一种筛选PHA产生菌的方法

摘要

本发明公开了一种筛选PHA产生菌的方法，步骤如下:1）培养基的制作；2）PHA产生菌的富集；3）PHA产生菌的的筛选：向培养基平板中喷洒溴百里酚蓝指示剂，对菌落周围变蓝的菌落做好标记，置于紫外灯下观察，若有橙色荧光出现则为PHA产生菌；用灭菌枪头挑取上述单菌落，涂片，置于荧光显微镜蓝光下观察验证，然后，挑取单菌落，摇床中振荡富集2h，用接种环蘸取少量菌液在新的平板培养基上划线分离，37℃倒置培养24h后，挑取单菌落并编号，如此反复纯化分离。本发明从众多筛选PHA产生菌的指示剂中，选择两种指示剂，采用一步筛选法，节约时间，节省材料，同时还能降低假阳性率，减少纯化分离所需周期。

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，尤其涉及一种筛选PHA产生菌的方法。

背景技术

PHA (聚羟基脂肪酸酯，Polyhydroxyalkanoate)是广泛存在于多种微生物及其它生物体内的一种胞内聚酯。PHA 具有与化学合成塑料相似的物理机械特性，同时也具有合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。PHA在自然界中可降解，造成的环境污染小，是可再生的生物资源，有利于可持续发展，在很多领域有着较大的应用潜力。例如 可以利用类似塑料的物化性质制作包装材料或者日常消费用塑料制品，用其替代现有的大规模使用的石油来源的不可降解塑料，将有助于解决“白色污染”等环境问题；利用良好的生物相容性和生物可降解性，PHA 材料可作为医用植入材料和可控药物缓释载体，在高附加值的细胞组织工程领域也有很大的应用前景；PHA 作为一种胞内生物聚酯，是多种微生物(包括细菌、古细菌)在碳源过剩时储备能量和碳源的物质，PHA 本身具有可燃性，可以用于制备生物燃料。

目前，在细胞水平上检测筛选PHA产生菌的方法主要是利用检测脂类的指示剂进行细胞染色，例如苏丹黑染色、尼罗蓝染色、溴百里酚蓝染色和尼罗红染色等。他们大都是通过单个指示剂筛选或多个指示剂分步筛选PHA产生菌， 假阳性率高，耗时耗力，浪费材料。

发明内容

本发明为了解决上述现有技术中存在的缺陷和不足，提供了一种从众多筛选PHA产生菌的指示剂中，选择两种指示剂（溴百里酚蓝和尼罗红），将初筛和复筛步骤合并为一步筛选，节约时间，节省材料，同时还能降低假阳性率，减少纯化分离所需周期的筛选PHA产生菌的方法。

本发明的技术方案：一种筛选PHA产生菌的方法，步骤如下：

1）培养基的制作：胰蛋白胨 1.5 g，酵母提取物 1.5 g，葡萄糖 10.0 g，蔗糖 2.0 g，麦芽糖 2.0 g，甘露醇 1.0 g，氯化钠 5.0 g，琼脂粉 20.0 g，溴百里酚蓝1.0 g，所有试剂溶解于 800ml 纯水中，搅拌溶解，定容至 1000ml，调 pH 值至6.5～7.0, 121 ℃高压 20min，冷却至60 °C左右后，添加1.0 g/L的尼罗红贮存液，按终浓度0.5 ug/ml加入到无菌上述混合液中，混合均匀后倒制平板；

2）PHA 产生菌的富集：取河泥样品 5.0 g 于250 mL 锥形瓶，加入 45 mL 无菌水，加入少许玻璃珠，37 ℃，200 rpm摇床中振摇 15 min；将河泥悬液稀释 10

3）PHA 产生菌的的筛选：向平板中喷洒 0.1%溴百里酚蓝指示剂，对菌落周围变蓝的菌落做好标记，然后，置于波长为 280−300 nm 紫外灯下观察，若有橙色荧光出现则为 PHA产生菌；同时，尼罗红检测酯类物质的时候，还可以通过荧光强度判断哪些菌高产酯类物质，用灭菌枪头挑取上述单菌落，涂片，置于荧光显微镜 420−490 nm 蓝光下观察验证，然后，挑取单菌落，于37 ℃，200 rpm摇床中振荡富集2 h，用接种环蘸取少量菌液在新的平板培养基上划线分离，37 ℃倒置培养24 h后，挑取单菌落并编号，如此反复纯化分离。

优选地，所述步骤1）中尼罗红贮存液由固体尼罗红溶解在二甲基亚砜溶液中制得。

优选地，所述步骤3）中溴百里酚蓝指示剂由1.0 g溴百里酚蓝溶于 1 L 20%乙醇溶液中制得。

本发明从众多筛选PHA产生菌的指示剂中，选择两种指示剂（溴百里酚蓝和尼罗红），将初筛和复筛步骤合并为一步筛选，节约时间，节省材料，同时还能降低假阳性率，减少纯化分离所需周期。

附图说明

图1和图2为产碱菌株遇溴百里酚蓝变蓝示意图；

图3和图4为尼罗红染色后的阳性菌株示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，但并不是对本发明保护范围的限制。

一种筛选PHA产生菌的方法，步骤如下：

1）培养基的制作：胰蛋白胨 1.5 g，酵母提取物 1.5 g，葡萄糖 10.0 g，蔗糖 2.0 g，麦芽糖 2.0 g，甘露醇 1.0 g，氯化钠 5.0 g，琼脂粉 20.0 g，溴百里酚蓝1.0 g，所有试剂溶解于 800ml 纯水中，搅拌溶解，定容至 1000ml，调 pH 值至6.5～7.0, 121 ℃高压 20min，冷却至60 °C左右后，添加1.0 g/L的尼罗红贮存液，按终浓度0.5 ug/ml加入到无菌上述混合液中，混合均匀后倒制平板；

2）PHA 产生菌的富集：取河泥样品 5.0 g 于250 mL 锥形瓶，加入 45 mL 无菌水，加入少许玻璃珠，37 ℃，200 rpm摇床中振摇 15 min；将河泥悬液稀释 10

3）PHA 产生菌的的筛选：向平板中喷洒 0.1%溴百里酚蓝指示剂，对菌落周围变蓝的菌落做好标记，然后，置于波长为 280−300 nm 紫外灯下观察，若有橙色荧光出现则为 PHA产生菌；同时，尼罗红检测酯类物质的时候，还可以通过荧光强度判断哪些菌高产酯类物质，用灭菌枪头挑取上述单菌落，涂片，置于荧光显微镜 420−490 nm 蓝光下观察验证，然后，挑取单菌落，于37 ℃，200 rpm摇床中振荡富集2 h，用接种环蘸取少量菌液在新的平板培养基上划线分离，37 ℃倒置培养24 h后，挑取单菌落并编号，如此反复纯化分离。

步骤1）中尼罗红贮存液由固体尼罗红溶解在二甲基亚砜溶液中制得。

步骤3）中溴百里酚蓝指示剂由1.0 g溴百里酚蓝溶于 1 L 20%乙醇溶液中制得。

PHA产生菌的筛选结论分析：

表1 PHA产生菌的筛选情况

如表1所示：从学校附近河边泥土中，使用溴百里酚蓝指示剂分离到了89个产碱菌株，其中产PHA菌株有2个（图1，图2）；通过尼罗红染色剂最终从76个具橙色荧光菌株中筛选到了3个PHA产生菌株（图3）；而利用改进的一步筛选法从25株均具有产碱特性和橙色荧光菌株中筛选到了3个PHA产生菌株。实验过程中，我们发现，在筛选PHA产生菌的时候，改进型筛选方法纯化分离的次数明显比单独使用染色剂法的要少。另外，在同样操作下，可以通过荧光强度判断哪些菌高产脂类物质（图3，图4），其中荧光显微镜的目镜倍数为10，物镜倍数为40。

溴百里酚蓝pH变色范围为6.0～7.6，颜色由黄到绿到蓝，还可以作为固体平板培养基的酸碱指示剂，检测培养环境有无酸碱胁迫。产碱菌株经溴百里酚蓝指示剂染色后会变为蓝色，经革兰氏染色后显红色，呈阴性。革兰氏阳性菌细胞壁含大量的肽聚糖，含磷壁酸，不含脂多糖；革兰氏阴性菌细胞壁较薄，分为外壁层和内壁层。外壁层分3层，最外层是脂多糖，中间是磷脂层，内层为脂蛋白，内壁层含极少肽聚糖，含脂多糖，不含磷壁酸。两者的不同还表现在各种成分的含量不同，尤其是脂肪含量明显不同，革兰氏阳性菌脂肪含量为1%～4%，革兰氏阴性菌脂肪含量为11%～22%。

由于培养基中的尼罗红染料在微生物生长过程中能够较好地穿透细胞膜进入细胞质, 最终与脂类物质结合, 而这种直接添加尼罗红至平板的方法对微生物生长并未产生负面影响。尼罗红检测酯类物质的时候，还可以通过荧光强度判断哪些菌高产酯类物质。

综上所述，将初筛和复筛步骤合并为一步筛选，节约时间，节省材料。一步筛选法降低了假阳性率，纯化分离所需的周期也相应减少了。

参考文献：

[1]陈国强,罗容聪,徐军,等.基羟基脂肪酸酯生态产业链——生产与应用技术指南[M].化学工业出版:北京,2008。

[2]苏涛,周河治,梁静娟.微生物合成可降解塑料聚羟基链烷酸(PHA)[J].工业微生物,1997,27(3):37-48。

[3]魏晓星, 李正军, 陈国强. 我国聚羟基脂肪酸酯产业链的发展概况[J]. 高分子通报, 2011(04):9-17。

[4]车雪梅,司徒卫,余柳松,王辉,陈亚精,司徒建崧,李耀,余景升,陈国强.聚羟基脂肪酸酯的应用展望[J].生物工程学报,2018,34(10):1531-1542。

[5]万耀月.聚羟基脂肪酸酯应用研究进展[J].当代化工研究,2017(07):84-85。

[6]一种可生物降解高阻隔型塑料制品及其制备方法[J].橡塑技术与装备,2018,44(04):64。

[7]王国影,刘长莉,卢丽霞,杨敬杰,李春玲.生物合成聚羟基脂肪酸酯(PHAs)的研究进展[J].安徽农业科学,2013,41(27):10960-10962。

[8]魏继华,刘越,李佳益,杨景辰,刘长莉.中短链聚羟基脂肪酸酯的低成本生产与应用[J].江苏农业科学,2019,47(16):39-45。

[9]张彤彤. 工程真养产碱杆菌产3-羟基丙酸和3-羟基丁酸共聚物的生物合成研究[D].青岛科技大学,2019。

[10]邹辉. 真养产碱杆菌以杨木纤维为基质发酵产PHA研究[D].中南林业科技大学,2019。

[11]尹进,车雪梅,陈国强.聚羟基脂肪酸酯的研究进展[J].生物工程学报,2016,32(06):726-737。

[12]何宗均,田阳,梁海恬.PHA产生菌的筛选与鉴定[J].天津农业科学,2017,23(04):23-25+43。

[13]林义,钟添华,骆祝华,黄翔玲,叶德赞.尼罗红染色法筛选产油酵母及定量检测胞内油脂含量的研究[J].微生物学通报,2012,39(01):125-137。

[14]张晗星. 聚羟基脂肪酸酯产生菌筛选及其在E.coli工程菌中表达与代谢机理研究[D].山东大学,2006。

[15]王海飙,刘长莉,刘润泽,常乐,王珺.一株产聚-β-羟基脂肪酸酯嗜盐菌的筛选与鉴定[J].东北林业大学学报,2016,44(05):97-100+107。