辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)RxLR效应分子克隆及RxLR23同源基因的功能研究

摘要

辣椒疫霉病是世界上普遍存在的土传性土壤病害，其危害范围极其广泛，每年对全世界范围内的蔬菜生产造成极大的破坏和影响。全世界上有关辣椒疫霉病最早进行记载的是Leonian(1892)，他在墨西哥发现了辣椒疫霉病，并确定了病原菌是Phytophthora capsici。关于辣椒疫霉病的防治，目前主要是化学农药防治，同时，也带来了众多农药残留、植株抗药性增强等一系列问题；另一方面，由于辣椒疫霉菌具有很强的变异能力，增加了抗病品种研发的难度。总体而言，辣椒疫霉病的防控是中国乃至全世界范围内的一个巨大难题，需要近一步深入研究。 辣椒疫霉是植物病原卵菌中重要的病原菌，其存在大量的RxLR效应因子，辣椒疫霉侵染植物宿主过程中会产生较多的RxLR效应分子，对植物的抗病反应造成破坏和影响。所以，研究辣椒疫霉RxLR效应因子的功能和结构，对了解辣椒疫霉致病机理，控制疫霉病发展具有重要意义。 本研究是以本实验室采集、分离和保存的高致病性的辣椒疫霉SD33为实验材料，结合相关的深入研究，对本实验室辣椒疫霉菌株SD33中的RxLR效应分子进行了如下研究： 1.根据JGI辣椒疫霉菌基因组数据库，对辣椒疫霉RxLR效应分子基因进行筛选、克隆和生物信息学的分析。通过NCBI的序列对比，经过功能的研究，确定筛选的效应因子。 2.提取辣椒疫霉SD33基因组DNA，克隆辣椒疫霉基因组的效应因子，进行生物信息学预测及分析。将福建、江西等地的辣椒疫霉菌株（小种）与SD33筛选的RxLR23进行比对，选取RxLR3-1、RxLR6-2、RxLR8-2作为同源基因进行研究。 3.将效应因子RxLR84、RxLR23、RxLR3-1、RxLR6-2、RxLR8-2融合到pBIN-GFP2表达载体上，转农杆菌后，在本氏烟、辣椒上瞬时表达，观察表型，发现RxLR84抑制Bax的坏死，用Western blot技术检测其表达。分析这些效应因子的亚细胞定位，结果发现，RxLR84、RxLR23主要定位于细胞核和细胞质，RxLR3-1、RxLR6-2和RxLR8-2主要定位在细胞质。 4.将效应因子RxLR23、RxLR3-1、RxLR6-2接种本氏烟，24h接种辣椒疫霉游动孢子，3d后观察结果。RxLR23、RxLR6-2能促进辣椒疫霉游动孢子的侵染，RxLR3-1对辣椒疫霉游动孢子侵染有所抑制。 5.核定位和核输出信号对RxLR23功能的影响。将RxLR23分别加入核定位信号（NLS）和核输出信号（NES），对其功能进行进一步研究，发现RxLR23NLS依旧引起辣椒坏死，RxLR23NES基本不引起辣椒坏死，RxLR23NLS、RxLR23NES接种本氏烟，24h后接辣椒疫霉游动孢子，发现RxLR23NLS抑制其侵染、RxLR23NES促进辣椒疫霉侵染。 通过以上研究，发现不同的RxLR效应因子具有多样性功能，部分效应因子在抑制INF1或Bax的坏死上起到一定作用，同源效应基因在部分氨基酸的多态性位点下，基因功能上会有所差异，核输出信号会导致RxLR23的功能改变，核输出信号会导致RxLR23抑制辣椒疫霉侵染。经过一系列的深入探讨，发现RxLR23是具有毒性的效应因子，能引起植物细胞的死亡，效应因子的致病机理通常是植物体内有与其互作的蛋白，筛选出相应的互作蛋白，研究出效应因子与互作蛋白的内在关系，才能更加完整的解释效应因子的致病机理。

目录

声明

符号说明

1 前 言

1.1 辣椒疫霉病的基本概况

1.1.1辣椒疫霉的生物学特征

1.1.2辣椒疫霉病致病原因及发病规律

1.2 辣椒疫霉病的防治方法

1.2.1栽培防治

1.2.2 生物防治

1.2.3 化学防治

1.3 基因功能的相关进展及其研究

1.3.1 RxLR效应分子简介

1.3.2 RxLR效应分子的功能

1.3.3 CRISPR/cas9技术应用及研究进展

1.4 植物免疫系统与病原菌的相互作用

1.4.1 RxLR效应因子侵入寄主植物细胞的机理

1.5 研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 辣椒疫霉菌株及植物材料

2.1.2 载体和菌株

2.1.3 酶和生化试剂

2.1.4相关耗材和仪器

2.1.5 常用培养基及溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1 辣椒疫霉RxLR效应分子的生物信息学分析及基本理化性质分析

2.2.2 实验所用引物

2.2.3 辣椒疫霉RxLR效应因子的克隆

2.2.4 农杆菌介导的辣椒疫霉RxLR效应分子瞬时表达

2.2.5 农杆菌接种本氏烟和辣椒，Western blot检测

2.2.6 叶片的台盼蓝染色、脱色及拍照

2.2.7 Western Blot检测RxLR效应分子瞬时表达情况

2.2.8 效应因子亚细胞定位的观察

2.2.9 辣椒疫霉SD33游动孢子侵染实验

3 结果与分析

3.1辣椒疫霉RxLR效应基因的克隆与序列分析

3.2 RxLR效应因子的表型分析

3.2.1 pBIN-GFP2重组载体的构建以及农杆菌转化

3.2.2 RxLR23表达模式分析

3.2.3 效应基因的Western Blot检测

3.2.4 RxLR效应因子的瞬时表达

3.4 辣椒疫霉RxLR效应因子的亚细胞定位情况

3.5 辣椒疫霉RxLR效应因子对辣椒疫霉侵染状况的影响

3.6 核定位和核输出信号对RxLR23功能的影响

3.6.1 pBIN-GFP植物表达载体的构建

3.6.2 RxLR23核定位和核输出对效应因子功能的影响

3.6.3 Western blot的检测

3.6.4辣椒疫霉RxLR效应因子的亚细胞定位情况

3.6.5 RxLR23核定位和核输出信号对辣椒疫霉侵染状况的研究

4 讨论

4.1 RxLR效应因子生物学分析

4.2 农杆菌介导的RxLR效应因子成功表达

4.3 RxLR效应分子具有多样性的亚细胞定位

4.4 农杆菌介导的瞬时表达技术

4.5 建立RxLR效应因子研究的系统学

5结论

参考文献

致谢