致病疫霉菌侵染上调表达RXLR效应基因的初步分析及寄生疫霉菌效应基因PpE4的毒性功能研究

摘要

疫霉菌属于卵菌，被称为“植物毁灭者”。其中最臭名昭著的是引起马铃薯晚疫病的致病疫霉菌（Phytophthora infestans），它曾导致19世纪“爱尔兰大饥荒”，至今仍给现代马铃薯生产造成巨大经济损失。而寄生疫霉菌（P.parasitica），在系统发育上与致病疫霉菌关系较近，不仅引起烟草黑胫病，并且能够侵染范围非常广泛的植物。它们都是半活体营养型病原菌，在侵染早期需要抑制植物细胞坏死维持活体营养，后期通过诱导细胞坏死转入死体营养，因此对寄主植物细胞死亡的调控在侵染过程中尤为重要。RXLR效应蛋白是卵菌特有的一类分泌致病因子，能够进入植物细胞并发挥毒性功能。致病疫霉菌和寄生疫霉菌基因组中存在上百个RXLR效应基因，只有少数基因的功能得到部分解析。RXLR效应蛋白生物学功能的研究以及其宿主靶标的鉴定有助于揭示疫霉菌致病机理，挖掘未知抗病基因以及制定有效的病害防控策略。 本研究利用农杆菌介导的瞬时表达技术对致病疫霉菌和寄生疫霉菌候选RXLR效应基因进行了初步分析，包括它们在植物中的亚细胞定位，激发细胞坏死或抑制细胞坏死的能力，以及对病原菌侵染的贡献；进一步利用实时定量PCR、PEG-CaCl2介导的原生质体转化、VIGS以及多态性分析等试验，对寄生疫霉菌RXLR效应基因PpE4的毒性功能及细胞坏死活性进行了深入探究；最后对一个与致病疫霉菌Avr3a存在共线性关系的寄生疫霉菌效应基因PpAvh3a的功能进行了分析。主要研究结果如下： 1.对致病疫霉菌侵染阶段上调表达的50个候选RXLR效应基因在本氏烟叶片中的瞬时表达分析显示，47个效应基因可以抑制病菌特征分子或效应蛋白激发的细胞坏死（PTI或ETI），一个效应基因（E73）激发本氏烟叶片细胞坏死，另一个（E83）引起叶片轻微黄化反应。亚细胞定位结果表明序列高度分化的RXLR效应蛋白通过定位于植物细胞质、细胞膜、内质网、囊泡状结构、细胞核等多样的亚细胞结构抑制植物免疫。 2.多个来自寄生疫霉菌以及致病疫霉菌的Avrblb2同源蛋白序列相对保守，主要定位于植物细胞核，尤其在核仁、核质、核散斑中特异积累。另外，瞬时表达致病疫霉菌E47和E49以及寄生疫霉菌PpE2和PpE3在特定烟草叶片中激发细胞坏死，这可能是潜在抗病基因的识别所致。瞬时表达E41、E47和E49使本氏烟草更感病，并且表达E47和E49的转基因拟南芥生长形态矮小畸形，表明其均为致病疫霉菌的毒性因子。 3.PpE4是在寄生疫霉菌侵染早期高度上调表达的RXLR效应基因。表达全长PpE4（E4FL）-mCherry融合蛋白的寄生疫霉菌转化子的活细胞成像观察表明，RXLR效应蛋白从寄生疫霉菌吸器分泌出来后在吸器外周质（EHMx）大量积累，并转运至植物细胞。在寄生疫霉菌中沉默PpE4导致其毒性显著减弱，而在本氏烟中瞬时表达PpE4能够恢复沉默转化子的毒性。此外，在本氏烟草以及拟南芥中表达PpE4一致增加植物对寄生疫霉菌的感病性。这些结果表明PpE4在寄生疫霉菌侵染植物过程中发挥重要的毒性功能。 4.PpE4在烟草、番茄、马铃薯以及拟南芥等多种植物中激发广谱的细胞坏死。通过VIGS技术在本氏烟草中瞬时沉默PTI及ETI抗病途径相关基因后，测试PpE4激发的细胞坏死，结果显示：沉默HSP90、NPK和SGT1显著减弱或消除PpE4激发的细胞死亡。这说明PpE4激发的细胞坏死可能是植物免疫系统识别的结果。多态性分析发现寄生疫霉菌群体中存在4种PpE4等位基因，并且PpE4在部分菌株基因组中缺失，其在不同菌株中的变异与寄主和采集地相关。E4D中6个氨基酸的变异使其丧失激发细胞坏死的活性，说明PpE4可能通过遗传变异逃避识别。 5.寄生疫霉菌候选RXLR效应蛋白PpAvh3a与致病疫霉菌Avr3a以及寄生霜霉菌ATR1存在共线性关系，但蛋白序列相去甚远。PpAvh3a在侵染过程中表达量极低，既不激发植物细胞坏死也不抑制PTI或ETI相关的细胞坏死，并且对寄生疫霉菌侵染无贡献。结果表明PpAvh3a并不具有与PiAvr3a类似的无毒或毒性功能。尽管PpAvh3a不能激发植物过敏性坏死反应，但在寄生疫霉菌中的过表达导致病菌致病性减弱。 综上所述，从致病疫霉菌和寄生疫霉菌中鉴定到几个候选毒性RXLR效应基因，并深入研究了寄生疫霉菌PpE4的毒性功能和细胞坏死活性。这些结果为筛选未知抗性基因、解析疫霉菌致病机理奠定了坚实基础。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 卵菌概述

1.2 植物与卵菌互作的分子机制

1.3 RXLR效应基因研究进展

1.4 本研究的目的及意义

第二章 致病疫霉菌RXLR效应蛋白初步分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

第三章 寄生疫霉菌RXLR效应基因PpE4功能分析

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

第四章 与PiAvr3a共线性的寄生疫霉菌基因PpAvh3a的功能分析

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论

第五章 结论与创新点

5.1 结论

5.2 创新点

参考文献

附录

附录1 培养基及试剂配方

附录2 候选RXLR效应基因引物

附录3 RXLR效应基因构建情况以及亚细胞定位

附录4 PpE4以及PpAvh3a相关引物及载体构建

致谢

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