一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法、所得灭菌质粒DNA及应用

摘要

本发明公开了一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其特征在于，包含以下步骤：步骤1：制备质粒DNA，将质粒DNA转移至离心管；步骤2：将上述离心管放入预热好的恒温金属浴中进行孵育；所述预热温度为72℃；所述孵育时间为30min以上；步骤3：孵育完成后取出离心管，快速降温冷却；步骤4：冷却完成后取出离心管，进行离心处理；步骤5：离心完成后取出离心管，离心管内为灭菌质粒DNA；能够大幅度降低蛋白表达的质粒转染过程导致的污染概率，一次性的成功转染缩短了获得目的蛋白的周期，节约了时间成本，避免了昂贵的试剂成本和人力成本的浪费。

说明书

技术领域

本发明涉及质粒DNA灭菌领域，具体涉及一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法。此外，本发明还涉及该方法制得的灭菌质粒DNA及应用。

背景技术

巴氏灭菌法，也称低温消毒法，是由法国微生物学家巴斯德发明的低温杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法，被广泛用于牛奶等食品工业中的杀菌处理，灭菌效率可达97.3%-99.9%。

目前，蛋白药物的体外表达已经成为一种趋势，尤其是用工具细胞进行蛋白药物的发现及筛选工作中，需要进行大量的体外蛋白表达工作，由此涉及到大量的细胞转染工作，成为了当今治疗性蛋白研发过程中的重要环节；由于前期筛选过程中涉及到的蛋白表达质粒数量较多、需求量不均一、批间差异等，很难保证每一个蛋白的所有质粒都能达到无菌的可直接用于转染的状态，有时候会造成不同程度的细胞污染现象，既浪费了昂贵的试剂和细胞，又使整个项目的周期受到不同程度的延迟，虽然将质粒进行过滤除菌也可以消除污染现象，但是通量一般较低，不适合进行大量的过滤除菌处理，并且需要较大的人力成本，传统的巴氏灭菌法利用细菌等微生物不是很耐热的特点，用适当的温度和时间处理，将其杀灭。

目前尚未有将巴氏灭菌法应用于质粒DNA灭菌的公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是现有的通量一般较低，不适合进行大量的过滤除菌处理，并且需要较大的人力成本，传统的巴氏灭菌法利用细菌等微生物不是很耐热，本发明提供一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，能够大幅度降低蛋白表达的质粒转染过程导致的污染概率，一次性的成功转染缩短了获得目的蛋白的周期，节约了时间成本，避免了昂贵的试剂成本和人力成本的浪费，用以解决现有技术导致的缺陷。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法制备的灭菌质粒DNA。

本发明要解决的技术问题之三是提供上述灭菌质粒DNA在细胞转染中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

在本发明的一方面，一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其中，包含以下步骤：

步骤1：制备质粒DNA，将质粒DNA转移至离心管；

步骤2：将上述离心管放入预热好的恒温金属浴中进行孵育；所述预热温度为72℃；所述孵育时间为30min以上；72℃一般为Taq DNA聚合酶在体外扩增DNA的延伸温度，在此温度下DNA可以很好的保持完整的双链形式，不会发生解链；过高的温度会导致DNA双螺旋结构的不稳定甚至解链，温度过低容易导致灭菌不彻底，造成污染；传统巴氏灭菌处理一般采取68℃左右处理30min，绝大多数细菌的致死点为68℃与时间30min以下，因为灭菌物非食品类，不必担心灭菌时间过长导致营养流失，所以本发明中所使用的时间选择为30min以上；

步骤3：孵育完成后取出离心管，快速冷却；

步骤4：冷却完成后取出离心管，进行离心；

步骤5：离心完成后取出离心管，离心管内为灭菌质粒DNA。

上述的一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其中，步骤2中，采用1.5ml加热模块将所述恒温金属浴预热至72℃。

上述的一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其中，步骤3中孵育完成的离心管冷却的条件为温度4-5℃，快速的降温处理也有助于细菌的温度不耐受从而达到促使细菌死亡的效果。

上述的一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其中，所述恒温金属浴是可提供恒定温度的设备，优选为水浴锅、干浴器、烘箱中的任一种。

上述的一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，其中，所述离心管的容积为1.5ml。

本发明中质粒DNA灭菌所使用的恒定温度为72℃，不宜低于70℃，也不宜高于75℃，在此温度条件下DNA可以保持良好的完整的双链形式，不会因为温度过高造成解链影响功能，过高的温度会导致质粒DNA的双螺旋结构不稳定，影响后续质粒基因编码蛋白的表达，过高的温度还可能会导致盛装质粒DNA溶液的离心管等塑料容器释放影响细胞生长的有毒成分，对细胞产生毒性，造成细胞生长受阻甚至细胞死亡；温度过低容易导致灭菌不彻底，造成细胞污染。置于加热装置中孵育的时间为至少30min以上，孵育的时间过短，可能导致灭菌不彻底，继续残留少部分有害细菌污染后续实验。

在本发明的第二方面，提供上述基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法制备的灭菌质粒DNA。

在本发明的第三方面，提供上述灭菌质粒DNA在细胞转染中的应用。

依据上述本发明一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法提供的技术方案具有以下技术效果：

1、本方法能够大幅度降低蛋白表达的质粒转染过程导致的污染概率；

2、一次性的成功转染缩短了获得目的蛋白的周期，节约了时间成本；

3、避免了昂贵的试剂成本和人力成本的浪费；

4、本发明的质粒灭菌方法所获得的灭菌质粒DNA用于细胞转染实验，蛋白（抗体）表达量未见降低，且对细胞生长状态未见明显影响，达到了预料不到的技术效果。

附图说明

图1为本发明实施例2中 细胞转染实验中灭菌质粒DNA的SDS-PAGE胶鉴定结果图。

具体实施方式

为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1 制备实施例

质粒灭菌处理具体的步骤如下：

1.将恒温金属浴的温度调至72℃，使用1.5ml加热模块，调节完毕后，加盖待用。

2.制备需要转染的质粒DNA，确保量足够，转移到1.5ml离心管。

3.将盛有质粒DNA的离心管放入已经预热好的恒温金属浴中。

4.孵育时间大于30min之后，取出完成灭菌的质粒DNA。

5.将完成灭菌的质粒DNA放4℃-5℃冰箱中快速冷却。

6.将冷却的装有质粒DNA的离心管离心，使蒸发的水分回到离心管底部。

7. 完成灭菌的质粒DNA可以直接用于后续的细胞转染。

实施例2 细胞转染实验

采用本发明方法即实施例1制得的灭菌质粒DNA用于细胞转染实验

转染所用的材料如下表1：

表1

转染步骤如下：

1.首先根据通过Vi-Cell测试的细胞活力和密度制备细胞，用事先预热的Expi293表达培养基稀释细胞。

2.将质粒DNA与预热的Opti-MEM混合为试剂A, 将 Transfection reagent与预热的Opti-MEM混合为试剂B，轻轻混匀，室温孵育5min。

3.轻轻混合试剂A与试剂B，并在室温下孵育20min。

4.将混合后的试剂添加到细胞中，同时向阴性对照中加入不含质粒的复合物。

5.在摇床上以120 rpm的转速在37°C，8％的CO2下孵育转染的细胞培养物。

6.转染后18-20h，在细胞培养物中加入Transfection Kit中的Enhancer1和Enhancer 2。

7.转染后5天收上清液，进行后面的SDS-PAGE电泳和纯化。

如图1所示，采用本方法进行灭菌得到的灭菌质粒DNA的SDS-PAGE胶鉴定结果，Sample1 & Sample4是采用质粒过滤除菌，未经本发明质粒灭菌方法转染后表达的蛋白PAGE胶图；Sample2,3,5,6是采用本发明的质粒灭菌方法转染后表达的蛋白PAGE胶图，可以清楚的看到，经过本发明的质粒灭菌方法所获得的蛋白与过滤除菌方法所获得的蛋白表达量未见明显差异。

实施例3 对照试验

传统巴氏杀菌，即低温消毒，就是利用较低的温度（一般在60～82℃）在一定的时间内，对食品进行加热处理，达到杀死微生物营养体的目的。然而，在试验中我们发现，采用巴氏灭菌用于质粒DNA灭菌处理时，并不是传统的巴氏杀菌温度范围60～82℃都适用，我们意外发现只有在温度为72℃左右时，蛋白（抗体）表达量未见降低，对细胞生长状态未见明显影响，且能有效杀灭样品中的细菌，达到了其他温度所预料不到的技术效果。

按照实施例2的细胞转染实验方法进行温度测试比对，温度对照组为：82℃，80℃，78℃，76℃，74℃，72℃，70℃，68℃，温度测试具体的步骤如下：

1.将待测试的DNA样品分为同样的9组，分别对应测试的8个温度组和1个过滤除菌的对照组。

2.将恒温金属浴的温度分别调节至待测试的温度，也可以用同一金属浴先后调节至待测试的温度。使用金属浴1.5ml加热模块，调节完毕后，加盖待用。

3.将上述8组需要温度处理的质粒DNA样品按温度分别放入已经预热好的恒温金属浴中。

4.待孵育时间30min之后，取出完成灭菌的质粒DNA。

5.将完成灭菌的质粒DNA迅速放入4℃-5℃冰箱中快速冷却。

6.将冷却的装有质粒DNA的离心管短暂离心，使蒸发到管盖的水分回到离心管底部。

7.完成上述温度测试步骤的质粒DNA按照细胞转染实验的步骤完成转染。

温度测试结果见如下表2：

表2

结合DNA在体外的聚合酶延伸温度一般是72℃左右的性质，故选用72℃作为本发明中所使用的最终温度，可适当在上下2℃-3℃浮动，不建议用较低温度以导致灭菌的效果不理想。过高的温度会导致DNA双链不稳定发生变性。

由以上结果，我们意外发现，当质粒DNA灭菌温度为72℃时，完成灭菌的质粒DNA可以直接用于后续的细胞转染，细胞转染结果蛋白（抗体）表达量未见降低，且对细胞生长状态未见明显影响，达到了其他温度所预料不到的技术效果，因此本发明选择72℃灭菌温度。

综上，本发明的一种基于巴氏灭菌的质粒DNA灭菌处理方法，能够大幅度降低蛋白表达的质粒转染过程导致的污染概率，一次性的成功转染缩短了获得目的蛋白的周期，节约了时间成本，避免了昂贵的试剂成本和人力成本的浪费。

以上对发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改做出若干简单推演、变形或替换，这并不影响发明的实质内容。