一种水果致病疫霉菌检测方法及其应用

摘要

本发明提供了一种水果致病疫霉菌检测方法及其应用，具体步骤包括：提取疫霉菌菌种DNA，并进行靶基因Ypt1扩增；筛选疫霉菌菌种通用限制性内切酶，酶切靶基因Ypt1扩增基因片段；区分不同的疫霉菌菌种的毛细管电泳图谱；比较分析待测植物组织与疫霉菌菌种的毛细管电泳图谱，根据毛细管电泳图谱中波峰的位置进行侵染待测植物组织的疫霉菌菌种鉴定。该方法能够同时进行多重病原微生物的检测，尤其解决现有检测方法中无法区分近缘种的问题，具有检测效率高的特点。

说明书

技术领域

本发明属于真菌检测技术领域，涉及多种水果致病疫霉菌的检测，具体涉及一种水果致病疫霉菌检测方法及其应用。

背景技术

疫霉菌(Phytophthora de Bary)属于茸鞭生物界、卵菌纲、霜霉目、腐霉科，是一种重要的植物病原菌。疫霉菌的大多数病原菌可以导致一年生植物幼苗、观赏植物、完全成熟的水果和森林树木等发生毁灭性病害。根据研究报道，疫霉菌不仅对农作物、经济作物生产造成了严重的经济损失，而且对世界各地的森林植被均有不同程度的破坏。因此，随着农产品国际贸易的快速发展，疫霉菌的入侵已经严重威胁了我国的农林生态系统。

随着分子生物学的快速发展，DNA鉴定技术已成为快速鉴定及检测疫霉菌的重要方法。其中，核糖体DNA内转录间隔区序列(rDNA-ITS)的DNA序列比较保守，被广泛用于疫霉菌的鉴定、分类以及各种分子标记的开发中。此外，还有线粒体细胞色素氧化酶基因(Mitochondrion Cox 1&Cox 2)、28S核糖体DNA、β-微管蛋白基因(Beta-tubulin)等，也被用于疫霉菌的鉴定及系统发育研究。然而，多项研究证明这些基因序列可以很好地区分大部分遗传距离相对较远的菌种，对于近缘种的区分，存在多样性不足的缺陷。研究表明，三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)拥有保守的外显子和丰富的内含子多样性，几乎能够区分所有的疫霉菌菌种。

目前，疫霉菌检测方法主要有多重PCR检测法、多重实时荧光PCR检测法、环介导等温扩增技术(LAMP)等。其中，多重PCR检测技术可在同一PCR反应管内同时检测出多重病原微生物，且多重PCR很适宜于成组病原体的检测，这种检测方法还能大大节省时间、试剂和花销，经济简便。但是多重PCR对扩增出来的片段长度要求严苛，必须每对引物扩增出的片段长度都不相同。多重实时荧光PCR检测技术相比多重PCR检测技术更加准确、灵敏，且不需要电泳对结果进行分析，但是其探针合成成本较高，且同时检测的菌种最多5种。LAMP检测技术可实现恒温扩增，扩增阶段对仪器的要求低，可以直接检测不需要检测仪，但LAMP检测技术无法进行多重扩增，而且在敏感性上和定量方面不如实时荧光PCR好，此外LAMP方法引物设计繁琐且在实际操作中容易污染。

我国进口水果种类繁多，且进口量逐年增加，然而有害生物的入侵风险也随之增加。大多数疫霉菌宿主范围广泛，因此对农林生态系统危害极大。目前水果类的致病疫霉菌已经超过14种，包括栗疫霉Phytophthora cambivora、雪松疫霉P.lateralis、菜豆疫霉P.phaseoli、丁香疫霉P.syringae、荔枝霜疫霉P.litchii、草莓疫霉致病种P.fragariae、P.nicotianane、P.cactorum、柑橘类疫霉菌P.hibernali、P.citrophthora、P.citricola、瓜类疫霉P.melonis、树莓疫霉菌P.fragariae var.rubi及栎树猝死病菌P.ramorum等。其中7种疫霉已被列入我国进口检疫目录。

因此，迫切的需要一种疫霉菌检测方法，用于水果类疫霉菌的检测。基于此，本发明人基于PCR-RFLP原理，利用毛细管电泳基因分型技术，对水果类致病疫霉菌的检测方法进行了深入的试验研究，得出了本发明。

发明内容

本发明的目的在于建立一种准确、快速检测水果类致病疫霉菌菌种的方法，能够同时进行多重病原微生物的检测，尤其解决现有检测方法中无法区分近缘种的问题。

基于上述目的，本发明提供了一种水果致病疫霉菌检测方法，所述水果致病疫霉菌检测方法包括，

提取疫霉菌菌种DNA，并进行靶基因Ypt1扩增；

筛选疫霉菌菌种通用限制性内切酶，酶切靶基因Ypt1扩增基因片段；

区分不同的疫霉菌菌种的毛细管电泳图谱；

比较分析待测植物组织与疫霉菌菌种的毛细管电泳图谱，根据毛细管电泳图谱中波峰的位置进行侵染待测植物组织的疫霉菌菌种鉴定。

本发明所述的水果致病疫霉菌检测方法是基于PCR-RFLP原理，利用毛细管电泳基因分型技术，建立的一种准确、快速检测水果类致病疫霉菌的方法。该方法中的毛细管电泳基因分型技术最低能够分辨2bp的DNA片段差异，可以区分近缘种疫霉菌菌种，该方法也是首次在水果类致病疫霉菌检测中应用。

具体地，本发明使用磁珠DNA提取法提取疫霉菌菌种DNA，利用疫霉属特异性引物Yph1F_mod2和Yph2R_mod2进行靶基因Ypt1扩增。所述Yph1F_mod2的基因序列为CGACCATKGGTGTGGACTTTG；所述Yph2R_mod2的基因序列为ACGTTCTCRCAGGCGTATCTG。

另外，PCR反应体系的组成是决定基因扩增结果的关键因素之一。经本发明人验证，优选的，所述靶基因Ypt1扩增反应体系组分包括：正向游引物Yph1F_mod2(25μmol/L)2μL、反向游引物Yph2R_mod2(25μmol/L)2μL、Hot StartTaq DNA polymerase(5U/μL)0.25μL、dNTP混合物(2.5mmol/L)4μL、1×PCR buffer(10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl和1.5mmol/L MgCl

对于酶切反应而言，在进行酶切时，需要选择合适的酶切反应体系和反应条件，以保证酶的活性和反应效率。经本发明人验证，所述酶切反应体系组分包括：限制性内切酶(10000U/ml)1μL，10×Q.Cut buffer 3μL，PCR产物10μL，SDW36μL。

进一步地，经过本发明人试验验证，所述酶切反应条件为37℃、60min。

本发明中，所述限制性内切酶是生物体内能识别并切割特异双链DNA序列的一种内切核酸酶。本发明从NCBI数据库中收集疫霉菌菌种的(Ypt1和Cox)基因片段序列，并利用Primer premier 5软件查找所有菌种的Ypt1和Cox基因序列所对应的限制性内切酶。再利用R语言软件包(seqRFLP)进行所有菌种共通限制性内切酶的筛选，结合电泳模拟图谱选择适用的限制性内切酶。经本发明人验证，所述限制性内切酶选用AluI、MaeII、AfaI、Csp6I及MaeI，进一步优选的，所述限制性内切酶选用AluI和AfaI。

本发明所述的检测方法能够对多种疫霉菌菌种进行区分和同时检测，所述疫霉菌菌种包括：栗疫霉(Phytophthora cambivora)、雪松疫霉(P.lateralis)、菜豆疫霉(P.phaseoli)、丁香疫霉(P.syringae)、荔枝霜疫霉(P.litchii)、草莓疫霉(P.fragariae、P.nicotianane、P.cactorum)、瓜类疫霉(P.melonis)、柑橘疫霉(P.hibernalis、P.citricola、P.citrophthora)、栎树猝死疫霉(P.ramorum)、树莓疫霉(P.rubi)、樟疫霉(P.cinnamomi)及棕榈疫霉(P.palmivora)。

另外，本发明还给出了所述疫霉菌检测方法在植物疫霉菌检测中的应用，具体地，用于水果类致病疫霉菌检疫。

需要说明的是，本发明所述检测方法优选的用于疫霉菌的检测，进一步的用于植物疫霉菌的检测，更进一步的用于水果类致病疫霉菌检疫。但是该方法也可能用于其他真菌的检测，因此本发明对所述检测方法的使用范围并不做限定，任何使用本发明所述的检测方法或者将其改进的检测方法，都应落入本发明的保护范围。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果或者优点：

(1)传统的检测方法包括形态观察法、常规PCR、多重PCR、多重实时荧光PCR和LAMP技术，形态观察法耗时费力且难度大，已不适用于海关检疫。常规PCR、多重PCR及多重实时荧光PCR检测技术相对成本较低，耗时较短，但是无法满足高通量且4种以上的目标检测。LAMP技术所需检测时间最短，但引物设计繁琐、易出现假阳性且无法进行多目标检测。本发明建立的疫霉菌检测方法结合植物组织DNA快速提法(约为20min)、致病疫霉Ypt1基因扩增(约为120min)、酶切(约为60min)及毛细管电泳(5min/sample)，通常在4～5h内可以实现16种水果致病疫霉菌菌种的同步检测及物种鉴定。因此，对于宿主范围广泛的致病疫霉菌菌种，本研究方法检测效率更高。

(2)本发明以水果类致病疫霉菌菌种为研究对象，基于PCR-RFLP原理，利用毛细管电泳基因分型技术，建立了一种水果类致病疫霉菌菌种准确、快速的检测方法。PCR-RFLP技术原理简单可靠，但是受限于电泳技术，只能区分长度差异20bp以上的DNA片段。而毛细管电泳技术最低可以分辨2bp的片段差异，能有效解决这一问题，因此在物种鉴定(尤其是近缘种)及基因分型具有非常大的应用潜力。本发明将毛细管电泳技术用于水果类致病疫霉菌菌种的检疫，能够同时进行多重病原微生物的检测，尤其能够解决现有检测方法中无法区分近缘种的问题，现有技术中未见报道，属于首次提出。

附图说明

图1A为AluI模拟酶切电泳图。

图1B为AfaI模拟酶切电泳图。

图2A为AluI酶切时间条件选择电泳图。

图2B为AfaI酶切时间条件选择电泳图。

图3为16种疫霉菌AluI酶切毛细管电泳图谱。

图4为16种疫霉菌AfaI酶切毛细管电泳图谱。

图5为水果人工侵染疫霉菌放置10d后的状态图。

图6为水果病变组织致病疫霉菌AluI酶切毛细管电泳图谱。

图1A和图1B中，泳道标号：1，Phytophthoracinnamomi；2，P.citrophthora；3，P.hibernalis；4，P.lateralis；5，P.lateralis；6，P.fragariae；7，P.citricola；8，P.melonis；9，P.nicotianae；10，P.palmivora；11，P.phaseoli；12，P.rubi；13，P.syringae；14，P.cactorum；15，P.cambivora；16，P.litchii。

图2A中，泳道序号：1，P.litchii(10min)；2，P.citricola(10min)；3，P.melonis(10min)；4，P.syrinage(10min)；5，P.litchii(30min)；6，P.citricola(30min)；7，P.melonis(30min)；8，P.syrinage(30min)；9，P.litchii(60min)；10，P.citricola(60min)；11，P.melonis(60min)；12，P.syrinage(60min)。

图2B中，泳道序号：1，P.litchii(30min)；2，P.citricola(30min)；3，P.melonis(30min)；4，P.syrinage(30min)；5，P.litchii(60min)；6，P.citricola(60min)；7，P.melonis(60min)；8，P.syrinage(60min)；9，P.litchii(120min)；10，P.citricola(120min)；11，P.melonis(120min)；12，P.syrinage(120min)。

图3和图4从下往上依次为：1，Phytophthoranicotianae；2，P.palmivora；3，P.litchii；4，P.melonis；5，P.citricola；6，P.citrophthora；7，P.phaseoli；8，P.syringae；9，P.cambivora；10，P.ramorum；11，P.rubi；12，P.fragariae；13，P.cinnamomi；14，P.hibernalis；15，P.lateralis；16，P.cactorum；17，DNA sizemarker(20-1000bp)。

图5中，(a)，樱桃(Phytophthoracambivora)；(b)，苹果(P.cambivora)；(c)，杏(P.cambivora)；(d)，橙子(P.nicotianae)；(e)，圣女果(P.nicotianae)；(f)，木瓜(P.palmivora)；(g)，哈密瓜(P.melonis)；(h)，猕猴桃(P.cinnamomi)；(i)，橙子(P.citrophthora)；(j)，橙子(P.citricola)。

图6中，从下往上依次为：1，木瓜病变组织；2，Phytophthora.palmivora纯菌株；3，圣女果病变组织；4，橙病变组织；5，P.nicotianae纯菌株；6，哈密瓜病变组织；7，P.melonis纯菌株；8，橙病变组织；9，P.citrophthora纯菌株；10，橙病变组织；11，citricola纯菌株；12，猕猴桃病变组织；13，P.cinnamomi纯菌株；14，樱桃病变组织；15，杏病变组织；16，苹果病变组织；17，P.cambivora纯菌株。

具体实施方式

下面，结合附图对本发明的技术方案进行进一步详实的说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明使用的试验菌种来自于南京林业大学、福建省农业科学院及中国农业微生物保藏中心，包括栗疫霉(Phytophthoracambivora)、雪松疫霉(P.lateralis)、菜豆疫霉(P.phaseoli)、丁香疫霉(P.syringae)、荔枝霜疫霉(P.litchii)、草莓疫霉(P.fragariae、P.nicotianane、P.cactorum)、瓜类疫霉(P.melonis)、柑橘疫霉(P.hibernalis、P.citricola、P.citrophthora)、栎树猝死疫霉(P.ramorum)、树莓疫霉(P.rubi)、樟疫霉(P.cinnamomi)及棕榈疫霉(P.palmivora)。

试验试剂包括：海博生物科技有限司的V8汁琼脂培养基(340ml V8juice，6.8g碳酸钙，16g/L琼脂)、Toyobo公司的Mag Extractor Plant Genome Kit、日本Kaneka公司的植物组织快速DNA提取试剂盒、宝公司的Hot Start Taq DNA polymerase、NEB公司的AluI和AfaI限制性内切酶、Extraction Buffer、SDS(10％)、氯化苄、3M NaOAC、70％乙醇。

试验仪器包括：Thermo Fisher Scientific公司的PCR仪2720、天能公司的凝胶成像分析系统、台湾BIOptic公司的全自动核酸蛋白分析系统Qsep 100、上海博讯公司的霉菌培养箱、杭州博日公司的匀质仪、重庆Yamato公司的高压蒸汽灭菌锅、苏州净化公司的超净工作台。

具体试验步骤如下：

(1)将上述16种菌种在V8汁琼脂培养基培养，收集菌丝，利用改良的磁珠DNA提取法提取菌体DNA，再利用疫霉属特异性引物(Yph1F_mod2：CGACCATKGGTGTGGACTTTG和Yph2R_mod2：ACGTTCTCRCAGGCGTATCTG)进行靶基因Ypt1扩增。

其中靶基因Ypt1扩增使用Thermo Fisher Scientific公司的PCR仪2720完成，PCR反应的总体系为50μL，各组份包括：正向游引物Yph1F_mod2(25μmol/L)2μL、反向游引物Yph2R_mod2(25μmol/L)2μL、Hot Start Taq DNA polymerase(5U/μL)0.25μL、dNTP混合物(2.5mmol/L)4μL、1×PCR buffer(10mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl和1.5mmol/LMgCl

(2)从NCBI数据库中收集16种疫霉菌菌种的(Ypt1和Cox)基因片段序列，并利用Primerpremier5软件查找所有菌种的Ypt1和Cox基因序列所对应的限制性内切酶。再利用R语言软件包(seqRFLP)进行所有菌种共通限制性内切酶的筛选，其结果如图1A和图1B所示，通过对比分析得出AluI和AfaI模拟酶切效果最好。通过PCR获得大量目的基因片段，利用扩增产物进行酶切条件的优化。酶切总体系为50μL，包括：限制性内切酶(10000U/ml)1μL，10×Q.Cut buffer 3μL，PCR产物10μL，SDW36μL。酶切反应条件：设置AluI酶切反应参数中温度变量(10min，30min，60min)，AfaI酶切反应参数中温度变量(30min，60min，120min)。

通过对疫霉菌DNA的酶切条件设置，利用3％琼脂糖凝胶电泳检测结果比较两种酶(AluI和AfaI)不同时间酶切反应效果(如图2A和图2B所示)，最终选择AluI酶，酶切反应条件为37℃、60min。

(3)样品经过酶切之后利用全自动核酸蛋白分析系统Qsep100进行毛细管电泳，所得基因片段波峰图谱如图3、图4所示。

通过毛细管电泳检测结果对比分析，得到经AluI酶切后的片段比经AfaI酶切后的片段长度差异更明显，便于区分(如图3、4)；且对于低浓度的样品来说，AluI酶切效果较稳定，片段波峰也较明显。因此，选择AluI作为水果致病疫霉菌检测方法的关键限制性内切酶。

进一步地，将上述检测方法用于樱桃、苹果、杏、橙子、圣女果、木瓜、哈密瓜、猕猴桃疫霉菌菌种的检测。选取Phytophthora.palmivora、P.nicotianae、P.melonis、P.citrophthora、citricola、P.cinnamomi、P.cambivora7种不同疫霉菌对上述8种水果进行人工侵染，试验在陕西师范大学实验室中进行。

首先将水果表面清洗干净并消毒，在超净工作台中用小刀在水果表面切出三个直径约1.5cm、深约1.5cm的小孔，将含菌丝和培养基的菌块(直径1cm)放置于水果孔内，并用封口膜封口，放置于20℃暗室培养，观察并记录水果发病症状。

培养10d后，水果状况如图5所示，分别表现出褐变、腐烂、伴有白色菌丝层、萎缩、溃疡等发病症状。具体表现为：樱桃(P.cambivora)，褐变、腐烂；苹果(P.cambivora)，褐变、腐烂；杏(P.cambivora)，腐烂、伴有白色菌丝层；橙子(P.nicotianae)，腐烂、伴有白色菌丝层；圣女果(P.nicotianae)，萎缩、腐烂；木瓜(P.palmivora)，褐变、腐烂；哈密瓜(P.melonis)，腐烂、伴有白色菌丝层；猕猴桃(P.cinnamomi)，溃疡、腐烂；橙子(P.citrophthora)，褐变、腐烂；橙子(P.citricola)，褐变、腐烂、伴有白色菌丝层。

随后在超净工作台中，用接种针挑取一小块水果的病变组织置于离心管中，利用植物组织DNA快速提取试剂盒提取DNA。将从病变组织提取的DNA进行扩增，再将扩增出的致病疫霉菌Ypt1基因片段进行酶切，并进行毛细管电泳，所得电泳图谱与疫霉菌纯菌株的酶切电泳图谱进行比较分析，根据图谱中波峰的位置进行物种鉴定。

结果显示，水果病变组织的酶切电泳图谱与人工接种的纯菌株的酶切电泳图谱高度一致(如图6)，表明利用限制性内切酶AluI可以准确区分7种不同的水果致病疫霉。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。