辣椒疫霉效应因子RxLR23在促进植物生长中的应用

摘要

本发明涉及分子生物学领域，公开了一种辣椒疫霉效应因子RxLR23在促进植物生长中的应用。通过在辣椒疫霉菌菌株SD33中克隆鉴定了一个新的RxLR23效应因子，并借助蛋白表达技术，制备了RxLR23大肠杆菌高效表达菌株，进而获得RxLR23蛋白溶液，并进一步证实了RxLR23蛋白溶液具促进辣椒、黄瓜和番茄幼苗根系发育和长势的性能，该RxLR23蛋白制备及其功能技术，后期转化易于开发出蔬菜壮根壮苗蛋白制剂技术。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种辣椒疫霉效应因子RxLR23在促进植物生长中的应用。

背景技术

植物病原菌侵染植物寄主过程中，常分泌产生RxLR效应因子，这些RxLR效应因子与寄主靶蛋白结合，干扰植物的免疫系统，促进病原菌的侵染与致病，但寄主植物也相应的进化出防御系统识别并阻止病原菌的侵染致病，进而激发植物抗性蛋白表达，活性氧迸发，胼胝质沉积乃至产生过敏性坏死反应(HR)，从而抑制了病原卵菌的扩展，因此，这些RxLR效应因子常被称为免疫性效应因子。

近年来研究发现，重要植物病原卵菌如辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、大豆疫霉菌(P. sojae)、烟草疫霉菌(P.parasitica)的基因组含大量RxLR效应因子，其中有些RxLR效应因子成员具免疫性能。因此，正确鉴定RxLR效应因子的免疫特性，对研究RxLR效应因子的致病机制及防治植物病害具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种辣椒疫霉效应因子 RxLR23在促进作物幼苗根系发育和长势性能中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案为：

本发明第一方面提供一种辣椒疫霉效应因子RxLR23以及表达所述辣椒疫霉效应因子RxLR23的原核或真核表达系统在促进植物生长用的应用。

本发明所述的辣椒疫霉效应因子RxLR23是从辣椒疫霉菌菌株 SD33中克隆得到的，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

作为优选，所述应用包括：将所述辣椒疫霉效应因子RxLR23配制为蛋白溶液，将所述蛋白溶液施于育苗基质；或将表达所述辣椒疫霉效应因子RxLR23的大肠杆菌菌液施于育苗基质。

或者，作为优选，所述应用包括：将所述辣椒疫霉效应因子 RxLR23配制为蛋白溶液，将所述蛋白溶液进行浸种处理；或将表达所述辣椒疫霉效应因子RxLR23的大肠杆菌菌液进行浸种处理

或者，作为优选，所述应用包括：将所述辣椒疫霉效应因子 RxLR23配制为蛋白溶液，将所述蛋白溶液对植物进行灌根处理；或将表达所述辣椒疫霉效应因子RxLR23的大肠杆菌菌液对植物进行灌根处理。

作为优选，所述应用还包括将蛋白溶液或大肠杆菌菌液进行稀释处理。

作为优选，所述表达所述辣椒疫霉效应因子RxLR23的大肠杆菌通过将所述辣椒疫霉效应因子RxLR23编码基因通过质粒导入大肠杆菌感受态细胞中得到。

作为优选，所述质粒为pET28a，和/或所述大肠杆菌感受态细胞为DH5α。

本发明第二方面提供一种辣椒疫霉效应因子RxLR23以及表达所述辣椒疫霉效应因子RxLR23的原核或真核表达系统在制备植物促生长剂中的应用。

本发明第三方面提供一种辣椒疫霉效应因子RxLR23以及表达所述辣椒疫霉效应因子RxLR23的原核或真核表达系统在抑制辣椒疫霉对寄主植物侵染中的应用。

作为优选，所述植物包括辣椒、黄瓜和番茄。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明在辣椒疫霉菌菌株SD33中克隆鉴定了一个新的RxLR23效应因子，并借助蛋白表达技术，制备了RxLR23大肠杆菌高效表达菌株，进而获得RxLR23蛋白悬浮液，并进一步证实了RxLR23蛋白具促进辣椒、黄瓜和番茄幼苗根系发育和长势的性能，有望开发成为蔬菜壮根壮苗的新型蛋白制剂。

附图说明

图1是pET28a载体图谱。

图2是本发明实施例1中RxLR23基因的PCR扩增结果，其中，M： DNAMarker，1-4：RxLR23基因DNAPCR扩增条带。

图3是本发明实施例中RxLR23表达的SDS-PAGE胶分析结果，其中，M：Proteinmarker；CK：对照；1-4：IPTG诱导RxLR23蛋白表达。

图4是实施例中RxLR23蛋白促进辣椒幼苗根系发育的测试结果。

图5是实施例中RxLR23蛋白促进辣椒幼苗长势的测试结果。

图6是实施例中RxLR23蛋白促进黄瓜幼苗根系发育的测试结果。

图7是实施例中RxLR23蛋白促进黄瓜幼苗长势的测试结果。

图8是实施例中RxLR23蛋白促进5叶期番茄幼苗根系发育的测试结果。

图9是实施例中RxLR23蛋白促进6叶期番茄幼苗根系发育的测试结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a LaboratoryManual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1辣椒疫霉效应因子RxLR23基因的克隆及表达

1.辣椒疫霉效应因子RxLR23基因信息预测

借助生物信息学DNAMAN软件，分析比较辣椒疫霉全基因组 (https://genome.jgi.doe.gov/portal/)，筛选界定了1个重要的RxLR效应因子，该效应因子被命名为RxLR23效应因子，其编码基因大小为1155 bp(含信号肽54bp，SEQ ID NO:1)，去掉信号肽后包含366个氨基酸残基(SEQ ID NO:2)，分子量41kD，pI＝9.47。

利用SignalP 4.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽，其信号肽区域为1-54bp，无跨膜区。

2.辣椒疫霉效应因子RxLR23基因克隆测序

2.1辣椒疫霉菌株

强致病辣椒疫霉菌株SD33，由山东农业大学蔬菜病虫生物学重点实验室提供。

2.2辣椒疫霉菌株SD33的RNA提取及反转录cDNA

实验室保存的强致病菌株SD33使用V8平板在28℃恒温培养箱内进行培养。

对所述强致病菌株SD33进行RNA提取，步骤如下：

1)磨样：使用液氮预冷的研钵研磨辣椒疫霉SD33菌丝至粉末状；

2)匀浆：取1g菌丝研磨粉末加10mL的Trizol，通过电动涡旋仪充分匀浆2min后，在室温下静置3-5min使其充分裂解；

3)在温度4℃、12000rpm的转速下离心10min，吸上清弃沉淀；

4)200μL氯仿/mLTrizol加氯仿，震荡混匀(禁用涡旋震荡仪) 后，25℃静置15min，在温度4℃、13000rpm的转速下离心15min；

5)吸取上层水相至新离心管中，弃下层酚相，勿吸中间界面，酚相用来提取蛋白；

6)将500μL异丙醇加入1mLTrizol进行颠倒，室温放置5-10min；

7)在温度4℃、12000rpm的转速下离心10min，弃上清；

8)按1mL 75％乙醇/mL DEPC比例加入无水乙醇，乙醇与DEPC 体积比为3:4，温和颠倒，在温度4℃、转速8000rpm下离心5min，尽量去除上清；

9)室温静置晾干或烘干5-10min，除去乙醇，RNA样品切勿过于干燥，否则溶解困难；

10)使用50μL H

11)使用紫外分光光度计测OD

RNA反转录合成cDNA，流程如下：

1)RNA反转录去RNase离心管配制PCR体系，配制体系见表1。

表1.RT-PCR反应体系

配好后吸打混匀，离心后放置于冰上。

2)在50℃下孵育15min后，于85℃下孵育2min，得到的产物立刻用于PCR反应，或在-20℃保存，半年内可继续使用；长期保存建议分装后放置于-80℃冰柜内存放，cDNA应避免反复冻融。

2.3RxLR23基因PCR克隆引物设计

根据辣椒疫霉全基因组(https://genome.jgi.doe.gov/portal/)中 RxLR23基因序列(去信号肽序列)和重组载体pET28a(Novagen)两个酶切位点NcoI和XhoI设计一对特异引物：

上游引物RxLR23F：

5′-CATGCCATGGATGGAAGTCTCAGCTGGCAAG-3′

下游引物RxLR23R：

5′-CCGCTCGAGCGCCGCCGCCTTATACTTAT TG-3′。

为了后期RxLR23蛋白纯化，确保pET28a载体C-端his标签正常翻译，去掉RxLR23的终止密码子。其中，该对特异引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。PET28a载体图谱如图1所示。

2.4目的RxLR23基因PCR扩增

通过聚合酶链式反应从cDNA中扩增目的片段，PCR反应体系见表2。

表2.RxLR23基因PCR扩增体系

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，扩增条带长度为1100bp 左右，与目的基因条带大小基本一致。PCR扩增目的基因片段利用胶回收试剂盒(DNA回收试剂盒)回收，回收产物可在-20℃下短期保存备用。目的RxLR23基因PCR扩增结果如图2所示，图2中，M：DNAMarker，1-4：RxLR23基因DNAPCR扩增条带。

3.重组载体构建

3.1目的基因和载体双酶切

将RxLR23基因PCR扩增胶回收产物和载体pET28a分别用酶1 (NcoI)和酶2(XhoI)进行双酶切，37℃下水浴2～3h。双酶切反应体系如表3所示。将酶切之后的RxLR23和载体pET-28a用胶回收试剂盒进行回收，

表3.RxLR23和载体pET28a双酶切反应体系

3.2目的基因RxLR23连接至载体pET28a

将酶切的RxLR23基因DNA片段与载体pET28a(Novagen)回收后，用Solution I在16℃下连接3h，连接体系见表4。

表4.RxLR23连接至载体pET-28a反应体系

3.3 pET28a重组载体转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态

1)取50μL DH5α感受态细胞冰浴融化，加入连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；

2)在42℃的水浴下热激90s，然后快速将离心管冰浴2min；

3)在超净台，每个离心管加入500μL无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm振荡培养45～60min，确保宿主菌完全复苏；

4)在常温离心机8000rpm离心1min，弃掉部分上清，用移液器菌体重悬，混匀后涂布至LB琼脂培养基(含相应抗生素)，然后在37℃培养箱中倒置培养12h～16h。

3.4重组载体pET28a鉴定

待上述制备的感受态细胞在平板上长出菌斑后，在1.5mL离心管中加入1mL无菌LB液体培养基(含相应抗生素)，挑取已长出的单菌落置于含LB液体培养基离心管中，37℃下振荡培养5～6h，作为菌液PCR模板，适时进行菌液PCR鉴定，菌液PCR反应体系见表5。

表5.重组载体pET28a菌液PCR反应体系

菌液PCR反应样品进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，有PCR扩增结果的视为阳性样品，取阳性样品菌液500μL送青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成测序，测序结果用DNAman软件与基因组序列比对分析，取测序结果正确的菌液500μL，加入50％灭菌甘油500μL后，置于-20℃冰柜中保存，另取测序结果正确的菌液提取质粒，置于-20℃冰柜中保存待用，质粒提取参照CWBIO高纯度质粒小提试剂盒说明书进行。

4.RxLR23重组蛋白表达

4.1RxLR23重组蛋白试表达

1)将测序正确的pET28a重组质粒转化至E.coli Rosetta(DE3)菌株中，常温离心机8000rpm离心1min，弃掉部分上清，用移液器菌体重悬，混匀后涂布至LB琼脂平板培养基(含相应抗生素)，然后在37℃培养箱中倒置培养12h～16h。

2)挑取单个菌斑接种于盛有1.5mL的LB液体培养基(加Kan 抗性)离心管中，于37℃、180rpm振荡培养6h；

3)取1mL振荡培养液接种于盛有1.5mL的LB液体培养基(加 Kan抗性)培养至OD

4)诱导菌液和对照菌液分别加入不同浓度的诱导剂(IPTG)，在37℃、180rpm下诱导3h；

5)诱导后，各取1mL菌液，与对照同时在12000rpm下离心 1min；弃上清，分别加入40μL 2×Binding Buffer重悬混匀，然后加入40μL 2×加缓冲液(Loading Buffer)混匀；

6)取样品煮沸15min后，其中间隔5min振荡1次，共振荡2 次，SDS-PAGE电泳上样前12000rpm离心1min；

7)取20μL样品进行SDS-PAGE电泳，观察目的蛋白表达情况，确定诱导剂(IPTG)适宜浓度为0.5mM；

8)取表达目的蛋白菌液500μL，加入50％灭菌甘油500μL混匀混合后，装至灭菌冻存管中，于-20℃冰柜中保存。

然后利用SDS-PAGE电泳技术检测目的蛋白表达情况， SDS-PAGE电泳结果表明，与对照相比，pET-28a-RxLR23蛋白经适宜浓度诱导剂(IPTG)诱导处理后，诱导RxLR23表达出分子量为 41KDa(去除信号肽)条带的蛋白，其分子量大小与PcRxLR23预测分子量大小一致，由此pET28a-RxLR23蛋白原核表达系统构建成功，结果见图3，图3中，M：Proteinmarker(蛋白质标记)；1～4：IPTG 诱导RxLR23蛋白表达。

4.2RxLR23融合蛋白大量表达

1)对已保存的表达量较高的菌株进行活化，按1:100比例接种至含50mg/mL Kan的1L LB液体培养基中，在37℃、180rpm下振荡培养3～4h，使其OD

2)提前确保摇床降温至16℃，加入终浓度为1mM的诱导剂 (IPTG)，16℃条件下120rpm过夜诱导16～21h，确保OD

实施例2辣椒疫霉效应因子RxLR23在促进植物生长中的应用

1.RxLR23蛋白在促进辣椒、黄瓜、番茄幼苗根系发育及幼苗长势中的应用

1)按照实施例1所述的方法，诱导制备大量的含有RxLR23蛋白的菌悬液，监测OD

2)利用无菌水将OD

2RxLR23蛋白溶液促进辣椒、黄瓜及番茄幼苗根系发育及其长势结果分析

1)RxLR23蛋白促进辣椒幼苗根系发育及其长势结果分析

如图4所示，经RxLR23蛋白处理的辣椒幼苗5叶期，幼根平均长度为4.6cm(统计30株幼苗根系)，而对照CK(LB培养基)处理的辣椒幼苗5叶期，幼根平均长度为3.1cm(统计30株幼苗根系)，前者较后者幼根平均长度增长1.5cm。

如图5所示，经RxLR23蛋白处理的辣椒幼苗5叶期，幼苗平均高度为14.5cm(统计30株幼苗高度)，而对照CK(LB培养基)处理的辣椒幼苗5叶期，幼苗平均高度为11.5cm(统计30株幼苗高度)，前者较后者幼根平均高度增加3cm。可见RxLR23蛋白可明显的促进辣椒幼苗根系发育与长势。

2)RxLR23蛋白进黄瓜幼苗根系发育及其长势结果分析

如图6所示，经RxLR23蛋白处理的黄瓜幼苗5叶期，幼根平均长度为4.5cm(统计30株幼苗根系)，而对照CK(LB培养基)处理的黄瓜幼苗5叶期，幼根平均长度为2.5cm(统计30株幼苗根系)，前者较后者幼根平均长度增长2cm。

如图7所示，经RxLR23蛋白处理的黄瓜幼苗6叶期，幼苗平均高度为15.5cm(统计30株幼苗高度)，而对照CK(LB培养基)处理的黄瓜幼苗6叶期，幼苗平均高度为13.5cm(统计30株幼苗高度)，前者较后者幼根平均高度增加2cm。可见RxLR23蛋白可明显的促进黄瓜幼苗根系发育与长势。

3)RxLR23蛋白进番茄幼苗根系发育及其长势结果分析

如图8所示，经RxLR23蛋白处理的番茄幼苗5叶期，幼根平均长度为3.5cm(统计30株幼苗根系)，而对照CK(LB培养基)处理的番茄幼苗5叶期，幼根平均长度为2.0cm(统计30株幼苗根系)，前者较后者幼根平均长度增长1.5cm。

如图9所示，经RxLR23蛋白处理的番茄幼苗6叶期，幼苗平均高度为12.5cm(统计30株幼苗高度)，而对照CK(LB培养基)处理的番茄幼苗6叶期，幼苗平均高度为9.5cm(统计30株幼苗高度)，前者较后者幼苗平均高度增加3cm。可见RxLR23蛋白可明显的促进番茄幼苗根系发育与长势。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 辣椒疫霉效应因子RxLR23在促进植物生长中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)

<400> 1

atgcgtcttc attatatcgt tgtgctcgcg gtcattgcct tcgccacgaa cgggaatgaa 60

gtctcagctg gcaagtcccg tgtcgccata actactactg gtgcacttga cacccccaca 120

accagactct tgaggaccca gtacacggac gaagagaggg cgttcggcct caatcttctc 180

cctggaagca agaaaatctc aagtatcata acaaacaaga aactgtccaa gtatctcaag 240

agcaaccaag aattcgacga cgtgttcatc aaactcaagc tcgacaaggc cggagacaag 300

ttgttcgaga acccgaaatt cctcgcttgg gctcaatacg tggacgattt caatcagaaa 360

caccagaccc agaactcgat gctccccacg cttgtgcgac agtttggagg cgatgatctg 420

tcgattatgt tggaaaaggc caagcaggca gacaaaacct acggggtggc gttgagactt 480

cagggcgaac agatgaaact ctggagacgt gaaggtctca ctactgacat gctcttcaaa 540

atctacaaat tagatgatgg ggctacgaat ctgctggaaa acccaggcat caaaatttgg 600

atgaggtacg cagacgaact tttccctgga gactccacac ttctcttcaa gaagctgcaa 660

aagacgtatt cggacgaggc gttatccaaa atcttgatca acgggaaaac agtcgcaagt 720

acggagaagt tggcgtcgga cttgcagaac cagcaacttc gttattggtt gaaggatctt 780

gtgcctccag agaaggcctt ccagctgctg tcactcaaca agggggcgga cgatgtgttt 840

ggtagtcccc aactgcagac gtggattcgg tacaatgcag cttacgccaa gcagaatccg 900

tacgctcaca aggcgacgct gatcgatacg ctcctggaga atttcgacac tgccgctatg 960

gtcaaaatgc tcaaaacgag gccgaataca gcctacggca agcatttggc tggtggggtg 1020

gaacgtgatc tcatcaaaag gtgggttacg gacggaaaac cgctcaaatt tgttgtcgag 1080

aacctggggt cgtcatcgcc tgccaagaag gagtttgtga cggggttata caataagtat 1140

aaggcggcgg cgtag 1155

<210> 2

<211> 366

<212> PRT

<213> 辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)

<400> 2

Met Gly Val Ser Ala Gly Leu Ser Ala Val Ala Ile Thr Thr Thr Gly

1 5 10 15

Ala Leu Ala Thr Pro Thr Thr Ala Leu Leu Ala Thr Gly Thr Thr Ala

20 25 30

Gly Gly Ala Ala Pro Gly Leu Ala Leu Leu Pro Gly Ser Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Ile Ile Thr Ala Leu Leu Leu Ser Leu Thr Leu Leu Ser Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ala Ala Val Pro Ile Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Gly

65 70 75 80

Ala Leu Leu Pro Gly Ala Pro Leu Pro Leu Ala Thr Ala Gly Thr Val

85 90 95

Ala Ala Pro Ala Gly Leu His Gly Thr Gly Ala Ser Met Leu Pro Thr

100 105 110

Leu Val Ala Gly Pro Gly Gly Ala Ala Leu Ser Ile Met Leu Gly Leu

115 120 125

Ala Leu Gly Ala Ala Leu Thr Thr Gly Val Ala Leu Ala Leu Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Met Leu Leu Thr Ala Ala Gly Gly Leu Thr Thr Ala Met Leu

145 150 155 160

Pro Leu Ile Thr Leu Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Leu Leu Gly Ala

165 170 175

Pro Gly Ile Leu Ile Thr Met Ala Thr Ala Ala Gly Leu Pro Pro Gly

180 185 190

Ala Ser Thr Leu Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Thr Thr Ser Ala Gly

195 200 205

Ala Leu Ser Leu Ile Leu Ile Ala Gly Leu Thr Val Ala Ser Thr Gly

210 215 220

Leu Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ala Gly Gly Leu Ala Thr Thr Leu Leu

225 230 235 240

Ala Leu Val Pro Pro Gly Leu Ala Pro Gly Leu Leu Ser Leu Ala Leu

245 250 255

Gly Ala Ala Ala Val Pro Gly Ser Pro Gly Leu Gly Thr Thr Ile Ala

260 265 270

Thr Ala Ala Ala Thr Ala Leu Gly Ala Pro Thr Ala His Leu Ala Thr

275 280 285

Leu Ile Ala Thr Leu Leu Gly Ala Pro Ala Thr Ala Ala Met Val Leu

290 295 300

Met Leu Leu Thr Ala Pro Ala Thr Ala Thr Gly Leu His Leu Ala Gly

305 310 315 320

Gly Val Gly Ala Ala Leu Ile Leu Ala Thr Val Thr Ala Gly Leu Pro

325 330 335

Leu Leu Pro Val Val Gly Ala Leu Gly Ser Ser Ser Pro Ala Leu Leu

340 345 350

Gly Pro Val Thr Gly Leu Thr Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala

355 360 365