep，通过密度梯度离心收集单核细胞。按照制造商说明书，使用EasySep人T细胞分离试剂盒，通过免疫磁性阴性选择分离CD3

人原代T细胞培养。将人纯化的CD3

细胞因子定量。根据制造商说明书，将上清液以4000rpm离心10分钟，并使用IL-2(人)AlphaLISA无生物素检测试剂盒对IL-2进行定量，并使用AlphaLISA人TNFa无生物素检测试剂盒对TNFα进行定量。

流式细胞术。将细胞用FACS缓冲液(含有2mM EDTA和0.1％BSA的PBS)洗涤，并在冰上用表面标记抗体和生存力染料染色20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并使用LSRFortessa(BDbiosciences)获取数据。使用FlowJo软件(Treestar)进行分析。

结果

为了评估腺苷对人原代T细胞的作用，用抗CD3/CD28包被的微珠刺激CD3

化合物8a(一种有效且具选择性的A2AR拮抗剂)无法恢复腺苷和ATP介导的T细胞生存力、增殖和IL-2分泌的抑制作用，提示非A2AR依赖性的T细胞抑制作用(图2-4)。

细胞外腺苷通过平衡型核苷转运蛋白(ENT)被细胞摄取。

将原代T细胞用腺苷或ATP处理，并与以下三种不同的、结构上不相关的ENT抑制剂一起孵育：双嘧达莫、盐酸地拉齐普和替格瑞洛。测试的所有ENT抑制剂均可恢复T细胞的增殖和生存力(图2和3)，从而说明通过ENT的腺苷细胞摄取对T细胞代谢的毒性作用。然而，没有一种ENT抑制剂以单一剂形式挽救了T细胞来源的IL-2分泌。

在用A2A受体拮抗剂化合物8a与ENT抑制剂的组合治疗后，实现了对腺苷和ATP介导的T细胞的细胞因子分泌抑制的完全挽救(图4A和4B)。这些结果表明，腺苷通过胞外和胞内机制两者来抑制T细胞的功能和生存力，这可以通过A2AR拮抗剂(不限于化合物8a-如下进一步所示)与ENT抑制剂的组合治疗来逆转。

图5A-C示出了通过ENT-1抑制剂双嘧达莫与A2A受体拮抗剂化合物8a、AB928、CPI-444、NIR178和AZD4635的组合可以逆转在ATP存在下对T细胞的抑制。更具体地说，ATP显著抑制CD8+T细胞增殖并降低T细胞生存力，这被ENT-1抑制剂双嘧达莫完全逆转。ATP还显著抑制TNFα的产生。A2AR和ENT-1抑制剂两者单独都可部分地恢复细胞因子的产生。与单独的任何一种治疗相比，两种抑制剂的组合进一步增强细胞因子分泌的恢复。总体而言，这些数据说明了将化合物8a、AB928、AZD4635、NIR178或CPI-444与ENT-1抑制剂组合用于癌症疗法的价值，旨在完全恢复在富含ATP/腺苷的肿瘤微环境中的T细胞功能和生存力。

实施例2.ENT1抑制剂与A2AR拮抗剂的组合恢复内毒素血症的LPS模型中TNFα的产生

腺苷转运的最主要靶标是平衡型核苷转运蛋白ENT1、2、3和4。ENT抑制剂调节核苷的输入和输出，例如腺苷跨细胞膜的分布，从而平衡型核苷转运的抑制可以降低细胞内腺苷的浓度并允许腺苷在细胞外的积聚。高的细胞内腺苷已显示可抑制免疫细胞的增殖、存活和功能。另一方面，细胞外腺苷通过与腺苷受体2A(A2AR)的结合降低了活化和功能，例如促炎性细胞因子的产生和免疫细胞的细胞毒性。因此，平衡型转运蛋白的抑制旨在减少细胞内腺苷，且由此改善免疫细胞的存活、增殖和功能，而A2AR抑制则旨在通过抑制细胞外腺苷来恢复促炎活性、细胞毒性和免疫细胞活化。

NBMPR(6-S-[(4-硝基苯基)甲基]-6-硫代肌苷)是一种特异性ENT1抑制剂并且在人和小鼠中具有相似的活性。因此，NBMPR在小鼠模型中用于特异性地抑制ENT1活性。

使用已知诱导促炎性细胞因子TNFα分泌的脂多糖(LPS)模型，评估是否可以通过添加A2AR拮抗剂化合物8b挽救在ENT1抑制剂NBMPR的存在下观察到的TNFα介导的抑制。

用媒介物(2.5％DMSO，10％Solutol HS15，于dH

LPS处理显著地提高血清中的TNFα水平。A2AR拮抗剂化合物8b在LPS处理后对TNFα水平没有影响，而单独进行NBMPR处理则显著抑制TNFα产生近2倍(p＝0.008)。用化合物8b预处理小鼠使NBMPR的作用逆转，并挽救TNFα的产生超过2倍(p＝0.016)(图6)。

实施例3.ENT1抑制剂与A2AR拮抗剂的组合在小鼠同基因MCA205实验性纤维肉瘤模型中展现出抗肿瘤功效

在已建立的鼠类同基因MCA205纤维肉瘤肿瘤模型中，评估了A2AR拮抗剂化合物8b与ENT1抑制剂NBMPR组合的抗肿瘤功效。

将MCA205肿瘤细胞皮下接种到C57BL/6小鼠的右胁腹中。当肿瘤达到约50mm

作为单一试剂以20mg/kg经口每天两次(BID)给予连续22天的NBMPR与媒介物相比显示出肿瘤生长的显著延迟(p＝0.0043)(图7A、7B和7C)。

以3mg/kg经口施用的化合物8b与20mg/kgNBMPR组合(两者皆以每天两次(BID)连续施用22天)与媒介物相比显示出肿瘤生长的显著延迟(p＜0.0001)，并且与NBMPR单一剂疗法相比也显示出肿瘤生长的显著延迟(p＝0.0015)(图7A-7D)。