从奶、初乳和酸乳清或甜乳清中制备高纯度乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法

摘要

一种从一来源物质中制备包含乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的馏分的方法所述来源物质含有这些蛋白中至少一种，其中该来源选物质自下组：奶、初乳、酸乳清或甜乳清，通过具有阳离子交换特性的整体柱的色谱分离工艺，其中在分离工艺中，在将来源物质上样到该柱后采用pH梯度或pH和盐梯度联合洗脱。进一步公开的是一种物质组合，其包括C值＞60％、A值＞1％的乳铁蛋白或乳过氧化物酶。

说明书

本发明涉及一种从含有这些蛋白质中至少一种的来源物质制备包含乳铁蛋白或乳过氧化物酶的馏分的方法，以及高纯度的乳铁蛋白或乳过氧化物酶蛋白质。

背景技术

乳铁蛋白(LF)和乳过氧化物酶(LPO)是存在于奶、乳清和初乳中的功能性小蛋白。LF是一种80kDa的糖基化蛋白，可以对各种生理和环境变化作出反应，因此被认为是宿主第一道防线的关键成分。除了所有转铁蛋白共有的Fe

LF能够与铁结合。天然LF包括15-20％的含铁(Holo)LF，其中含有铁。剩下的部分是不含铁(apo)LF，它不含铁[32]。从理论上讲，apoLF的铁饱和度相当低(已经结合的铁-A值)。apoLF的理论A值约为<3％。此外，apoLF拥有较高的铁结合潜力(铁容量-C值)。apoLF的C值约为>50％。高纯度和非变性的apoLF有可能具有更高的C值，＞70％。另一方面，holoLF拥有高A值(>50％)和低C值(<10％)。分离的LF的C值越高，LF的铁结合潜力就越高。较高的铁结合潜力会导致较高的抗菌活性，因为活性LF会去除微生物生长所需的基本铁。

目前，LF和LPO是通过许多不同的技术从奶和奶加工副产品(如乳清)中分离出来的，例如：(I)用带有肝素配体的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)顺磁颗粒分离[3]，(II)通过使用阳离子表面活性剂(例如，十六烷基二甲基溴化铵)[4]，(III)不同的色谱技术(例如，阳离子交换或亲和色谱)[1,2,5-10]以及(IV)其他技术(例如，疏水离子液体[11])。一般来说，色谱技术，最重要的是离子交换色谱，代表了一种如何以相对较低的成本快速分离LF的方法[12]。色谱方法也因其稳健性和可重复性而优于其他方法。在LF和LPO的色谱纯化中最常见的技术是使用强阳离子交换树脂颗粒和膜或整体柱[13-15]。

目前的色谱法存在着一些缺点。(I)由于孔隙中的扩散传质，随着流速的增加，色谱峰会变宽，所以当流速增加时，为了获得相同的分辨率，梯度斜率必须变浅；(II)流量增加会减少色谱步骤的时间，但同时会增加洗脱量；(III)柱子长度会导致高柱压降，这是流速的一个限制因素。

在色谱纯化步骤中，奶或乳清中的LF和LPO在一定条件下与强阳离子交换剂的表面结合，然后用高pH值或高盐浓度的缓冲液收集洗脱部分。为了简化分离过程，LF和LPO最常使用几种高离子强度或pH>9的缓冲溶液的阶梯(step)模式进行洗脱。这种方法通常会在一个色谱步骤中产生相对较高纯度(60-95％)的所需蛋白质馏分。为了去盐、浓缩和提高纯度，通常会引入超滤过程，以消除少量低分子量的杂质。获得的浓缩蛋白通常通过冻干或喷雾干燥进行干燥。Wang等人[18]表明，冻干的LF比喷雾干燥的(≈5％)含有更少的水(约2-3％)，相反，喷雾干燥的LF显示出稍低的变性程度和高出6-7％抗氧化活性，这与新鲜液体LF接近。喷雾干燥[1]无疑可用于生产具有完整分子构型和高抗氧化能力的无定形LF粉末。

EP0418704A1[19]描述了使用离子交换色谱柱分离、纯化和回收能够结合铁的奶蛋白的过程，该色谱柱含有表面有磺酸基的树脂颗粒。LF是通过pH/电导率阶梯洗脱模式分离的，据称最终产品的纯度大于90％。同时，需要一个超滤过程来消除少量的低分子量杂质，最终使LPO和LF的纯度达到90％或更高。

在EP1466923A1[20]中描述的工艺包括用强酸阳离子交换树脂(颗粒)的色谱步骤，其中分离的LF的纯度在79％至91％之间。

WO2006/119644A1[21]描述了一种纯化LF的方法，使其在溶液中稳定并提高其活性。该方法旨在对已经分离的低纯度LF进行进一步的纯化。纯化是在含有一定浓度的带电排斥溶质的酸性水溶液中使用疏水吸附剂(颗粒)进行的。获得的LF最终纯度＞95％。

US5,861,491A[13]公开了分离人类LF的方法，包括通过表达编码重组人类LF(rhLF)的转基因产生的人类LF，以及从奶(通常来自牛乳)中分离其他相关的LF物种。一般来说，奶或含有hLF的奶馏分在相对较高的离子强度下与强阳离子交换树脂接触，以防止非LF蛋白和其他物质与强阳离子交换树脂结合。之后通过离心将树脂颗粒从奶中分离出来，然后使用具有不同盐浓度的少量缓冲溶液以阶梯模式洗脱与阳离子交换树脂结合的LF。HLF和bLF顶级馏分的纯度超过约95％。

EP0348508B1[22]公开了使用磺化交联的多糖树脂(颗粒)从生乳中分离LF的方法。

吸附在柱子上的LF用NaCl浓度增加的缓冲液以阶梯模式洗脱。经测量，牛LF的纯度为95％，而从脱脂的人初乳中获得的LF纯度为98％。

US6,096,870A[23]中描述的方法与乳清蛋白(免疫球蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白、LF)的分离有关，特别是使用带有强阳离子交换树脂颗粒的预填充色谱柱将乳清蛋白顺序分离成独立的馏分。所提到的蛋白质组分的顺序洗脱是用适当的pH值和离子强度的缓冲剂以逐步的模式实现的。最终喷雾干燥产品的纯度为：免疫球蛋白≧80％，BSA和LF≧75％，β-乳球蛋白≧85％。

US8,603,560B2[24]描述了使用填充在色谱柱中的阳离子交换树脂从奶或乳清中分离奶蛋白质的方法。通过逐步改变pH值或离子强度来促进洗脱。最终LF纯度为80％。

CA2128111C[25]描述了在工业规模上从奶和奶产品中分离LF和LPO的方法。通过将所述蛋白质吸附在阳离子交换器上，用一种或多种盐溶液阶梯洗脱，分别或同时洗脱这些蛋白质，从而实现分离。目前还没有关于分离的蛋白质最终纯度的数据。

EP0253395B9[26]公开了一种使用弱酸性阳离子交换树脂从奶中分离出高纯度的牛LF的方法。通过用不同浓度的氯化钠溶液逐步洗脱，从离子交换器中回收LF。根据之前的Laurell方法，生产的LF的纯度被测量为高达90-99％。

US5,596,082A[27]披露了一种在工业规模上从奶和奶制品中分离LF和LPO酶的方法。该方法包括将奶或奶衍生物通过阳离子交换器，将这些蛋白质吸附到阳离子交换器上的步骤。通过使用不同浓度的盐进行阶梯洗脱，促进上述蛋白质的洗脱。LPO和LF的最终纯度分别高达93％和94％。

US9,115,211B2[28]中披露的发明描述了一种利用阳离子交换树脂分离LF的方法。通过所述方法获得的LF纯度超过95％，基本上不含LPS、内毒素和血管生成素，铁的饱和度在9％到15％之间。

EP2421894A1[29]描述了一种制备低铁LF的方法，其铁饱和度低于10％，或者更优选的是铁饱和度约为9％至3.89％。与标准LF相比，由该工艺生产的这种低铁LF显示出更高的抗菌活性。该工艺使用酸和溶剂。在Fe

WO2014/207678A1[30]公开了一种从分泌液中提纯LF的方法，该方法包括将分泌液碱化，将碱化的分泌液与空气接触，并使用有机溶剂(丙酮)从碱化的分泌液中沉淀出LF。

WO1995/022258A2[31]公开了从奶，特别是非人类物种的奶中纯化人类LF的方法，以及将人类LF与奶中存在的不希望的大分子物种分离，包括与非人类LF物种分离。为了进行分离，使用强阳离子交换树脂(如SepharoseTM)。蛋白质(LF和其他)用阶梯式的盐和pH梯度洗脱。

G.Majka等人(2013)高通量定量乳铁蛋白制剂中铁饱和度的方法(Ahigh-throughput method for the quantification of iron saturation in lactoferrinpreparations),Anal.Bioanal.Chem.,405,5191-5200披露了一种获得低铁含量的牛乳铁蛋白的方法。进行离子交换色谱法获得低铁含量的乳铁蛋白是不够的。因此，将离子交换色谱法与对100mM柠檬酸盐缓冲液进行广泛透析24小时相结合。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种具有高纯度的高活性乳铁蛋白的物质组合物。

本发明的另一个目的是提供一种适合克服现有技术中至少一些缺点的方法。

高活性乳铁蛋白的特点是其相当低的铁饱和度(已结合的铁-A值)和高的铁结合潜力(铁结合能力-C值)。

本发明的另一个目的是提供一种包含高纯度乳过氧化物酶的物质组合。

然而，本发明的另一个目的是提供一种从含有这些蛋白质的来源物质制备备高纯度的乳铁蛋白或乳过氧化物酶的方法。

这些目的是通过一种从含有至少一种这些蛋白质的来源物质中制备包含乳铁蛋白或乳过氧化物酶的馏分的方法来解决的，其中该来源物质选自下组：奶、初乳、酸乳清或甜乳清，采用具有强阳离子交换性能的整体柱的色谱分离过程，其中在分离过程中，在将来源物质上样至所述柱后采用pH梯度洗脱或pH和盐梯度组合洗脱。

在本发明的一个实施方式中，pH梯度通常在4.0至

在本发明的另一个实施方式中，pH梯度通常在约pH8至pH<13的范围内终止，优选在pH8至pH12的范围内，特别是在pH8至pH<12的范围内。

在向色谱柱上样之前，对所述来源物质进行过滤是有利的。

在本发明的另一个实施方式中，盐梯度是通过增加盐浓度来进行的，特别是盐梯度对应的电导率在约5mS/cm到约55mS/cm之间。建议使用中性盐来调整盐浓度，以避免干扰缓冲溶液的pH值。特别有用的是在食品工业过程中使用的盐，通常是氯化钠。

与前面提到的盐的梯度结合使用的pH值通常在4.0至

在本发明的另一个实施方式中，可以在pH8至约pH值<11的范围内收集洗脱的馏分A，最好是在pH8.0至pH10.0的范围内，最好是在pH8.2至pH10.0的范围内，特别是在约pH8.9至约pH10。这种馏分通常含有乳酸过氧化物酶。

在本发明的另一个实施方式中，可以在pH>10至pH12.0的pH范围收集洗脱的馏分B，最好是pH>10.4至pH12的范围内，最好是pH＞11至约12的范围内，特别是pH>11至约11.7的范围内。这种馏分通常含有乳铁蛋白。

在本发明方法的一个特别有用的实施方式中，色谱分离过程包括以下步骤

(i)将来源物质的pH值调整到低于pH7，特别是低于pH6.5的值；

(ii)将步骤(i)的来源物质与具有强阳离子交换性能的整体柱接触；然后

(iii)使梯度缓冲液流经该柱，从而提高pH值；和

(iv)收集馏分A，其洗脱的pH值范围约为pH8至pH<11，最好是pH8.0至pH10.0，最好是pH8.2至pH10.0，特别是约pH8.9至约pH10；和/或

(v)收集馏分B，其洗脱的pH值范围为>10至pH12.0，优选约pH＞10.4至约12，更优选pH＞11.0至12.0，特别是约pH>11至约11.7。

(vi)可选地，进一步处理馏分A和/或B，特别是通过中和、浓缩、保存等处理。

在步骤(ii)之前过滤含有乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的来源物质可能是有利的。

在本发明方法的另一个实施方式中，在步骤(ii)之前，可以用平衡缓冲液平衡整体柱，该平衡缓冲液的pH值为约pH<7，特别是约pH<6。

具有强阳离子交换性能的整体柱尤其选自下组：SO

根据本发明的方法，在比馏分B低的pH值下洗脱的A馏分通常含有乳过氧化物酶，而B馏分通常含有乳铁蛋白。

在本发明的另一个实施方式中，在步骤(iii)或(iv)之前，可以用平衡缓冲液冲洗色谱柱。

通常，含有乳铁蛋白和乳过氧化物酶的馏分可以进一步处理，例如干燥，特别是通过喷雾干燥。

本发明的方法可获得高纯度的乳铁蛋白或乳过氧化物酶。乳铁蛋白的纯度为＞98％，乳过氧化物酶的纯度为＞78％。此外，乳铁蛋白C值为＞50％或＞60％，且乳铁蛋白A值为＞1％。优选的是，乳铁蛋白C值为＞70％，乳铁蛋白A值为＞2％。优选地，乳铁蛋白C值≥70.0％，优选在70.0％至80.0％之间，更优选在70.0％至77.0％。优选地，乳铁蛋白A值≥2.0％，优选<3.9％，优选1.0％至7.0％，优选2.0％至7.0％，优选2.0％至5.0％，更优选2％至4％。

根据本发明的另一个实施方式，在步骤(iv)或(v)之后，可以通过用pH值约为pH＞12的缓冲液冲洗整体柱来进行消毒。

本发明的主题还是一种物质组合，其包括可通过根据本发明的方法获得的乳铁蛋白或乳过氧化物酶。乳铁蛋白的C值为＞60％，A值为＞1％。优选的是，乳铁蛋白的C值为＞70％，A值为＞2％。优选地，乳铁蛋白的C值≥70.0％，优选在70.0％至80.0％之间，更优选在70.0％至77.0％之间。

优选地，乳铁蛋白A值在1.0％至7.0％之间，优选在2.0％至7.0％之间，优选在2.0％至5.0％之间，更优选在2％至4％之间，优选≥2.0％，和/或优选<3.9％。

优选的是本发明产品的A+C值至少为61％，或至少为72％或至少为73％。

本发明的方法提供了

-一种从奶、初乳和酸乳清或甜乳清中分离LF和LPO的快速和简单的方法。

-使用pH线性梯度进行LF和LPO分离的单一色谱步骤，从而获得高纯度的目标蛋白(如LF纯度>98％)。

-通过所披露的方法获得的产品(LF蛋白)，根据公认的测量不饱和铁结合能力(UIBC)的方法，该产品具有高活性(C值>70％，LF的C值测定试剂盒，NRLPharma)和含有低量的已结合铁(A值<3.9％，LF的A值测定试剂盒，NRLPharma)，这些都是市场上LF的主要特征。该产品是通过经济和程序要求不高的方法生产的，不使用特殊化学品，并在现场进行(在整体阳离子交换器上)。

-一种方法，能够生产出含铁量低(A值<3.9％)、同时不含血管生成素的LF。

-一种能够生产具有高生物活性(C值+A值>72％)的LF的方法。

-一种可以很容易地扩大生产规模，并且可以经济有效地生产高纯度和高生物活性的LF和LPO的方法。

-一种LF/LPO分离的整个工艺，包括色谱、浓缩/脱盐和干燥过程，可提供总体>85％的LF回收率。

-一种允许流动相高流速(700L/m

-一种不会将化学品引入含有蛋白质的待分离介质(如乳清)或以其他方式改变其特性的工艺；这允许在其他生化工业过程中进一步使用所述介质。

-一种能够生产具有预定份额的已结合铁的LF的方法。

附图的简要说明

图1.LF洗脱峰的色谱图，由LF洗脱峰组成。这种现象是由于铁含量造成的LF等电点(IEP)的微小差异造成的。Voswinkel等人[32]的研究表明，铁含量的减少会使LF的IEP小幅降低。

图2.(A)酸性乳清和(B)市售LF产品和LF的色谱图。

图3.使用8L整体柱、CIMmultus

本发明的详细描述

采用BIA分离公司(BIA Separations)的强阳离子交换剂基团的CIMmultus

在为比较而进行的阶梯洗脱模式的情况下，实现的LF纯度约为95％，而在电导率梯度的情况下，实现的纯度略高于95％。令人惊讶的是，根据本发明，用pH值增加的梯度洗脱，特别是用线性增加的pH值梯度洗脱，达到的蛋白质纯度超过98％。该纯度通过HPLC、SDS-页面分析、生物分析仪和SEC色谱法证明。本发明的方法通过单一的色谱步骤并在生产规模上提供了这些结果。顺便说一下，根据EP0253395中用于计算纯度的Laurell方法[26]，通过本发明的方法可以获得的本发明产品的计算纯度为>118％。可以看出，既定的方法已经过时，不再适合于正确测定LF纯度。

在线性pH梯度洗脱的情况下，我们注意到，LF的洗脱是由几个较小的子峰组成的(图1)。后者表明，LF也是在蛋白质铁含量的水平上被分离的，从低到高。这方面的原因已经被其他人讨论并证明[32]。

浓缩的LF水分散体通过喷雾干燥或冻干机进行干燥，并对LF的不饱和铁结合能力(UIBC)进行测量。根据日本NRLPharmaInc.(详细原理由Ito等人发表[33])，通过本发明的方法获得的LF的铁饱和度(已经结合的铁-A值)在2％到4.9％之间。它的铁结合潜力(铁结合能力-C值)，也称为不饱和铁结合能力(UIBC)，高于70％。与市场上的产品相比，这一结果名列前茅，其A值和C值分别在4.6-11.7％和34.4-52.1％之间(见表1)。同时，它们的总生物活性(C值+A值)通常低于本发明的产品。

表1：市售LF样品和本发明LF的生物活性(阿赫尔(Arhel)d.o.o.)

*总生物活性(A+C)是通过C和A的数值相加来表示的，这就给出了样品中活性蛋白的百分比。

**值根据样品中纯LF的数量重新计算，即64％。

本发明的方法提供了一种从含有至少一种这些蛋白的来源物质中制备包含乳铁蛋白或乳过氧化物酶的馏分的方法，其中该来源物质选自下组：奶、初乳、酸乳清或甜乳清，通过使用具有强阳离子交换性能的整体柱，特别是-SO

整体柱通常是一种色谱分离设备，包括一个空心体，其中含有多孔固体材料，所述材料是单体的聚合体。该材料的孔隙是在聚合过程中形成的(US 4,923,610,US 4,952,344,US 4,889,623)。

现有技术中描述了合适的装置，例如EP1058844、EP777725，并且可以在市场上买到。此处使用的整体色谱材料用-SO

pH梯度色谱法是通过将pH值从起始值增加到终点来进行的。它可以设计成几乎线性的形状，但也可以采用不同的路线，只要能得到本发明的结果，即得到本发明的产品乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶。技术人员知道如何进行这样的梯度色谱法。阳离子梯度色谱的条件优化--基于本发明的明确和隐含的披露--属于熟练人员的常规操作，与不适当的实验负担无关。

为了建立可重复的处理条件，在实际进行pH梯度分离之前，平衡整体柱是很有利的。在这种情况下，用平衡缓冲液冲洗柱子。通常，用相当于8-12倍柱死体积的平衡缓冲液冲洗柱子。色谱法的起始pH值的选择在一定程度上受到含有LF和/或LPO的来源物质的pH值的影响。例如，如果酸性乳清是LF和/或LPO的来源物质，平衡的pH值可以是pH4.6，而如果使用甜乳清，pH值可以更高，即pH5.0至pH6.5。

在将来源物质上样到色谱柱之前，对来源物质进行过滤是很有利的。一般来说，可以采用饮食业中使用的过滤手段。特别有用的是陶瓷TFF过滤器、螺旋形缠绕膜或其他连续过滤技术。

在整体柱上上样来源物质后，原则上可以开始进行pH梯度色谱法。然而，在开始pH梯度色谱之前，可以用平衡条件附近的pH值进一步冲洗柱子以去除杂质，这可能是有用的。这有助于分离待制备的蛋白质，因为在该pH值下洗脱的蛋白质或其他污染物不会污染LF和/或LPO的分离。

pH梯度的起始pH值通常在4.0至

应该注意的是，洗脱缓冲液的离子强度也会对分离产生一些影响。在色谱分离过程中，离子强度也可以在必要的pH梯度的基础上呈梯度增加。与前面提到的盐梯度结合使用的必要的pH梯度，其起始pH值通常在4.0至

例如，如果离子强度相当于约15mS/cm的电导率，则LPO在约pH8至约pH<11的范围内洗脱，但如果电导率从4至55mS/cm增加，最好从5至55mS/cm增加，则在约pH6.6至约pH7.5的较低pH范围内洗脱。LF的洗脱也遵循类似的方案。如果电导率为中等但保持不变，LF的洗脱范围为约pH10.7至约pH11.7，如果电导率从4至55mS/cm增加，最好从5至55mS/cm增加，LF在约pH9.6至约pH10.7的较低pH范围内洗脱。离子强度，即电导率可以通过添加合适的盐来调整。使用合适的盐也可以调整洗脱缓冲液的pH值。

在较高的电导率约5至55mS/cmis下，收集在约pH8至约pH＜11的范围内，最好是在pH值为约pH8.0至约pH10.0的范围内，最好是在pH值为约pH8.2至约pH10.0的范围内，特别是在pH值为约pH8.9至约pH10的范围内，或在约pH6.6至约pH7.5的范围内洗脱的馏分A。该馏分通常含有乳过氧化物酶。收集在pH值>10到12.0，最好是pH值>10.4到12，最好是约pH值＞11到约12，特别是约pH值>11到约11.7，或约pH值9.6到约10.7(高电导率，约5到55mS/cm)范围内洗脱的馏分B。这个馏分通常含有乳铁蛋白。

在下文中描述了本发明方法的典型性能。LF和LPO洗脱的pH值范围对应的介质电导率约为15mS/cm。该色谱分离过程包括以下步骤

(i)将来源物质的pH值调整到低于pH7，特别是低于pH6.5的数值；

(ii)将步骤(i)的来源物质与具有强阳离子特性的整体柱接触，特别是-SO3改性整体柱；然后

(iii)使梯度缓冲液流经该柱，从而提高pH值；以及

(iv)收集馏分A，其洗脱的pH值范围为约pH8至约pH<11，最好是pH8.0至pH10.0，最好是pH8.2至pH10.0，特别是约pH8.9至约pH10；和/或

(v)收集馏分B，其洗脱的pH值范围为pH值>10至pH值12.0，优选约pH值＞10.4至约12，优选pH值>11至pH值12，特别是约pH值>11至约11.7。

(vi)可选择进一步处理馏分A和/或B，特别是通过中和、浓缩、保存等处理。

为了去除不需要的物质，在步骤(ii)之前，含有乳铁蛋白和/或乳过氧化物酶的来源物质通过陶瓷过滤器进行过滤。

在步骤(ii)之前，用平衡缓冲液平衡整体柱，平衡缓冲液的pH值约为pH<7，特别是约为pH<6。在步骤(iii)或(iv)之前，用平衡缓冲液冲洗柱。

收集含有乳铁蛋白和乳过氧化物酶的馏分后，通过喷雾干燥进一步处理。

获得的乳铁蛋白或乳过氧化物酶的纯度很高。乳铁蛋白的纯度＞98％，乳过氧化物酶的纯度＞78％。此外，乳铁蛋白C值为≥60％，乳铁蛋白A值为≥1％。优选地，乳铁蛋白C值为＞70％，乳铁蛋白A值为＞2％。优选地，乳铁蛋白C值≥70.0％，优选在70.0％至80.0％之间，更优选在70.0％至77.0％之间。优选地，乳铁蛋白A值优选在1.0％至7.0％之间，优选在2.0％至7.0％之间，优选在2.0％至5.0％之间，更优选在2％至4％之间，优选≥2.0％和/或优选<3.9％。

根据本发明的另一个实施方式，在步骤(iv)或(v)之后，可以通过用pH＞13的缓冲液冲洗整体柱来进行消毒。

消毒步骤是通过用去离子水(10-15CVs)、1MNaOH(4-10CVs)冲洗柱子，接触时间为1至3小时，然后再次用水冲洗(>30CVs)。这个步骤可以每8-10次色谱运行就执行一次。

根据本发明的方法，这种新方法的独特之处还在于它(I)不需要对分离蛋白质的来源物质(如乳清)进行任何化学改性，而只是使用标准过滤技术进行预过滤，(II)与其他工艺(如EP2421894A1[29])相比，使用少量的低价化学品(缓冲剂)，(III)提供分离的高纯度的LPO和LF馏分，(IV)使LF的制备具有预先确定的已结合的Fe的值，和(V)得到较高的蛋白质回收率，高于85％，包括蛋白质洗脱分散的脱盐/浓缩和干燥生产步骤。

本文所引用的所有参考文献都是在不违背本文明确教导的前提下，通过参考全文纳入。

本发明在以下非限制性实例中得到进一步解释和说明。

实施例

分析方法：

HPLC分析方法：

为了测定样品中的LF和LPO，采用了配备有MWD多波长检测器和带有pH测量工具的电导率监测器(PATfix

表2.用于样品分析的色谱系统和方法。

为了确定干燥LF样品的C值和A值，我们使用了日本NRLPharmaInc.(NRL制药公司)提供的铁比色检测试剂盒(详细原理由Ito等人发表[33])，而为了确定干燥和液体样品的A值，我们使用了文献[33,34]中描述的相同方法并结合HPLC方法。

为了确定LF的C值，LF被已知过量的铁所饱和。剩余的铁由螯合试剂着色(最大吸光度为760nm)。剩余的铁在760nm处用分光光度法进行定量。准备好铁络合物的连续稀释液，在760nm处用分光光度法确定校准曲线。通过从添加的铁中减去剩余的铁来计算结合铁。C值以相对值表示，其中计算出的LF的理论铁结合能力(每个LF分子可以结合2个铁原子)被设定为100％。

理论铁结合能力

M(Fe)：铁的分子量；M(LF)：LF的分子量

被LF结合的铁

c(Fe

为了确定LF的A值，LF被变性试剂变性，释放的铁被螯合剂着色(最大吸光度760nm)。释放的铁在760nm处进行分光光度测定。准备好铁络合物的连续稀释液，在760nm处进行分光光度测定校准曲线。已经结合的铁(A值)以相对值表示，其中2个铁原子与一个LF分子结合被定义为100％。

理论铁结合能力

M(Fe)：铁的分子量；M(LF)：LF的分子量

试验系统的方案

图3描述了关于LP/LPO分离技术原理的流程图，以及在一次色谱运行中的质量平衡的近似值。在分离LF/LPO之前，使用孔径小于0.8μm的陶瓷TFF过滤系统过滤1100L酸乳清。过滤后的乳清(1000L)被泵送到平衡的色谱柱中。然后用不同的缓冲溶液组合洗脱与柱子结合的LF和LPO。然后对洗脱的馏分进行浓缩，如有必要，进行脱盐。浓缩蛋白干燥后，可得到60至90克干LF产品。可忽略不计地改变流出乳清和乳清浆液，可单独或混合使用，或在下游加工。

实施例1

一根80mLCIMmultus

实施例2

一根80mL的CIMmultus

实施例3

一根8L的CIMmultus

实施例4

一根8L的CIMmultus

实施例5

一根8LCIMmultus

实施例6

一根8LCIMmultus

参考文献:

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