一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及硝基化酪氨酸肽段富集技术领域，尤其涉及一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料及其筛选方法和应用。本发明的筛选方法能够通过筛选一种人工合成的硝基化酪氨酸肽段获得具有特异性结合氨基酸序列的材料来富集不同类型的更为复杂的硝基化酪氨酸肽段。本发明筛选方法选用的噬菌体随机肽库中的多肽分子量小，从而筛选得到的富集材料的分子量小，易于通过化学合成方法获得，相比抗体成本较低。同时该富集材料保存比较容易，富集的环境也可以比较剧烈，要求低。且通过该筛选方法筛选的富集材料肽对半复杂样品富集效果强。通过该筛选方法筛选的多肽能够从1000倍酶解BSA中富集硝基化酪氨酸肽段。

说明书

技术领域

本发明涉及富集硝基化酪氨酸肽段的技术领域，尤其涉及一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料及其制备方法和应用。

背景技术

硝基化是一种硝基通过硝化反应连接到化合物上的一种氧化修饰，可以发生在脂肪酸，核酸和蛋白质中。蛋白质中的酪氨酸，色氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸都可以发生硝基化，通常蛋白质硝基化是指硝基化酪氨酸。蛋白质酪氨酸硝化修饰是指添加一个硝基（-NO

正常生理组织中蛋白质会发生硝基化修饰以消耗内环境中的活性氧、获得新的功能、或者参与其他重要的生命活动。如豆类根瘤中的豆血红蛋白通过硝基化吸纳环境中的活性氮以减少机体氧化损伤。在硝基化氧化应激发生的病理部位，如神经退行性疾病病人的脑，肺癌病人的肺部，受损的植物组织，蛋白质硝基化程度会随着活性氧或活性氮浓度的增加而增加。pH值偏低的细胞微环境，如某些肿瘤组织，或代谢性酸中毒的情况下，也可能促进整体硝基化水平的提高。

除此之外，蛋白质硝基化的发生还与衰老、伴随衰老发生的其他疾病，糖尿病、冠心病、哮喘等慢性病相关。

生物样品体内硝基化酪氨酸的低丰度性，复杂样品的硝基化蛋白在鉴定前一般含有预分离或富集的步骤。蛋白质硝基化酪氨酸在许多领域被研究。如，样品质谱鉴定蛋白质；IP（多克隆抗体）+SDS-PAGE+胶内酶解分离样品质谱鉴定蛋白质； IP（多克隆抗体）+胶内酶解分离样品质谱鉴定蛋白质；其他分离方法，2DE分离，样品质谱鉴定蛋白质。常用的抗体缺乏对硝基酪氨酸的选择性，在某些组织中背景值较高，检测的选择性依赖于硝基化酪氨酸残基附近的特异性表位等等。目前的特异性吸附基本依赖于抗体，本文尝试用噬菌体展示的多肽富集硝基化肽段。

1985年George P. Smith首次建立噬菌体展示技术，噬菌体展示随机肽库库容量很大，能够寻找到特异性肽结合硝基化酪氨酸，可以作为研究硝基化酪氨酸的一种工具。相对于具有其他硝基酪氨酸位置的肽，此方法对硝基酪氨酸的肽具有高的亲和力，这引起了对未来研究的需求。

发明内容

为解决抗体缺乏对硝基化的酪氨酸的选择性，或具有非特异性吸附，或结合的选择性依赖于硝基化酪氨酸残基附近的特异性表位的问题，本发明提出一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料，该材料为噬菌体展示随机肽库中筛选得到的多肽，其是一种泛特异性的肽段，以进行无偏见的蛋白质组范围的硝基化酪氨酸肽段的富集，噬菌体展示随机肽库筛选的多肽，与传统的抗体技术相比，多肽来源更快，更便宜，技术要求低。此外，本发明还提出了利用上述材料的筛选方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料，包括如NT-1所示的多肽序列，即Thr-Leu-Trp-Pro-Phe-Asp-Leu-Trp-Leu-Lys-Thr-Arg。

本发明的具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料的筛选方法，包括如下步骤：

S1：噬菌体展示随机肽库先与对照组珠子（偶联了未硝基化酪氨酸的肽段的CNBr活化琼脂糖珠）预孵育，然后离心将上清与偶联了硝基化酪氨酸的肽段的CNBr活化琼脂糖珠混合进行孵育，富集与硝基化酪氨酸特异性结合的噬菌体并进行扩增；

S2：挑取扩增得到的噬菌体中的阳性克隆后进行DNA测序，获得多肽的氨基酸序列后合成得到多肽肽段；

S3：通过富集实验验证筛选得到的能够富集硝基化酪氨酸肽段的材料；

所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量少于20个。

作为优选地，所述噬菌体展示随机肽库中的多肽的氨基酸数量为12个。

本发明提供的具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料的筛选方法可以针对不同的硝基化酪氨酸肽段快速筛选出能够结合的肽段。该筛选方法中选用的噬菌体随机肽库中的多肽分子量小，从而筛选得到的富集材料的分子量小，易于通过化学合成方法获得，降低了富集硝基化酪氨酸肽段的成本。

优选地，材料与硝基化酪氨酸特异性结合的筛选结合靶点是单独的硝基化酪氨酸，或者是肽段的硝基化酪氨酸，或者是蛋白质的硝基化酪氨酸，具体为GGGGY(NO

所述步骤S1中，噬菌体展示随机肽库与偶联了硝基化酪氨酸的肽段的CNBr珠子混合的温度优选在37℃下，50rpm旋转孵育；

所述步骤S1中，与偶联了硝基化酪氨酸的肽段的CNBr活化琼脂糖珠混合后，还包括：离心去除未结合的噬菌体，然后采用洗脱液从硝基化肽段上洗脱下噬菌体；所述洗脱液为酸性缓冲液，具体地，所述酸性缓冲液为Gly-HCl。

所述步骤S1中，扩增操作具体步骤为：将富集得到的噬菌体感染大肠杆菌后进行培养；所述培养的条件，优选为37℃、250rpm振荡培养4.5 h。

本发明步骤S2中，还包括：对扩增得到的噬菌体重复步骤S1 1～5次，优选为4次。

本发明步骤S2中，挑取扩增得到的噬菌体中的阳性克隆具体为：将步骤S1中噬菌体扩增后的大肠杆菌接种至平板培养基上进行培养，挑取蓝色噬菌斑，得到阳性克隆。将所述阳性克隆进行DNA测序，从而获得多肽的氨基酸序列，利用化学合成法合成多肽，合成的多肽为D型多肽和L型多肽，本发明实施例筛选的多肽为L型多肽。

本发明步骤S3中，富集实验验证为使用不同质量比的酶解BSA肽段与GGGGY(NO

本发明步骤S3中，富集实验验证还包括用SVSSSSY(NO

实验证明，本发明筛选得到的富集硝基化酪氨酸的多肽序列对不同类型的硝基化肽段有明显的富集作用。

本发明还提供了上述具有富集硝基化酪氨酸肽段功能的材料在半复杂样品中富集硝基化酪氨酸肽段的应用。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明的筛选方法能够通过筛选一种人工合成的硝基化酪氨酸肽段获得具有特异性结合氨基酸序列的材料来富集不同类型的更为复杂的硝基化酪氨酸肽段。本发明筛选方法选用的噬菌体随机肽库中的多肽分子量小，从而筛选得到的富集材料的分子量小，易于通过化学合成方法获得，相比抗体的成本低。同时该富集材料保存比较容易，富集的环境也可以比较剧烈，要求低。且通过该筛选方法筛选的富集材料肽对半复杂样品富集效果强。

附图说明

图1为本发明的筛选方法的流程示意图；

图2为本发明合成的多肽与GGGGY(NO

图3为本发明合成的多肽与不同类型的硝基化酪氨酸多肽0倍酶解BSA中富集能力的探究结果图；

图4为本发明合成的多肽与不同类型的硝基化酪氨酸多肽在250倍酶解BSA中富集能力的探究结果图；

图5为本发明合成的多肽与不同类型的硝基化酪氨酸多肽在1000倍酶解BSA中富集能力的探究结果图。

具体实施方式

为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。

本发明实施例中，随机12肽的噬菌体展示肽库购自New England Bio Labs；大肠杆菌E .coli ER2738来自New England Bio Labs；噬菌体单链DNA抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；合成多肽的氨基酸在吉尔生化购买；LB培养基购自生工；CNBr-activated Sepharose 4B来自 GE Healthcare。

实施例1靶点合成

本实施例先采用Fmoc固相合成靶点肽，然后将合成的肽段与珠子偶连，具体操作如下：

（1）GGGGY(NO

（2）活化羧基琼脂糖珠子

（3）酪氨酸肽段的偶联，用200 μl结合缓冲液（0.1 M NaHCO

（4）封闭及保存，将孵育好的珠子肽段材料转入合成柱中，收集流下的游离肽段溶液，用干净的1 ml注射器吸净残留液滴一并收集。用30 ml结合缓冲液分三次流过珠子肽段材料，流尽液体后，加入10倍珠子体积的0.1 M Tris-HCl，室温，避光，静置3 h，期间，时不时重悬珠子悬浮液；

（5）用20倍珠子体积的无菌1×PBS洗涤封闭后的珠子肽段材料，用含0.02 % NaN

实施例2噬菌体展示筛选

本实施例利用随机12肽噬菌体展示肽库，针对酪氨酸硝基化肽段进行噬菌体展示筛选实验，筛选实验原理见图1，具体操作如下：

（1）大肠杆菌的复苏及培养，将商业ER2738大肠杆菌接种于LB-Tet平板，37 ℃培养过夜。挑取单菌落接种于20 ml LB肉汤培养基中，37℃，250 rpm培养至OD

（2）筛选试验前的封闭，分别用100 μl封闭液重悬含4 μg GGGGYGGG的CNBr活化琼脂糖珠和4 μg GGGGY(NO

（3）扣除与非硝基化酪氨酸肽段和基质相互作用的噬菌体，用TBS洗涤去除封闭后的CNBr活化琼脂糖珠中残留的NaN

（4） 硝基化酪氨酸肽段与噬菌体库共孵育，如前洗涤去除残留的NaN

（5）洗涤孵育后未结合的噬菌体，重复4000 g离心1 min去上清加入1 ml含0.2 %吐温的TBST重悬静置1 min操作5次；

（6）洗脱所结合的噬菌体，最后一次去除洗涤液上清后，加入1 ml洗脱液，室温洗脱10 min后立即加入150 μl中和液。混合，4000 g离心1 min，取得上清即第一轮筛选得到的噬菌体库；

（7）筛选得到的噬菌体库的扩增，按1:100的比例，即取200 μl 步骤（1）中准备的对数期的大肠杆菌悬浮液加入20 ml LB肉汤培养基。取500 μl洗脱得到的噬菌体悬浮液加入其中。37℃，250 rpm，培养4.5 h；

（8）沉淀纯化扩增所得噬菌体，将扩增所得的大肠杆菌和噬菌体的培养物于无菌操作台倒入50 ml离心管。4 ℃，4000 g离心10 min。立即于无菌操作台倒出约16 ml的上清入另一无菌50 ml离心管。加入4 ml噬菌体沉淀液。小心混匀后，于冰上静置2 h以上。配平后于4℃，12000 g，离心10 min。去除上清，用1 ml TBS重悬沉淀后转移入1.5 ml EP离心管，加入占终体积六分之一的噬菌体沉淀液，混匀后于冰上静置15 min。于4℃，12000 g，离心10 min。去上清，加入200 μl TBS重悬噬菌体沉淀，4 ℃暂存一周后，将大部分噬菌体悬浮液按体积加入终浓度为50 %无菌甘油，混匀后于80℃长期保存；

（9）第二至第四轮的筛选，后续几轮筛选基本同第一轮的筛选步骤，都先用4 μgGGGGYGGG CNBr活化琼脂糖珠悬浮液扣去与非硝基化酪氨酸结合的噬菌体，再取上清加入到GGGGY（NO

实施例3噬菌体单克隆扩增、提取及测序

为获得经过筛选后噬菌体的氨基酸序列，需要挑取噬菌体单克隆进行扩增并提取单链DNA，然后进行DNA测序，具体步骤如下：

(1)接种E.coli ER2738至20ml LB培养基中，于恒温培养箱中37℃、250rpm培养至OD600约为0.6，分别取1ml菌液至无菌离心管中；

(2)从第四轮筛选后的计数平板上挑取91个分离清楚的蓝色噬菌斑，分别接种到上述离心管中，于恒温培养摇床37℃、250rpm培养4.5 h；

(3)按照噬菌体单链DNA抽提试剂盒说明中操作方法，提取16个单克隆的单链DNA；

(4)分别将16个单链DNA测序，测序引物为GCCCTCATAGTTAGCGTAACG(5’→3’)；

(5)将测序所得序列转换为氨基酸序列。

测序结果见表1。

表1测序后碱基序列翻译为氨基酸序列结果

实施例4多肽合成

筛选到的多肽采用Fmoc固相化学合成方法，合成的多肽粗品用高效液相色谱纯化并用质谱分析分子量以及电荷，纯化后的多肽冻干，于-20℃保存备用。

实施例5筛选到的多肽材料（NT-1）与靶标肽结合探究

为了验证筛选到的多肽材料NT-1与硝基化酪氨酸肽段之间能够相互作用，可以从酶解BSA中富集目标肽段。硝基化肽段用MALDI-TOF MS鉴定将会产生很多的峰，为了便于分析数据，使用GGGGY(NO

（1）GGGGY(NO

（2）将固定浓度偶联硝基化肽段GGGGY(NO

（3）离心分离珠子和上清，用1 ml含0.5 % Triton X-100的PBS洗涤3遍，PBS洗涤1遍；

（4）用pH 2.3 0.2 M Gly-HCl洗脱，C18 ZipTip脱盐，点样后用MALDI鉴定。

结果如图2所示，在未富集前，NT-1的峰被BSA肽段的峰完全掩盖。从100倍、200倍、500倍、1000倍质量的BSA酶解肽段混合液中都能够富集到NT-1，表明 GGGGY(NO

实施例6 NT-1用于富集半复杂样品中的天然硝基化肽

NT-1能够和GGGGY(NO

（1）NT-1肽固定在CNBr琼脂糖珠参照实施例1；

（2）10 μM NT-1肽固相基质与800 nM天然硝基化肽段混合液分别于不含BSA酶解产物，250倍，1000倍质量的BSA酶解肽段共孵育3 h，其中溶液为0.5 % Triton X-100的PBS；

（3）离心分离珠子和上清，用1 ml含0.5 % Triton X-100的PBS洗涤3遍，PBS洗涤1遍；

（4）用pH 2.3 0.2 M Gly-HCl洗脱，C18 ZipTip脱盐，点样后用MALDI鉴定。

硝基化酪氨酸肽段与酶解BSA肽段质量比为1:0时，所述NT-1能够将8条硝基化肽段全部富集，图3结果为SVSSSSY (NO

所述硝基化肽段与酶解BSA肽段质量比为1:250时，所述NT-1能够将8条硝基化肽段全部富集，图4结果为SVSSSSY(NO

所述硝基化肽段与酶解BSA肽段质量比为1:1000时，所述NT-1能够将7条硝基化肽段富集，图5结果为SVSSSSY(NO

所述富集时间为3小时。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。