用于治疗纤维化、NASH和NAFLD的方法中的雷公藤内酯及其前药

摘要

本发明提供了一种式(I)化合物：或其药学上可接受的盐，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐用于预防性或治疗性治疗纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

说明书

背景技术

雷公藤内酯(Triptolide)是获自植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)的天然存在的化合物。已知雷公藤内酯可用于治疗自身免疫性疾病、移植排斥(免疫抑制)，并具有抗癌和抗生育作用以及其他生物作用(Qui和Kao,2003,Drugs R.D.4,1-18)。雷公藤内酯具有针对异种移植物肿瘤的强有力的抗肿瘤作用(例如，Yang等人Mol.Cancer Ther,2003,2,65-72)。雷公藤内酯是一种抗调亡剂，具有涉及癌生长和转移的多个细胞靶标。雷公藤内酯抑制NF-kB活化，诱导bid切割，阻断存活基因p21 WAF1/

国际专利申请公布号WO2010/129918报道了雷公藤内酯前药，据报道雷公藤内酯前药可用于治疗癌症。这些化合物之一

肝纤维化仍然是一个主要的健康问题，因为纤维化肝病有很高的死亡率且易于导致肝功能衰竭。迫切需要更好地了解与纤维化的起始、进展和消退相关的机制。

特别需要抗纤维化剂来预防晚期酒精性脂肪性肝炎(ASH)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，乙型和丙型病毒性肝炎(尽管出现了高效的抗病毒疗法)，以及(儿童)代谢性、胆源性和自身免疫性肝病的进展并诱导其逆转。

肝纤维化仍然是一个主要的健康问题，因为纤维化肝病有很高的死亡率且易于导致肝功能衰竭。虽然近20年来的深入研究已使人们对肝纤维化的发病机制有了相当大的了解，但仍缺乏有效的抗纤维化疗法。迄今为止，在临床实践中目前尚无普遍的抗纤维化疗法，因此对于晚期肝纤维化，基础疾病治疗和最终的肝移植是唯一的治疗选择。此外，目前治疗纤维化疾病的选择非常有限，迄今为止，还没有一种有效的药物能够成功靶向已确立的纤维化。目前，将大多数抗纤维化剂在非酒精性脂肪性肝病患者中进行了测试，这导致了额外的代谢作用。因此，目前尚不清楚正在进行的试验的预期结果是否可以推断出其他慢性肝病，如肝硬化或肝纤维化的早期阶段。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)在现代社会构成了巨大的健康负担，其发病率不仅在西方国家越来越高，在世界范围内也越来越高。NAFLD被认为是慢性肝病(CLD)最常见的病因之一。NAFLD的主要风险因素包括体重过重、胰岛素抵抗、2型糖尿病(T2D)、高血压、高密度脂蛋白(HDL)降低和高甘油三酯血症。NAFLD开始时是相对良性的脂肪变性，这是可逆的，主要特征是肝脏脂肪沉积。它涵盖了从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、纤维化和肝硬化等一系列肝损害。脂肪变性进展为NASH是一种严重的危及生命的疾病。随后，如果NASH进展为肝硬化或肝细胞癌，就会引起严重的健康问题。有趣的是，暴露于相同的代谢疾病(肥胖症和II型糖尿病)风险因素的患者并不总是会发展成NASH，其原因尚不清楚。研究表明，NAFLD是最常见的慢性肝病形式，在美国的发病率为10％-24％，在欧洲和亚洲可能也有类似的数据。同样，NASH的发病率在瘦人中为约3％-5％，在肥胖人群中为19％。NASH定义了非酒精性脂肪性肝病的一个亚组，其中肝脂肪变性与肝细胞损伤(包括细胞凋亡和肝细胞气球样变)以及炎症同时发生。迄今为止，对于NAFLD/NASH尚未批准任何药物治疗。

当前，需要用于治疗纤维化(例如，肝或肺中的纤维化)的改进的治疗剂，以及用于治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的改进的治疗剂。特别地，需要有效逆转纤维化早期的新颖且有效的抗纤维化剂。

发明内容

申请人已经确定Minnelide

或其药学上可接受的盐，

其中：

R是H或(CR

每个R

R

n是1、2或3。

本发明还提供了一种式I化合物或其药学上可接受的盐，所述式I化合物或其药学上可接受的盐用于预防性或治疗性治疗纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

本发明还提供了式I化合物或其药学上可接受的盐用于制造用于治疗哺乳动物(例如人)的纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的药物的用途。

如以下实施例中所示，已显示代表性的式I化合物Minnelide

附图说明

图1.采用DIO-NASH小鼠模型的单独使用Minnelide以及与依非兰诺(Elafibranor)或利拉鲁肽组合使用时的功效；图1的参考研究部分是指关于采用DIO-NASH小鼠模型的单独依非兰诺或单独利拉鲁肽的功效的历史参考研究(出版为

图2.肝半乳糖凝集素-3的组织学定量评估。首先分析扫描载玻片，以在低放大倍率下粗略检测组织(A)；高放大倍率下用抗半乳糖凝集素-3染色的肝的代表性图像(B，上部插图)；和脂肪变性(白色)、半乳糖凝集素-3(灰色)和组织(黑色)的检测结果(B，下部插图)；肝半乳糖凝集素-3分数估计为总组织的百分比；(C)终止时用抗半乳糖凝集素-3(Biolegend，目录号125402)染色的肝的代表性图像(放大倍率20x，比例尺＝100μm)；以及(D)通过形态计量术定量的终末相对肝半乳糖凝集素-3(Gal-3)(面积分数％)。值表示为n＝12-14的平均值+SEM。Dunnett检验单因子线性模型。**：与媒介物+媒介物相比，P<0.01；***：与媒介物+媒介物相比，P<0.001。

图3.通过形态计量术定量的终末相对肝羟脯氨酸(HP)(面积分数％)。值表示为n＝12-14的平均值+SEM。Dunnett检验单因子线性模型。**：与媒介物+媒介物相比，P<0.01；***：与媒介物+媒介物相比，P<0.001。

图4.通过形态计量术定量的终末相对肝α-SMA(面积分数％)。值表示为n＝12-14的平均值+SEM。Dunnett检验单因子线性模型。**：与媒介物+媒介物相比，P<0.01；***：与媒介物+媒介物相比，P<0.001。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“(C

如本文所用，术语“(C

如本文所用，术语“(C

如本文所用，术语“芳基”是指苯基基团或具有约九个至十个环原子的邻位稠合双环碳环基团，其中至少一个环为芳香族的。该术语以如苯基、茚满基、茚基、萘基、1,2-二氢萘基和1,2,3,4-四氢萘基等基团为例说明。

如本文所用，术语“芳基(C

本文使用的术语“包含”意指所引述的要素或其结构或功能等同物，加上未引述的任何其他要素。除非上下文另外说明，否则术语“具有”和“包含”也应解释为是开放式的。术语如“大约”、“大体上”、“基本上”等应解释为修饰某一术语或值，使得所述术语或值不是绝对的，但是在现有技术下无法标明。此类术语将视情况而确定，而且本领域技术人员了解其修饰的术语。对于测量某一值的给定技术，这包括了最低程度的预期实验误差、技术误差和仪器误差。

本文将措词“治疗有效量”和“药用有效量”用于意指例如在施用至活的哺乳动物时足以降低或抑制体内癌细胞生长的量。该措词意指对于给定施用途径确定的产生预定的并与给定活性成分相关的生理作用所需要的量，如根据已确立的药代动力学方法和技术测量的。

与活性化合物和组合物的量结合使用的措词“抑制有效量”意指例如如使用标准细胞培养测定技术所表明的所展现的抗肿瘤性质。

如本文所用，术语“前药”意指在产生生物活性前需要进一步代谢(包括但不限于肝)的药物化合物。

本领域技术人员应了解的是具有手性中心的化合物可以光学活性和外消旋形式存在和分离。一些化合物可展现多形性。应了解的是化合物涵盖化合物的具有本文所述的适用性质的任何外消旋、光学活性、多形性或立体异构形式或其混合物，本领域中熟知的是如何制备光学活性形式(例如，通过重结晶技术解析外消旋形式、通过自光学活性起始物质进行合成、通过手性合成、或通过使用手性固定相进行色谱分离)。

式I化合物的盐可用作分离或纯化式I化合物的中间体。另外，施用作为药学上可接受的酸式盐或碱式盐的式I化合物可能是适当的。药学上可接受的盐的实例是有机酸加成盐和无机盐。

术语“有机阳离子或无机阳离子”或“阳离子有机或无机盐”包括本领域众所周知的有机阳离子或无机阳离子(例如金属盐或胺盐)，包括可与化合物上的O部分形成离子缔合并且无明显地不利影响对本发明目的而言所需的前药性质的阳离子部分。术语“药学上可接受的有机阳离子或无机阳离子”或“药学上可接受的阳离子有机或无机盐”包括对用于哺乳动物而言是药学上可接受的并且是本领域众所周知的“有机阳离子或无机阳离子”。

有机阳离子或无机阳离子包括但不限于锂、钠、钾、镁、钙、钡、锌、铝和胺阳离子。胺阳离子包括但不限于由氨、三乙胺、三甲胺(TRIS)、三乙醇胺、乙二胺、葡糖胺、N-甲基葡糖胺、甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、乙醇胺、胆碱等衍生的阳离子。在一个实施方案中，胺阳离子是其中X

在一个实施方案中，可以使用的合适阳离子有机或无机盐包括可与化合物上的O部分形成离子缔合且不明显地不利影响对于本发明目的而言所需的前药性质(例如溶解度、稳定性提高，以及活性化合物形式快速水解释放)的阳离子部分。优选地，X选自Li

药学上可接受的盐还可包括与形成生理上可接受的阴离子的酸形成的盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。还可形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。盐，包括药学上可接受的盐，可使用本领域众所周知的标准程序获得，例如通过使充分碱性的化合物(如胺)与产生生理学上可接受的阴离子的合适的酸反应。

式I化合物包括游离酸(例如-OP(O)(OH)

本领域技术人员应当了解的是，其中X

实施方案

R

R

R

R

R

R

X

X

式I化合物的另一个具体组是其中X

X

X

具体式I化合物是4-O-膦酰氧甲基雷公藤内酯二钠盐、14-O-膦酰氧乙基雷公藤内酯二钠盐或14-O-膦酰氧丙基雷公藤内酯二钠盐，或其盐。

盐的具体组是式Ia的盐：

其中每个X

可用于制备式I化合物的方法和可用于制备式1化合物的中间体示于流程1和流程2。所述化合物和盐也可如国际专利申请公布号WO2010/129918中所述制备。

流程1

流程2

可通过从式IA化合物：

中除去一个或多个保护基得到相应的式I化合物，来制备式I化合物。因此，式IA的中间体可用于制备式I化合物。

还可通过将式IB化合物：

的-SMe基团转化成-OP(O)(O

还可通过从式IC化合物：

中除去一个或多个保护基得到相应的式I化合物，来制备式I化合物。因此，式IC的中间体可用于制备式I化合物。

还可通过将式ID化合物：

的-SMe基团转化成-OP(O)(O

还可通过与药学上可接受的载体混合，将式I化合物或其盐配制成药物组合物。可按照制药领域技术人员容易获得的众所周知的化合物和技术来制备药物组合物。对于本发明的目的，药学上可接受的载体可以是任何常规和容易获得的生物学上相容的或惰性的物质，所述物质在配制或递送时在化学上与活性药物成分相容，并且不明显地消弱其预定的治疗效果。可使用本领域众所周知的标准程序和技术来制备药学上可接受的盐。

式I化合物或其盐的固体形式可以是纳米颗粒，因此制成纳米颗粒剂。式I化合物或其盐可使用多种赋形剂制剂配制，并制成如下所述的各种剂型。与化合物相关的化学性质和特性可供制备口服固体剂型。

式I化合物或其盐可配制成药物组合物，并可以各种适于所需的特定施用途径或系统的形式施用至接受者。施用途径可包括但不限于口服途径、肠胃外途径、静脉内途径(包括通过泵注射的静脉内途径)、肌内途径、局部途径(包括滴眼剂)、皮下途径和粘膜途径。化合物可与药学上可接受的载体(如惰性稀释剂)或可同化可食用的载体组合来全身性(例如口服)施用。因此可将包含化合物作为活性成分的药物组合物制备成多种剂型。例如，可将组合物装入硬胶囊或软胶囊(例如明胶或植物来源的胶囊材料)中。可将组合物压制成可吸收或经粘膜的片剂形式、含片、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂、栓剂等。活性成分的量可根据具体的所需药学有效剂量而变化。

片剂、含片、丸剂、胶囊等可含有其他成分，如粘合剂(如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶)；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；例如可用于压片技术的润滑剂(如硬脂酸镁)；甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜(aspartame)；以及矫味剂，如胡椒薄荷、冬青、樱桃等。可包括在组合物中的其他成分是甘露醇、脲、葡聚糖和乳糖非还原糖。

当剂型是胶囊时，它可含有液体载体，包括聚乙二醇、植物油等。可与某些剂型一起使用的其他材料包括明胶、蜡、虫胶、糖等。糖浆或酏剂形式可含有作为甜味剂的蔗糖、果糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和着色剂，以及矫味剂。

当通过输注或注射静脉内或腹膜内施用时，可在例如任选含有无毒表面活性剂的水或盐水中制备活性成分或其盐的溶液。可在甘油、液体聚乙二醇、三醋精及其混合物中以及在油中制备分散液。储存条件还可能需要包括防腐剂。

适于注射或输注的药物剂型可包括无菌水溶液或分散液或包含适合于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液，任选囊封于脂质体中的活性成分的无菌粉末。在所有情况下，最终剂型在制造和储存条件下都应是无菌的、流动的和稳定的。液体载体或媒介物可以是溶剂或液体分散介质，其包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒甘油酯及其合适混合物。适当流动性可以，例如，通过形成脂质体、在分散液的情况下通过保持所需粒度或通过使用表面活性剂来保持。防止微生物的作用可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将优选的是包括等渗剂，例如糖、缓冲剂或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来达成。

无菌可注射溶液是通过将活性化合物以所需量在必要时与以上列举的各种其他成分一起并入适当溶剂中，随后进行过滤灭菌来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分外加存在于先前无菌过滤溶液中的任何其他所需成分的粉末。

可注射或可输注药物剂型可包括无菌水溶液或分散液或制备用于临用时配制制剂的包含活性化合物的无菌粉末。液体载体可包括溶剂或液体分散介质，包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇)等。可加入各种物质以抑制或防止抗微生物活性，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。

可作为单剂量或以多剂量间隔施用化合物和组合物。剂量、剂型、施用途径和具体制剂成分可随所需血浆浓度和所涉及的药代动力学而变化。

化合物的适用剂量可通过比较它们的体外活性与在动物模型中的体内活性来确定。用于将小鼠和其他动物中的有效剂量外推到人的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。

为在治疗中使用所需的化合物或其活性盐或衍生物的量将不仅随所选特定盐而变化，而且也随施用途径、所治疗疾患的性质以及患者的年龄和状况而变化，且将最终由主治医师或临床医师裁量。

所需的剂量可以合宜地以单次剂量提供或以在适当的时间间隔下施用的分次剂量，例如每天两次、三次、四次或更多次亚剂量的形式提供。亚剂量本身可再分成例如多个分离的零散间隔施用；例如从吹药器中多次吸入或将多滴滴剂滴入眼中。

化合物还可与其他治疗剂，例如可用于治疗纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的其他药物组合施用。此类治疗剂的实例包括：胰岛素增敏剂(例如二甲双胍)、噻唑烷二酮(例如吡格列酮或罗格列酮)、维生素E、熊去氧胆酸、ω-3脂肪酸、半乳糖凝集素-3抑制剂(例如GR-MD-02)和他汀类。参见N.Chalasani,等人,Hepatology,2012,55,9,2005-2023。因此，在一个实施方案中，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含式I的化合物或其药学上可接受的盐、治疗剂和药学上可接受的稀释剂或载体。本发明还提供了一种药盒，所述药盒包括式I化合物或其药学上可接受的盐、治疗剂、包装材料以及将式I化合物或其药学上可接受的盐和治疗剂施用至动物(例如哺乳动物)来治疗纤维化、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的说明书。在一个实施方案中，治疗剂选自由以下组成的组：胰岛素增敏剂(例如二甲双胍)、噻唑烷二酮(例如吡格列酮和罗格列酮)、维生素E、熊去氧胆酸、ω-3脂肪酸、半乳糖凝集素-3抑制剂(例如GR-MD-02)和他汀类。

在一个实施方案中，治疗剂是GLP-1激动剂。GLP-1激动剂模仿胰高血糖素样肽的作用。通过激活GLP-1受体，GLP-1激动剂和内源GLP-1可降低血糖水平并帮助T2DM患者实现血糖控制。在一个实施方案中，治疗剂选自由以下组成的组：阿比鲁肽(Tanzeum)、度拉糖肽(Trulicity)、艾塞那肽(Byetta)、延长释放艾塞那肽(Bydureon)、利拉鲁肽(Victoza)、利西拉肽(Adlyxin)和索马鲁肽(Ozempic)。在一个实施方案中，治疗剂是利拉鲁肽。

在一个实施方案中，治疗剂是PPAR激动剂。PPAR激动剂作用于过氧化物酶体增殖物激活的受体。在一个实施方案中，治疗剂是泛PPAR激动剂。在一个实施方案中，治疗剂是PPARα/δ激动剂。在一个实施方案中，治疗剂是PPARγ/δ激动剂。在一个实施方案中，治疗剂是PPARα激动剂。在一个实施方案中，治疗剂是PPARδ激动剂。在一个实施方案中，治疗剂是PPARγ激动剂。在一个实施方案中，治疗剂选自由以下组成的组：阿比鲁肽(Tanzeum)、度拉糖肽(Trulicity)、依非兰诺、艾塞那肽(Byetta)、延长释放艾塞那肽(Bydureon)、利拉鲁肽(Victoza)、利西拉肽(Adlyxin)、依非兰诺(GFT505)和索马鲁肽(Ozempic)。在一个实施方案中，治疗剂是依非兰诺或其盐。

本发明现将通过以下非限制性实施例加以说明。

实施例1小鼠纤维化模型

使用了两种动物模型：四氯化碳(CCl

CCl

对于这两种模型，均通过H&E染色以及天狼猩红染色检查组织学标本来确定损伤和纤维化。

结果

Minnelide预防和逆转CCl

如通过梅森氏三色染色和天狼猩红染色观察到的，与媒介物相比，0.2mg/kg的Minnelide抑制CCl

Minnelide抑制CCl

Minnelide抑制DEN+CCl

Minnelide预防和逆转DEN+CCl

Minnelide在两种肝纤维化模型中均显示出有希望的结果。治疗性干预已显示出血浆生物化学标记物以及CCl

式I化合物的抗纤维化活性还可使用其他已知模型来评估，所述模型例如有采用高脂肪、缺胆碱饮食且腹膜内注射二乙基亚硝胺(DEN)的饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝病和肝细胞癌模型或小鼠肝细胞癌伴非酒精性脂肪性肝炎模型。

实施例2饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型

为了研究单独使用Minnelide以及与依非兰诺或利拉鲁肽组合治疗8周在DIO-NASH小鼠模型中的作用，收集代谢参数、肝脏病理学和NAFLD活动性评分(NAS)(包括纤维化分期数据)。

方法

动物

雄性C56BL/6JRj小鼠获自Janvier Labs(Le Genest Saint Isle,France)。小鼠可自由取食自来水和普通啮齿动物食物(Altromin 1324,Brogaarden,Hoersholm,Denmark)，或含高含量脂肪(40％，含18％反式脂肪)、40％碳水化合物(20％果糖)和2％胆固醇的饮食(AMLN饮食；D09100301,Research Diets,New Brunswick,NJ)。在开始治疗前的35周内，给C57BL/6JRj小鼠喂食普通食物作为瘦喂食媒介物对照组，或喂食AMLN饮食作为DIO-NASH小鼠。

基线肝活检

药物治疗实验中包括的所有动物均接受肝活检以获得肝脏参数基线表征结果并分层随机分配成治疗组。使用异氟烷(2％-3％)通过吸入麻醉将小鼠麻醉。在中线做一个小腹部切口，露出肝的左侧叶。从肝叶远端切下一个锥形楔状肝组织(约50mg)，用10％中性缓冲福尔马林(10％NBF)固定以用于组织学。立即使用双极电凝(ERBE VIO 100电手术器械)对肝的切割面进行电凝。将肝放回腹腔，缝合腹壁，并用缝合器缝合皮肤。对于术后恢复，小鼠将在OP日当天以及OP后第1天和第2天皮下注射卡洛芬(5mg/kg)。在开始治疗之前，让动物恢复3至4周。仅纤维化阶段≥1且脂肪变性评分≥2的小鼠被纳入研究，如先前所述(

药物治疗

媒介物是0.5％的羧甲基纤维素(CMC)和0.01％的Tween-80(PO给药)或磷酸盐缓冲液和0.1％的牛血清白蛋白(SC给药)，施用剂量为5mL/kg。将动物分层(每组n＝12-14)，并用以下各项治疗8周：(1)媒介物(0.5％CMC，PO，QD)和媒介物(盐水，SC，QD)；(2)Minnelide(0.1mg/kg，PO，QD)和媒介物(盐水，SC，QD)，(3)Minnelide(0.1mg/kg，PO，QD)和利拉鲁肽(0.4mg/kg，SC，QD)；或(4)Minnelide(0.1mg/kg，PO，QD)和依非兰诺(30mg/kg，PO，QD)。在未禁食的小鼠中从尾静脉收集终末血液样品，并将其用于血浆生物化学。在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺处死动物。如下所述处理肝样品。

生物化学和组织学分析

如先前报道进行生物化学和组织学分析(

结果

媒介物治疗的DIO-NASH小鼠的代谢、生物化学和组织学变化

在研究终止时，经DIO-NASH媒介物治疗的动物表现出肥胖症和肝肿大，同时肝的三酸甘油酯(TG)和总胆固醇(TC)含量的相对水平(mg/g)和总水平增加，且血浆TC和肝酶ALT/AST水平升高(图1)。肝脂肪变性(脂质)和巨噬细胞标记物半乳糖凝集素-3(Gal-3)的相对水平(％)和总水平的升高以组织学方式(图像分析)证实了脂肪性肝炎。此外，肝羟脯氨酸(HP)、胶原1a1(Col1a1)和α-SMA(α-SMA)的相对水平和总水平升高证实了纤维化表型。对于组织学评分，在12只经媒介物治疗的DIO-NASH动物中有9只表现出持续或增加的复合NAFLD活动性评分(NAS)(治疗前到治疗后)，范围为5-7分；在12只动物中有3只表现出自基线的消退，这是由于小叶炎症评分降低所致。最后，在12只经媒介物治疗的DIO-NASH动物中有11只表现出持续的纤维化分期(治疗前到治疗后)，均为F2-F3；在12只动物中有1只表现出自基线的消退。合起来看，观察到的代谢、生物化学和组织学表型与先前放入DIO-NASH小鼠模型发现结果一致。

Minnelide降低DIO-NASH小鼠的肝中的半乳糖凝集素-3水平

半乳糖凝集素-3是脂肪肝病和纤维化发病机制中的关键蛋白质。在临床前和早期临床研究中，抑制半乳糖凝集素-3在防止饮食诱导的NASH方面显示出了有希望的功效。以半乳糖凝集素-3阳性染色面积占总组织面积的百分比的分数估计肝半乳糖凝集素-3(图2A至图2B)。与经媒介物治疗的对照DIO-NASH小鼠相比，Minnelide治疗组表现出18.41％的肝半乳糖凝集素-3降低(面积分数％)(图1和图2C至图2D)。

Minnelide和依非兰诺组合疗法

在与经媒介物治疗的DIO-NASH动物进行比较时，用Minnelide和依非兰诺组合疗法治疗8周可将体重自基线降低大约12％，同时减轻肝肿大。此外，Minnelide和依非兰诺治疗降低血浆ALT/AST/TC/TG水平，并降低肝TG/TC含量的相对水平和总水平(图1)。此外，Minnelide和依非兰诺治疗降低肝脂质和Gal-3的相对水平和总水平。对于纤维化，Minnelide和依非兰诺治疗降低肝羟脯氨酸(HP)含量的相对水平和总水平，降低肝Col1a1的相对水平以及α-SMA的相对水平和总水平。对于组织学评分，所有经Minnelide和依非兰诺治疗的动物的复合NAS(治疗前到治疗后)均降低，主要是由于脂肪变性和小叶炎症评分降低所致。此外，与

Minnelide和利拉鲁肽组合疗法

在与经媒介物治疗的DIO-NASH动物进行比较时，用Minnelide和利拉鲁肽组合疗法治疗8周可将体重自基线降低大约13％，同时减轻肝肿大。此外，Minnelide和利拉鲁肽治疗降低血浆ALT/AST/TC水平，并降低肝TG/TC含量的相对水平和总水平(图1)。此外，Minnelide和利拉鲁肽治疗降低肝脂质和Gal-3的相对水平和总水平。对于纤维化，Minnelide和利拉鲁肽治疗降低肝HP含量的相对水平和总水平，降低肝Col1a1的总水平以及α-SMA的相对水平和总水平。对于组织学评分，在13只经Minnelide和利拉鲁肽治疗的动物中有10只的复合NAS(治疗前到治疗后)降低，主要是由于小叶炎症和肝细胞气球样变评分降低所致。此外，与

实施例3代表性的式I化合物的制备

Minnelide

14-O-膦酰氧甲基雷公藤内酯二钠盐的合成.

向14-O-膦酰氧甲基雷公藤内酯二苄基酯(50mg，0.08mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液中加入碳载钯(10％，10mg)。将混合物在氢气(1atm)下在室温下搅拌3小时的时间。通过CELITE

中间体14-O-膦酰氧甲基雷公藤内酯二苄基酯可如下制备。

a.制备雷公藤内酯(100mg，0.29mmol)的乙酸(5mL，87.5mmol)和乙酸酐(1mL，10.5mmol)的DMSO(1.5mL，21.4mmol)溶液并在室温下搅拌5天的时间，产生14-O-甲硫基甲基雷公藤内酯中间体。接着将反应混合物倒入水(100mL)中，并用固体NaHCO

b.在N

实施例4Minnelide

Minnelide

14-O-膦酰氧甲基雷公藤内酯二钠盐的合成.

在0℃下，向于THF(10mL)中的含14-O-甲硫基甲基雷公藤内酯(50mg，0.12mmol)、磷酸(82mg，0.84mmol)和分子筛(

中间体14-O-甲硫基甲基雷公藤内酯可如下制备。

a.在0℃下，在20min内向雷公藤内酯(100mg，0.28mmol)和甲硫醚(0.16mL，2.24mmol)在乙腈(10mL)中的溶液中分四等份加入过氧化苯甲酰(0.27g，1.12mmol)，接着将混合物在0℃下搅拌1h，然后在室温下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释，并先后用10％Na

Minnelide

14-O-膦酰氧乙基雷公藤内酯二钠盐的合成.

在0℃下，向于THF(10mL)中的含14-O-甲硫基乙基雷公藤内酯(52mg，0.12mmol)、磷酸(82mg，0.84mmol)和分子筛(

中间体14-O-甲硫基乙基雷公藤内酯可如下制备。

a.在0℃下，在20min内向雷公藤内酯(100mg，0.28mmol)和乙硫醚(0.24mL，2.24mmol)在乙腈(10mL)中的溶液中分四等份加入过氧化苯甲酰(0.27g，1.12mmol)，接着将混合物在0℃下搅拌1h，然后在室温下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释，并先后用10％Na

Minnelide

14-O-膦酰氧丙基雷公藤内酯二钠盐的合成.

在0℃下，向于THF(10mL)中的含14-O-甲硫基丙基雷公藤内酯(54mg，0.12mmol)、磷酸(82mg，0.84mmol)和分子筛(

中间体14-O-甲硫基丙基雷公藤内酯可如下制备。

a.在0℃下，在20min内向雷公藤内酯(100mg，0.28mmol)和丙硫醚(0.32mL，2.24mmol)在乙腈(10mL)中的溶液中分四等份加入过氧化苯甲酰(0.27g，1.12mmol)，并将混合物在0℃下搅拌1h，接着在室温下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释，并先后用10％Na

所有出版物、专利和专利文件均以引用方式并入，如同以引用方式单独地并入一般。本发明已参考各种具体和优选实施方案和技术加以描述。然而，应当理解可在保持处于本发明的精神和范围内的同时作出许多变化和修改。