一种评估培养基或消毒剂的菌种源、制备方法和使用方法

摘要

本发明涉及一种评估培养基或消毒剂的菌种源、制备方法和使用方法。评估培养基的菌种源的制备方法，具体步骤为：对微孔滤膜进行灭菌处理；将保藏的菌株在培养基上传代复苏；将复苏后的菌株使用菌体冻干保存成分所配制的保存液进行稀释，得到菌液；将菌液加载到微孔滤膜上，然后将得到的微孔滤膜进行冻干，得到菌种。使实验室可直接购买产品即用，不必再进行相应菌株的保藏管理工作，从而解放相应的检验人员和资源。

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种评估培养基或消毒剂的菌种源、制备方法和使用方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

微生物培养，特别是细菌培养，是微生物检测方法中最重要的方法之一。因可以获得特定的目标菌，特异性好，使用适宜的培养基和培养条件，敏感性也好，培养法一般作为金标准使用。且获得的目标菌后期可进行耐药试验、分型试验，基因组分析、蛋白组和代谢组分析，毒力分析及功能活性分析等，具有好的后续延展性。所以培养法对于微生物检测具有基础性和决定性的作用。

培养法中最为关键的步骤是固体培养法，即在固体培养基表面使检样中的混合微生物经划线分离培养获得单个菌落纯培养物。固体培养法因其操作简单、成本低廉、分离效果优良，自19世纪末期，由德国微生物学家科赫发明以来，一直被微生物检测者作为培养法的核心步骤和基础部分来应用，并且到目前为止无可替代之法。而培养基的成份相对复杂，不同厂家，同一厂家不同批次的培养基因原料来源、生产工艺等问题的存在会存在一定的质量风险。但微生物检测结果的可靠性和准确性标准要求培养基必须稳定和可靠，因此目前行业公认必须对每一批次的培养基进行评估。

目前培养基评估比较通用的方法为ISO和GB4789.28等标准方法，尽管标准不同，但其基本的方法内容基本相同，对于固体培养基主要是定量法、半定量法和定性法。不管哪一种方法，都需要将保藏的相关标准菌株复苏培养，再进行相关划线和涂布操作等，对于从事检验的人员，过程相对复杂；而且进一步相关标准菌株的保藏、管理，需要专用菌株保存冰箱，房间等设备，需要专门的人员管理和评估等，且需进行繁杂的生物安全管理和记录，耗费了大量的人力物力财力。

与上述原理类似的是，对于消毒剂的评估，按照消毒技术规范或GB/T 38502-2020消毒剂实验室杀菌效果检验方法,也需要每次提前菌株复苏，然后制作滴染载体，常温或热干燥，然后用消毒剂处理，处理后进行相关培养，过程复杂。因此处理方法菌株保存时间很短，需每次实验前现制备，耗费人力物力财力。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种评估培养基或消毒剂的菌种源、制备方法和使用方法。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种评估培养基或消毒剂的菌种源的制备方法，具体步骤为：

对微孔滤膜进行灭菌处理；

将保藏的菌株在培养基上传代复苏；

将复苏后的菌株使用菌体冻干保存成分所配制的保存液进行稀释，得到菌液；

将菌液加载到微孔滤膜上，然后将得到的微孔滤膜进行冻干，得到菌种。

解决的问题：

1、定量和半定量的问题，即得到的菌种可以直接让待评估培养基进行计数，现有的标准菌株保存使用冻干粉或冻干微球等方式，均无法直接计数。本发明使用微孔滤膜作为载体，因此每个菌体在膜上可均匀分布，从而培养后形成单菌落，可以实现计数功能。

2、菌体的位置固定和营养支持问题，选用微孔滤膜作为载体后，存在菌体在膜上的位置变化，因培养后，菌可能存在向膜的上下两侧生长，最终影响计数的问题，且膜有一定厚度，存在阻隔培养基营养物质与菌体接触的问题，为了解决这个问题，通过多种膜型材料的试验，最终结果表明微孔滤膜可以同时解决上述问题，合适的孔径既可以阻隔较大的菌体向膜的下方生长，且不影响小的营养物质的向上渗透。

3、菌体加载到膜上的均匀性问题，和边缘问题，良好的计数需要菌的均匀分布，且边缘位置不能有菌，菌在膜的边缘会形成扩散生长，无法计数，为了解决上述问题，本发明探索了涂抹、喷洒、多点加样、过滤等方法，前三种方法可达到一定均匀性，但在局部易造成菌体聚集情况，且会存在边缘效应的问题，特别时喷洒法时，应用过滤法，本发明通过特定过滤器，可以将滤膜边缘掩盖，从而使菌液接触不到边缘，同时过滤使较大量的液体种的均匀菌落随机通过滤膜，可形成随机性分布，均匀性较好。

冻干后的得到的产品即为用于评估培养基或消毒剂的菌种，包括微孔滤膜和其上的菌株。

在本发明的一些实施方式中，微孔滤膜，材质为混合纤维素、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚醚砜和尼龙，优选混合纤维素；

或，微孔滤膜的直径3cm-9cm，微孔孔径0.1um-1.0um。

在本发明的一些实施方式中，保藏的菌株为可溯源的菌种保藏机构来源的标准菌株传代而来的菌体，或者经过实验室验证的稳定具备其所属菌种代表性特征的菌株传代而来的菌体。

在本发明的一些实施方式中，培菌体冻干保存成分为甘油、蛋白类或糖醇类或氨基酸或上述几种物质的复配。

冻干保存成分的选择，解决了菌体保护问题，为了保存菌体，本发明使用了冻干法，但冻干法容易将菌体冻伤，不利于后续回收，且本公开使用的滤膜，比表面积较大，从而菌体接触的环境体积比较大，不利的温度和湿度等环境影响更大，为了尽可能的保持菌体活性，本发明试验了多种保护剂，最终选取了合适的保护剂。

在本发明的一些实施方式中，蛋白类包括人血清白蛋白、胎牛血清、脱脂奶粉、全脂奶粉、卵清蛋白或酪蛋白的一种或几种。

在本发明的一些实施方式中，糖醇类包括海藻糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖山梨醇、甜菜碱和阿东糖的一种或几种。

在本发明的一些实施方式中，菌株复苏的过程中，菌株在培养基上传代复苏1-3次。

或，复苏过程中培养基为固体培养基或液体培养基。

在本发明的一些实施方式中，复苏的菌株通过菌体冻干保存成分稀释后的浓度不高于10

在本发明的一些实施方式中，菌体加载到微孔滤膜上的方法为：将菌液经过过滤、涂布、喷洒或多点加样的方法；优选为过滤法。过滤法相比于其它方法，具有使菌落的分布更均匀的优点。

在本发明的一些实施方式中，冻干的方法为，将载有菌液的微孔滤膜在-15～-25℃的条件下进行冷冻干燥。

第二方面，上述制备方法得到的评估培养基或消毒剂用的菌种源。

优选的，还包括支撑材料，支撑材料包裹冻干后的菌种，支撑材料包括无菌保护材料和无菌包材。

支撑材料包裹菌种，解决了滤膜支持问题，为了不影响营养吸收，滤膜比较薄，但薄的滤膜在制备运输等过程种易弯折，弯折后易导致表面不平整，影响与培养基表面贴合，从而使局部菌体无法生长，为了避免这种情况，本发明使用了支撑材料进行辅助。

第三方面，上述菌种源在固体培养基的评估或消毒剂评估方面的应用。

第四方面，利用上述菌种源进行固体培养基的评估的方法，具体步骤为：

将微孔滤膜贴放于拟评估培养基上，进行培养；

然后进行计数菌数和菌落形态特征，与微孔滤膜原始标定量或平行富营养培养基培养计数比对。

第五方面，利用上述菌种源进行消毒剂的评估的方法，具体步骤为：

用消毒剂处理微孔滤膜；

将微孔滤膜贴放于拟评估培养基上，进行培养；

然后进行计数菌数和菌落形态特征，与微孔滤膜原始标定量或平行富营养培养基培养计数比对。

在本发明的一些实施方式中，将菌种(微孔滤膜冻干后的物质)冻干后即置于富培养基上，培养后，计数菌量，作为菌数的原始标定量。

置于富培养基上的作为标定量，解决了参考菌量的问题，因不同菌种对冻存保藏的耐受性不同，有的菌种在冻存保藏过程中菌量变化较小，此类菌种使用原始菌量作为参考，但有部分菌种在冻存保藏过程中菌量变化较大，此类菌种采用了在实测过程中用相应富营养培养基实时的方式来定量菌量，作为参考菌量，以校正损失问题。

本发明一个或多个技术方案具有以下有益效果：

菌种为微孔滤膜和其上的菌株，所述菌种作为一种一次性即用型产品，从而使实验室可直接购买产品即用，不必再进行相应菌株的保藏管理工作，从而解放相应的检验人员和资源，将复杂的菌株保藏管理工作向上移交给生产厂家，生产厂家通过批量化生产，规模化管理，取代大量的实验室重复性的保藏管理工作，节约总体社会成本。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1的产品保存6个月的图像；

图2为实施例1的产品保存24个月的图像。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下面结合实施例对本发明进一步说明

实施例1

a)灭菌微孔滤膜，应用环氧乙烷或辐照方式灭菌；

b)菌株复苏，将保藏的菌株大肠杆菌ATCC25922或金黄色葡萄球菌ATCC6538置于液体营养培养基中或固体培养基上，传代复苏2次；

c)菌液制备，将复苏后的菌株，使用所述菌体冻干保存成份所配制的保存液稀释到2*10

冻干保存成分为甘油和谷氨酸钠、蔗糖。

d)菌体加载滤膜，将菌液通过过滤的方式加载到微孔滤膜上；所述的菌体加载滤膜步骤中过滤方式为将特定量的菌液通过赛多利斯过滤器，负压抽滤的方式将液体过滤，从而使菌体均匀分布于滤膜上，且避免分布于滤膜边缘；过滤后滴加一定量的所述菌体冻干保存成份所配制的保存液。

e)冻干，将载有菌液的滤膜，置于无菌容器中，-20℃下冷冻4h，放入冷冻干燥机72h。

冻干后的菌种和无菌保护材料共同置于无菌包材中密封，得到一种可以一次性即用型产品。

实施例2

a)灭菌微孔滤膜，应用环氧乙烷或辐照方式灭菌；

b)菌株复苏，将保藏的菌株白色念珠菌ATCC10231或鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028置于液体营养培养基中或固体培养基上，传代复苏3次；

c)菌液制备，将复苏后的菌株，使用所述菌体冻干保存成份所配制的保存液稀释到3*10

冻干保存成分为海藻糖和脱脂奶粉。

d)菌体加载滤膜，将菌液通过过滤的方式加载到微孔滤膜上；所述的菌体加载滤膜步骤中过滤方式为将特定量的菌液通过环凯过滤器，负压抽滤的方式将液体过滤，从而使菌体均匀分布于滤膜上，且避免分布于滤膜边缘；过滤后滴加一定量的所述菌体冻干保存成份所配制的保存液。

e)冻干，将载有菌液的滤膜，置于无菌容器中，-20℃下冷冻3h，放入冷冻干燥机48h。

冻干后的菌种和无菌保护材料共同置于无菌包材中密封，得到一种可以一次性即用型产品。

实施例1和实施例2得到的冻干后的菌种，即包括微孔滤膜和其上的菌株的产品，进行环境适应能力测试，测试的保存条件分别为-20℃，然后计数菌株的数量和菌落形态，得到，在-20℃温度下，其相比于现有保藏的专门非滤膜型标准菌株，具有相似的环境适应能力，可以作为评估培养基的菌种源。

实施例1的产品，保存6个月和24个月后分别如图1和2所示，可以看到，保存时间较长，微孔滤膜表面的菌株变化不大。

对比例1

与实施例1相比，冻干保存成分为甘露醇和人血清白蛋白、蔗糖。其它操作方法与实施例1相同。

得到的冻干后的微孔滤膜。相比于实施例1，菌体的活性较差，具体表现为(经过变温的条件下菌体的成活率降低)。作为一种产品可以直接应用，如果菌体的活性较差，会影响拟评估培养基的正确评估，或者评估的准确性较差。

实施例3

将实施例1得到的冻干后的微孔滤膜，微孔滤膜上均匀负载菌株。置于富培养基上进行培养，培养后，计数菌量，作为菌数的原始标定量。

实施例4

实施例1得到的冻干后的微孔滤膜，微孔滤膜上均匀负载菌株。将这个微孔滤膜贴放于拟评估培养基上，进行培养；

培养后，进行计数菌数和菌落形态特征的观察，得到拟评估培养基的菌数，与微孔滤膜原始标定量或平行富营养培养基培养计数比对。然后按照标准进行拟评估培养基的评价。

所述标准为GB 4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求或ISO11133-2014食品，动物饲料和水的微生物学，培养基的制备，生产，储存和性能试验或中国药典。

实施例5

用消毒剂处理微孔滤膜；

将微孔滤膜贴放于拟评估培养基上，进行培养；

然后进行计数菌数和菌落形态特征，与微孔滤膜原始标定量或平行富营养培养基培养计数比对。

得到菌数，然后按照标准进行评估。

所述标准为GB 4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求或ISO11133-2014食品,动物饲料和水的微生物学，培养基的制备，生产，储存和性能试验或中国药典。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。