一种体外培养小鼠次级卵泡的方法

摘要

本发明涉及卵泡体外培养技术领域，尤其涉及一种体外培养小鼠次级卵泡的方法。本发明采用纯机械法分离次级卵泡，减少酶解对卵泡结构完整、卵子发育潜能的影响；采用V型底96孔板培养代替凝胶系统的立体支撑功能，明显缩减系统流程，减少低温、酶解损伤，避免凝胶性质改变导致的营养支持不足、卵泡体积扩大受限问题。在常规生长培养基中添加神经营养因子4，弥补体外培养系统较体内发育卵泡的不足，改善卵泡发育潜能及卵子质量，提高次级卵泡体外培养系统效率。

说明书

技术领域

本发明涉及卵泡体外培养技术领域，尤其涉及一种体外培养小鼠次级卵泡的方法。

背景技术

小鼠次级卵泡体外培养技术是从小鼠卵巢中分离出次级卵泡，并在体外培养至成熟的过程，是研究小鼠卵泡发育过程发生的生理或病理事件的重要工具，近年来也应用于肿瘤患者生育力保存(卵泡体外培养)系统构建的前期动物实验模型。评估该系统效率的指标主要是卵泡的存活率和卵子的体外成熟率。目前文献报道的小鼠次级卵泡体外培养步骤如下：(1)酶解法处理小鼠卵巢，在解剖培养基中分离出次级卵泡；(2)将次级卵泡清洗2次后转移至维持培养基，培养30分钟至1小时；(3)将次级卵泡清洗2次后移至凝胶液滴，滴入氯化钙液体中进行耦联；(4)将包裹在凝胶的次级卵泡转移至生长培养基清洗2次，再转移至96孔培养板(装生长培养基)中培养10天，每2天更换一次生长培养基；(5)在培养第10天时，将包裹在凝胶中的卵泡转移至凝胶消化酶中消化，分离出卵泡，清洗2次后再转移至成熟培养基中行体外成熟，16小时后在透明质酸酶中消化2分钟，脱去颗粒细胞后观察卵子排出第一极体的情况。

上述现有技术存在的缺点：(1)整个过程需要3次酶解过程，对卵泡的完整性及卵子的质量存在负面影响；(2)凝胶培养系统过程繁复，明显增加卵泡在合适的培养环境(37℃二氧化碳培养箱)外的时间，低温对卵泡的发育可造成影响；(3)反复转移卵泡近20次，易对卵泡的结构造成损害，且易在转移过程中丢失卵泡，降低培养系统效率；(4)随着体外培养时间延长，凝胶的通透性改变，培养基中的营养物质渗透率下降，影响卵泡的发育；凝胶的硬度也发生改变，限制生长后期卵泡直径的扩大和窦腔的形成；(5)现有的常规生长培养基只添加FSH、LH来模拟垂体分泌激素促进卵巢中卵泡生长的生理情况，弥补体外卵泡发育环境的不足，但实际上垂体对卵巢生理功能的支持作用远不止这两种激素，体外培养体系的模拟效率仍不足。已有的文献报道，卵泡存活率波动在68～84％，成熟率波动在26～50％，远低于体内发育卵泡的存活率和成熟率，且不稳定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种体外培养小鼠次级卵泡的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种体外培养小鼠卵泡的方法，所述方法为采用纯机械法分离小鼠卵泡。

本发明采用纯机械法代替酶解法分离次级卵泡，可减少酶解对卵泡结构完整、卵子发育潜能的影响。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述卵泡为次级卵泡。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述纯机械法分离小鼠次级卵泡具体包括以下步骤：

(1)剪下小鼠卵巢及周围少许组织，置于解剖培养基中；

(2)次级卵泡分离：在解剖显微镜下，用胰岛素注射器针头将卵巢组织分离出来，置于预热的解剖培养基中，在解剖培养基中用胰岛素针头剥离次级卵泡，挑选基底膜完整、卵子形态正常、直径大约100-130μm的卵泡；

(3)将次级卵泡置于生长培养基中培养。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述生长培养基中添加神经营养因子4。

本发明通过在生长培养基中添加有利因素进一步模拟垂体对卵巢的神经内分泌功能，提高卵泡体外培养系统效率。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述生长培养基组成为：30mlαMEM基础培养基、30mg胎球蛋白、30μl ITS、90mg牛血清白蛋白、300mIU重组人FSH和30μl神经营养因子4。

作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(3)中所述培养为采用V型底96孔板培养。

本发明寻找到可代替凝胶系统立体支撑功能的培养方法，缩减系统流程，减少低温、酶解损伤，避免凝胶性质改变导致的营养支持不足、卵泡体积扩大受限问题。

作为本发明所述方法的优选实施方式，所述采用V型底96孔板培养具体为：将分离的次级卵泡转移至预平衡的生长培养基液滴中，在生长培养基液滴中清洗1-2次后，将每个卵泡单独转移至V型底的96孔板中培养，96孔板每孔加100μl预热的生长培养基，将96孔板置于二氧化碳温箱中，每两天换一半新的生长培养基进行培养。

本发明的有益效果：

(1)采用纯机械法分离次级卵泡，减少酶解对卵泡结构完整、卵子发育潜能的影响；

(2)采用V型底96孔板培养代替凝胶系统的立体支撑功能，明显缩减系统流程，减少低温、酶解损伤，避免凝胶性质改变导致的营养支持不足、卵泡体积扩大受限问题。

(3)在常规生长培养基中添加神经营养因子4，弥补体外培养系统较体内发育卵泡的不足，改善卵泡发育潜能及卵子质量，提高次级卵泡体外培养系统效率。

附图说明

图1：体外培养卵泡形态(A、B、C、D、E分别为体外培养D1、D3、D5、D7、D9卵泡)。

图2：卵泡直径变化曲线图。

图3：培养液雌激素浓度变化曲线图。

图4：培养液孕激素浓度变化曲线图。

图5：体外成熟卵泡形态(A、B分别为卵丘细胞-卵母细胞复合物、成熟卵母细胞)。

具体实施方式

为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。

实施例1试剂配备

解剖培养基(DM)：30ml L15基础培养基(保存于4℃)、150μl链霉素(保存于4℃)、300μl胎牛血清(保存在-20℃，融解后在4℃中可保存2周)。

生长培养基(GM)：30mlαMEM基础培养基(若商品中没有谷氨酰胺，加入300微升L-谷氨酸)、30mg胎球蛋白(保存于4℃)、30μl ITS(商品储存于-20℃，融解后在4℃中可保存2周)、90mg牛血清白蛋白(保存于4℃)、300mIU重组人FSH、30μl神经营养因子4(储存液浓度100μg/ml；工作液浓度100ng/ml)，摇床3-5分钟；离心机3-5分钟(1500RPM)；无菌滤过。

成熟培养基(MM)：9mlαMEM基础培养基(若商品中没有谷氨酰胺，加入300微升L-谷氨酸)、30mg胎球蛋白(保存于4℃)、1ml胎牛血清、1μlEGF(储存液浓度50ng/μl；工作液浓度5ng/ml)、15μlhCG(储存液浓度1IU/μl；工作液浓度1.5IU/ml)、10mIU/ml重组人FSH，摇床3-5分钟；离心机3-5分钟(1500RPM)；无菌滤过(滤过后再加入EGF、hCG、FSH)。

实施例2实验前的准备

(1)设备

解剖显微镜1台(含可控温加热板)、倒置显微镜1台、超净台1台、二氧化碳培养箱1台、适当量程移液枪(1ml、200μl、10μl、2μl量程各1支)。

(2)耗材

IVF培养皿20个、1ml胰岛素注射器2个、V型底96孔板2个(视取材数目相应增减)、无菌器械包(小组织剪1把、无齿镊子1把、脱脂棉球10个、每只小鼠1个1.5mlEP管)、装冰的冰盒。

(3)试剂

1)取材当天

75％酒精、用于转运的DM(4ml，4℃)、用于解剖的DM(预热，37℃水浴箱至少15分钟)，GM(预平衡，提前在二氧化碳培养箱中平衡至少30分钟)。

2)换液

GM(预平衡，提前在二氧化碳培养箱中平衡至少30分钟)。

3)体外成熟

MM(预平衡，提前在二氧化碳培养箱中平衡至少30分钟)、IVF用无菌矿物油、透明质酸酶、PBS。

实施例3具体操作方法

(1)卵巢取材

携带无菌器械包、75％酒精、装冰的冰盒、用于转运的DM前往取材地点。选用12-14天鼠龄的小鼠，予1％戊巴比妥腹腔注射(50mg/kg)后颈椎脱臼处死，用75％酒精棉球进行腹部皮肤消毒3次，用无菌镊子提起腹部皮肤，用无菌组织剪沿腹部横向剪开皮肤及皮下筋膜到达腹腔，注意剪开时勿触及肠管等腹腔内器官。用无齿镊子拨开肠管找到Y型子宫，沿着子宫、输卵管找到两侧卵巢，剪下卵巢及周围少许组织，置于装4℃DM的EP管中，用装冰的冰盒转运至实验室。

(2)次级卵泡分离及培养

在解剖显微镜下(全程设置可控温热板至37℃)，用胰岛素注射器针头将卵巢组织分离出来，置于预热的DM中，在DM中用胰岛素针头剥离次级卵泡，挑选基底膜完整、卵子形态正常、直径大约100-130μm的卵泡，用10μl移液枪转移至预平衡的GM液滴中，在GM液滴中清洗1-2次后将每个卵泡单独转移至V型底的96孔板中(每孔加100μl预热的GM)培养，在转移卵泡过程中尽量减少前一步骤液体的残留，将96孔板置于二氧化碳温箱中(5％二氧化碳，37℃)。每两天换一半新的GM培养基，在吸取培养基时应在解剖显微镜下(全程设置可控温热板至37℃)操作，避免将卵泡吸出，每次换液后测量卵泡直径并计算平均值(以上所有液体及液滴均置于IVF培养皿中，液滴体积均约20μl)。

(3)卵母细胞体外成熟

体外培养10天后窦卵泡形成，在解剖显微镜下(全程设置可控温热板至37℃)用200μl移液枪将窦卵泡从96孔板中移出，在MM液滴中清洗1-2次后，用2μl移液枪吸取窦卵泡中的卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合物(COC)置于MM液滴中(每个小皿制作体积20μl液滴6个)培养，每个液滴可放置约6个COC。约16小时后用2μl移液枪将COC转移至200μl的透明质酸酶液滴中，放置2min后用200μl移液枪反复吹打液滴，勿按压至量程尽头，避免产生气泡。在解剖显微镜下观察到颗粒细胞已完全脱离后，用2μl移液枪将卵子转移至PBS液滴中，清洗2次后置于干净的PBS液滴中，将IVF小皿置于倒置显微镜下观察第一极体排出情况，并记录(以上所有液体及液滴均置于IVF培养皿中，液滴体积均约20μl，特殊说明除外)。

操作要求：

(1)卵泡分离及转移控制在30-40分钟内(两侧卵巢)；

(2)测量卵泡直径时，每个96孔板控制在10分钟内，每次拿出培养箱不超过10分钟；

(3)卵泡转移过程，丢失率应小于5％。

实施例4次级卵泡生长与卵子体外成熟

(1)次级卵泡生长

成功用机械分离法从12～14d小鼠卵巢中分离出次级卵泡，挑选出形态正常、基底膜完整、直径在100～130μm之间的卵泡，在进行体外培养10天。体外培养过程中存活卵泡维持形态正常，卵泡直径不断增长(图1)，到第9天卵泡直径增长为470.24±271.24μm(表1、图2)，存活率为97.6％(文献报道的其他培养系统卵泡存活率为80％～85％)，卵泡培养液中卵泡分泌的功能产物——雌激素与孕激素的浓度也随之增加(图3、4)。其中，存活率＝存活卵泡数/培养卵泡数，存活卵泡定义为形态正常，直径持续扩大，持续成长的卵泡。

表1小鼠卵泡体外培养直径变化

(2)卵子体外成熟

将体外培养直径大于250μm的卵泡进行体外成熟，16h后脱颗粒细胞观察，体外培养卵泡成熟率为86.5％(图5)。文献报道的其他培养系统卵子成熟率为50％～70％。其中，成熟率＝成熟卵子数/行体外成熟卵子数，成熟卵子定义为排出第一极体的卵子。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。