刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器的制备及其酶解效率调控方法

摘要

本发明公开一种刺激‑响应聚合物基质D‑氨基酸氧化酶反应器的制备及其酶解效率调控方法。以双刺激响应聚合物多孔膜为载体，在催化剂LiClO4的催化作用下实现了D‑氨基酸氧化酶的简单、快速、高效固定。以D,L‑丝氨酸为底物，通过手性毛细管电泳技术评估了刺激‑响应聚合物基质D‑氨基酸氧化酶反应器及自由酶的酶解效率，该反应器在不同的温度和光环境中表现出膜表面性质的变化。通过改变温度和光照，可以控制酶反应器的自组装性能从而调控酶解效率。此外，这种温度和光双敏酶反应器的稳定性良好，也为多种刺激的反应活性材料在酶反应器中的应用开辟了新的领域，在提高酶的性能和效率方面具有广阔的应用。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学中氨基酸酶研究领域，尤其涉及一种用多种刺激响应聚合物基质来进行D-氨基酸氧化酶反应器的制备及其D-氨基酸氧化酶解效率调控的方法。

背景技术

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种黄素酶和生物催化剂，主要存在于哺乳动物的肾脏，肝脏和大脑中。它在肾病，抑郁症和精神分裂症的病理生理中起着重要作用。然而，游离DAAO面临的主要挑战是其酶活性损失严重，在溶液中的稳定性较低，导致酶解效率低，重复使用性差。为了提高DAAO的稳定性和重复使用性，酶固定化技术因其在提高催化性能方面的潜力而备受关注。最近，不同类型的固定化酶载体被开发出来，它们将酶限制在一定的空间内，从而使酶与底物之间有高相互作用。

温度、pH、光等刺激可以作为控制生物传感器元件(酶、化学感受器等)反应速率的开关。这些响应材料在组织工程、药物输送、传感器等领域具有很大的应用潜力。单一响应型聚合物材料已经被证明能够实现酶的有效固定化及酶解效率的可控。然而，单一响应型聚合物材料不能很好地适应复杂的生理环境。特别是当人体内病变发生时，包括pH值、温度、酸度和生物活性分子在内的多种信号刺激都会发生变化。因此，设计具有双重和/或多刺激响应性载体来跟踪这些信号的变化和更有效的控制酶反应进程是非常必要的。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)及其制备方法。

本发明所提供的双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)，其结构式如式1所示：

式1中，z、i、m、n均表示聚合度，可独立地选自1-15的整数；

上述式1所示的双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)按照图1所示的反应流程图通过可逆加成断裂链转移(RAFT)方法制备得到，具体操作如下：

(1)合成链转移剂P(St-MAn)：

将马来酸酐(MAn)、苯乙烯(St)、S-苄基二硫苯甲酸酯(BBDT)在偶氮二异丁腈(AIBN)存在下在溶剂1,4-二氧六环中反应，得到链转移剂P(St-MAn)；

(2)使得链转移剂P(St-MAn)与N-异丙基丙烯酰胺在AIBN存在下在溶剂中反应合成P(St-MAn-NIPAm)；

(3)使得P(St-MAn-NIPAm)与丙烯酸-N-羟乙基-3,3-二甲基-δ-硝基吲哚啉螺吡喃酯(SP)在AIBN存在下在溶剂中反应合成P(St-MAn-NIPAm-SP)。

上述方法步骤(1)中，马来酸酐与苯乙烯、S-苄基二硫苯甲酸酯、偶氮二异丁腈的摩尔比依次可为：10.0mM：100.0mM：0.1mM：20.0μM；

所述反应在N

上述方法步骤(2)中，链转移剂P(St-MAn)与N-异丙基丙烯酰胺、AIBN的质量比依次可为：30：30：1；

所述反应在N

上述方法步骤(3)中，P(St-MAn-NIPAm)与丙烯酸-N-羟乙基-3,3-二甲基-δ-硝基吲哚啉螺吡喃酯(SP)、AIBN的质量比依次可为：30：30：1；

所述反应在N

上述双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)作为酶固定化载体的应用也属于本发明的保护范围。

具体地，所述酶可为D-氨基酸氧化酶(DAAO)。

本发明的另一目的是提供一种D-氨基酸氧化酶反应器及其制备方法。

本发明所提供的D-氨基酸氧化酶反应器基于上述双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)制备得到。

本发明所提供的D-氨基酸氧化酶反应器通过包括如下步骤的方法制备得到：

1)制备Fe

2)将Fe

步骤1)的操作为：将P(St-MAn-NIPAm-SP)和Fe

其中，P(St-MAn-NIPAm-SP)与Fe

所述Fe

所述缓冲液为浓度为100.0mM,pH值为8.2的磷酸缓冲液；

所述反应在冰浴中进行，所述反应的时间可为3.0～5.0h，具体可为5.0h；

制备得到的固定有D-氨基酸氧化酶的双刺激响应聚合物基质酶反应器中，D-氨基酸氧化酶固定在双刺激响应聚合物多孔膜上，双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)的分子量为16.8KD,PDI为1.4。

上述刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器在调控D-氨基酸氧化酶酶解效率中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种调控D-氨基酸氧化酶酶解效率的方法。

本发明所提供的调控D-氨基酸氧化酶酶解效率的方法，为：构建上述刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器，调节温度和/或光照来调控D-氨基酸氧化酶酶解效率。

本发明中的刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器处于不同温度和不同光照条件时酶解D-氨基酸氧化酶的效率不同，具有调控酶解效率作用，并与自由酶酶解效率进行了对比。

本发明的实验证明，本发明以刺激响应聚合物膜为载体，在催化剂LiClO4的催化下实现了D-氨基酸氧化酶的简单、快速、高效固定，并且所构建的酶反应器同时具有温敏和光敏多刺激响应性能，酶解效率能够在温度和光响应的协同作用下显著提高且能被轻松调控。

本发明的方法克服了游离D-氨基酸氧化酶易失活、成本高和重复使用性差等不足。另外，本发明方法提供的刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器是可逆的，具有良好的酶活性、稳定性和可重复使用性从而提高了酶的利用率，降低了成本，并且还可以在外界条件下使得酶解效率可以得以调控。

附图说明

图1为温敏和光敏双刺激响应聚合物制备流程图及聚合物与DAAO反应式图。

图2为刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器与自由酶酶解效率对比图，刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器在不同状态下酶解效率对比图。

图3为刺激-响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)的

图4为刺激-响应聚合物多孔膜的SEM图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供一种双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)，其结构式如式1所示：

式1中，z、i、m、n均表示聚合度，可独立地选自1-15的整数；

上述式1所示的双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)按照图1所示的反应流程图通过可逆加成断裂链转移(RAFT)方法制备得到，具体操作如下：

(2)合成链转移剂P(St-MAn)：

将马来酸酐(MAn)、苯乙烯(St)、S-苄基二硫苯甲酸酯(BBDT)在偶氮二异丁腈(AIBN)存在下在溶剂1,4-二氧六环中反应，得到链转移剂P(St-MAn)；

(2)使得链转移剂P(St-MAn)与N-异丙基丙烯酰胺在AIBN存在下在溶剂中反应合成P(St-MAn-NIPAm)；

(3)使得P(St-MAn-NIPAm)与丙烯酸-N-羟乙基-3,3-二甲基-δ-硝基吲哚啉螺吡喃酯(SP)在AIBN存在下在溶剂中反应合成P(St-MAn-NIPAm-SP)。

上述双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)作为酶固定化载体的应用也属于本发明的保护范围。

具体地，所述酶可为D-氨基酸氧化酶(DAAO)。

本发明的另一目的是提供一种D-氨基酸氧化酶反应器及其制备方法。

本发明所提供的D-氨基酸氧化酶反应器基于上述双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)制备得到。

本发明所提供的D-氨基酸氧化酶反应器通过包括如下步骤的方法制备得到：

1)制备Fe

2)将Fe

上述刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器在调控D-氨基酸氧化酶酶解效率中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种调控D-氨基酸氧化酶酶解效率的方法。

本发明所提供的调控D-氨基酸氧化酶酶解效率的方法，为：构建上述刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器，调节温度和/或光照来调控D-氨基酸氧化酶酶解效率。

本发明的方法克服了游离D-氨基酸氧化酶易失活、成本高和重复使用性差等不足。另外，本发明方法提供的刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器是可逆的，具有良好的酶活性、稳定性和可重复使用性从而提高了酶的利用率，降低了成本，并且还可以在外界条件下使得酶解效率可以得以调控。

实施例1、双刺激响应聚合物基质酶反应器的制备

采用可逆加成断裂链转移(RAFT)方法合成双刺激响应聚合物P(St-MAn-NIPAm-SP)

首先，合成P(St-MAn)并用作链转移剂。在烧瓶(25.0mL)中将马来酸酐(MAn,10.0mM)，苯乙烯(St,100.0mM)，S-苄基二硫苯甲酸酯(BBDT,0.1mM)和偶氮二异丁腈(AIBN,20.0μM)与1,4-二氧六环(5.0mL)混合。通过冷冻泵解冻法从烧瓶中除去氧气。使混合物在60℃下在N

然后，以大分子链转移剂P(St-MAn)(300.0mg)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm，300.0mg)、AIBN(10.0mg)和四氢呋喃(THF,5.0mL)为溶剂合成了P(St-MAn-NIPAm)。反应在氮气保护下的25mL圆底烧瓶中进行，在60℃下磁力搅拌反应12.0h，反应结束后加入过量的乙醚。过滤分离沉淀的产物，在50℃烘箱中干燥，获得聚合物P(St-MAn-NIPAm)。将P(St-MAn-NIPAm)(300.0mg)、丙烯酸-N-羟乙基-3,3-二甲基-δ-硝基吲哚啉螺吡喃酯(SP,300.0mg)、AIBN(10.0mg)和THF(5.0mL)加入烧瓶中合成P(St-MAn-NIPAm-SP)。超声混合反应物，用冷冻泵解冻法脱去氧气。混合物在60℃，N

纯化后用凝胶渗透色谱(GPC)法对合成的P(St-MAn-NIPAm-SP)的分子量和聚合物分布指数(PDI)进行了评价分子量约为16.8kD，PDI为1.4。所用GPC仪器(马萨诸塞州米尔福德，美国)由Waters 1515高效液相色谱溶剂泵、Waters 2414差示折光仪检测器和一套Waters Styragel色谱柱组成。以N-甲基吡咯烷酮为洗脱剂，流速1.0mL/min，不同聚苯乙烯为定标剂。

将P(St-MAn-NIPAm-SP)(30.0mg)和Fe

使用静态呼吸图法制备了双刺激响应聚合物多孔膜用于酶的键合，用扫描电子显微镜(SEM)测得其孔径约为1.33μm。

D-氨基酸氧化酶的固定：将制备的双刺激响应聚合物多孔膜(10.0mg)，DAAO(2.5mg，DAAO酶活7.2U/mg)，LiClO

通过考马斯亮蓝法测定酶的固定量,具体步骤为:先配制考马斯亮蓝标准溶液,考马斯亮蓝(10.0mg)溶解于5.0mL乙醇(95％)溶液中,加入到10.0mL的磷酸(85％,wv)溶液中,定容至100.0mL,过滤后备用。测定过程为：取酶固定化反应结束回收酶反应器后,剩余的上清液20.0L,与180.0uL的考马斯亮蓝溶液,在室温条件下混合均匀,孵育2.0min后采用酶标仪测定其在595nm处的紫外吸收值,得到标准曲线:y＝0.096x+0.245,R

所构建的双刺激响应聚合物基质酶反应器连续使用八次相对活性仍有80.6％,且4℃冰箱中放置14天后的相对活性依然保持88.4％，而自由酶在室温放置4h后,相对活性下降至3.24％,这表明所制备的双刺激响应聚合物基质酶反应器具有良好的重复使用性和稳定性。

实施例2、双刺激响应聚合物基质酶反应器调控酶解效率

以D,L-丝氨酸(D,L-Ser)为底物进行酶解，酶解之后的样品用丹酰氯衍生之后,再采用手性配体交换毛细管电泳法(CLE-CE)进行分析。

D,L-氨基酸的衍生方法采用微波衍生，40.0μL的D,L-氨基酸，40.0μL碳酸锂(Li

CLE-CE的背景电解质的组成为：100.0mM硼酸、10.0mM乙酸铵、3.0mM硫酸锌和12.0mM L-赖氨酸-L-精氨酸,且pH为7.6。

通过双刺激响应聚合物基质酶反应器与底物D,L-Ser孵育后D-Ser的减少来计算固定化D-氨基酸氧化酶的活性。为了评价双刺激响应聚合物基质酶反应器和自由酶的酶解活性,采用酶解效率H(％)进行评价,计算公式为：H(％)＝[(C

通过计算酶解效率评估了酶反应器和自由酶的活性。将2.5mM D,L-丝氨酸200.0μL与不同条件下的酶反应器及自由酶(2.5mg/mL，20uL，酶活性7.2U/mg)混合,并孵育10.0分钟，用磁体回收酶反应器，取其上清液煮沸20.0min,离心。然后收集40μL上清液,并使用丹酰氯进一步衍生用于手性配体交换毛细管电泳分析。

丹酰氯衍生方法和手性配体交换毛细管电泳检测方法均同上。

其酶解效率对比结果如下：

图2为刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器与自由酶酶解效率对比图，刺激-响应聚合物基质D-氨基酸氧化酶反应器在不同状态下酶解效率对比图。

由图2可知，与自由酶相比，双刺激响应聚合物基质酶反应器在36℃和紫外照射下的酶解效率(61.8％)显著提高，是自由酶(29.6％)的2.1倍。双刺激响应聚合物基质酶反应器在36℃未经紫外照射时的酶解效率为58.4％，低于它在36℃和紫外照射下的酶解效率。双刺激响应聚合物基质酶反应器在25℃未经紫外照射时的酶解效率为38.7％，低于它在25℃经紫外照射下的酶解效率(54.4％)，同时也低于它在36℃下的酶解效率(58.4％)。这一结果表明所构建的酶反应器同时具有温敏和光敏双刺激响应性能，酶解效率能够在温度和光响应的协同作用下显著提高且能被轻松调控。