来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因及其编码的蛋白和应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体为一种来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因及其编码的蛋白。上述基因所编码的蛋白具有JAR1酶活性，可催化茉莉酸与L‑异亮氨酸生成共轭物茉莉酸异亮氨酸，即茉莉酸的活性激素。因此，本发明将为通过基因工程技术提高丹参中酚酸类和丹参酮类活性物质提供条件；同时,对提高丹参的抗病性，调节丹参的生长发育等方面都具有潜在的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因及其编码的蛋白和应用。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为唇形科鼠尾草属植物，其根入药，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈的功效，是大宗药材之一。丹参中的有效成分主要分为脂溶性丹参酮类和水溶性酚醛类，其中脂溶性丹参酮类有丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIB、隐丹参酮、二氢丹参酮I；水溶性酚醛类有丹参酚酸A、丹参酚酸B、紫草酸、丹参素、迷迭香酸。

茉莉酸(Jasmonic acid,JA)是一种重要的植物激素，JA作为一种信号物质，对植物生长过程中的许多进程有调节作用，主要包括三方面，一是调节植物生长发育进程，如萌发、衰老、果实的成熟、根的生长；二是调节植物防御系统，包括伤害应答和抵抗病原菌侵袭等；三是对于植物的次生代谢产物有显著的诱导合成作用，如紫杉醇、长春花碱、东莨菪碱等。研究表明，植物体内的茉莉酸及其衍生物是植物受外界刺激后反应最快的植物激素，也是伤信号转导途径中长距离运输的信号分子。在植物体内，共轭物茉莉酸异亮氨酸(Jasmonic acid-L-isoleucine,JA-L-ILE)是JA发挥作用的活性形式，是JA与L-ILE经JAR1催化形成，JAR1是这一活性激素产生的关键酶。JAR1酶属于GH3酶家族，其将氨基酸与不同的酰基酸结合在一起是激活茉莉酸反应所必需的。因此JAR1作为JAs生物合成途径中的关键酶之一，在调节植物生长发育等方面具有潜在的价值。

研究表明，外源JA处理能够诱导丹参酚酸类和丹参酮类化合物的显著积累。因此，本发明从丹参中获取丹参JAR1基因，并对其功能进行评价，获得的丹参JAR1基因所编码的蛋白具有茉莉酸氨基酸合成酶活性，将为通过基因工程技术提高丹参中酚酸类和丹参酮类活性物质提供条件；同时,对提高丹参的抗病性，调节丹参的生长发育等方面都具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明旨在提供一种来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因及其编码蛋白质。

本发明还提供了上述基因和蛋白质的应用。

技术方案如下，一种来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因，编码如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

一种来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因，包含SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

优选的，一种来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。

一种茉莉酸氨基酸合成酶JAR1，包含如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。优选的，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述茉莉酸氨基酸合成酶JAR1由来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因编码。

一种转化载体，含有上述来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因。

含有上述来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因的宿主细胞。

含有上述转化载体的宿主细胞。优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌。

上述来源于茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因、来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1用于催化茉莉酸和氨基酸的反应。

优选的，上述来源于茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因、来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1用于催化茉莉酸和L-异亮氨酸的生成茉莉酸异亮氨酸的反应。

茉莉酸异亮氨酸的合成方法，以茉莉酸和L-异亮氨酸为原料，以来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1为催化剂。

本发明从丹参中获取茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因，并将其用于表达蛋白，该基因所编码的蛋白具有活性，能够催化茉莉酸和L-异亮氨酸的生成共轭物茉莉酸异亮氨酸，即茉莉酸的活性激素。因此，本发明将为通过基因工程技术提高丹参中酚酸类和丹参酮类活性物质提供条件；同时,对提高丹参的抗病性，调节丹参的生长发育等方面都具有潜在的应用价值。

附图说明

为了更好的理解本发明的实质，下面将结合附图来说明本发明。

图1为实施例1中PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为实施例1中单克隆阳性菌PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳结果。

图3为实施例2中原核表达载体PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳结果。

图4为实施例3中蛋白诱导表达后的粗蛋白电泳图。

图5为实施例3中蛋白诱导表达并浓缩纯化后的蛋白电泳图。

图6为实施例3中标准蛋白溶液浓度与吸光度的线性回归方程。

图7为实施例4中体外重组酶活反应体系与对照组实验结果与JA-L-ILE标准品的液相质谱图谱。

具体实施方式

以下通过实例对本发明做进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1获取丹参JAR1基因

1.丹参叶片的RNA提取

a.样品采集：取新鲜的丹参叶片，放入含有两颗钢珠的2ml RNase-free离心管，迅速放入液氮中。

b.提取RNA：样品裂解，萃取分层，挂柱回收，洗涤离心，洗脱RNA(实验步骤参照试剂盒TransZol Up Plus RNA Kit全式金ER501)。

c.RNA浓度及纯度检测结果如表1：

表1总RNA浓度

2.丹参叶片cDNA文库的构建

丹参叶片总RNA逆转录成cDNA：total RNA放置冰上，使用RNase-free的试剂和耗材，实验步骤参照试剂盒(TaKaRa PrimeScript

3.扩增引物设计

用于基因扩增的引物如表2：

表2用于扩增丹参JAR1的引物

4.基因的扩增

实验步骤参照试剂盒(TOYOBO KOD FX货号：9503002)。

PCR反应液配制参照表3，PCR反应程序如表4：

表3 PCR反应液配方表

表4 PCR反应程序

PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳：150V，15min，结果如图1所示。片段长度超过1000kb。

5.扩增产物连接PMD19-T载体

扩增产物利用Premix Taq酶(TaKaRa Premix LA

表5扩增产物Premix Taq酶扩增加样

72℃反应20min，扩增产物连接PMD19-T载体按下表6加样，轻轻混合，室温反应1h，反应结束置冰上(实验步骤参照试剂盒TaKaRa PMD

表6连接PMD19-T载体加样

6.载体转化大肠杆菌

实验步骤参照试剂盒(唯地生物TOP10 Chemically Competent Cell)

(1)从-80℃冰箱取出感受态细胞，室温下解冻，后迅速置冰上；

(2)取连接产物5μL加入50μL感受态细胞中(超净工作台中进行)；

(3)冰上放置30min 42℃热激90s，立即放置冰上5min

(4)加入500μL无抗生素的LB培养液37℃、200rpm摇床培养约1小时；

(5)室温5000rpm离心1min，留100μL上清，吹打重悬；

(6)将悬液涂布于含100mg/L cb+的LB固体培养基上，倒放置于37℃恒温培养箱内培养12-16h

(7)挑12个单克隆菌落接种于300μL含100mg/L cb+的LB液体培养基中，37℃200rpm摇床培养3h以上。

7.单克隆阳性菌检测

反应液配制参照表7，PCR反应程序如表8。PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳：150V，15min，结果如图2。

表7 PCR反应液配方

表8 PCR反应程序

8.测序

选三个阳性菌，取100μL送测(生工)，利用SnapGene软件进行序列比对。

测序序列如SEQID No.1所示。其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2原核表达载体的构建

1.抽提质粒

取20μL测序正确的菌液JAR1-PMD19-T12，加入20mL LB(cb+100mg/L)培养基中，在37℃、200rpm恒温摇床中过夜培养。同时取20μL菌液pET32a+-T1，加入20mL LB(cb+100mg/L)培养基中，在37℃、200rpm恒温摇床中过夜培养。裂解菌体，离心取上清，上清液挂柱回收，洗涤离心，洗脱得质粒溶液(质粒提取步骤参照试剂盒EasyPure Plasmid MiniPrepKit全式金EM101)。

2.pET32a+质粒双酶切

使用BamHI-HF(NEB)和SacI-HF(NEB)双酶切pET32a+载体用于JAR1无缝克隆，反应体系如下表9。

表9

反应液混匀，置于37℃消化2h，琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将相应片段切下，胶回收得线性质粒溶液，利用微量紫外分光光度计检测线性质粒溶液得浓度和纯度，用于下一步计算。线性质粒溶液在-20℃可保存一周。

3.无缝克隆引物设计

用于无缝克隆的引物(限制性核酸内切酶位点带有下划线)如表10所示，F的限制性核酸内切酶位点为ggatcc：R的限制性核酸内切酶位点为gagctc。

表10无缝克隆引物

4.基因片段的扩增

a.实验步骤参照试剂盒(TOYOBO KOD FX货号：9503002)。PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳(150V，15min)结果如图3。

表11 PCR反应液配方表

表12 PCR反应程序

5.无缝克隆

参照下表13配制反应液，轻轻混匀，金属浴37℃，60min，反应后立即置于冰上或者降至4℃(步骤参照试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit C112诺唯赞)。

表13

b.重组产物转化大肠杆菌感受态Trans1-T1(实验步骤参照试剂盒Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell全式金CD501)。

c.涂板，挑斑，加500μL LB(cb+100mg/L)，37℃，200rpm，摇菌，过夜，菌检，送测(金唯智)，序列比对。

6.抽提质粒，转化表达型菌株BL21

测序正确的JAR1-PET32A-Trans1-T1-3-1，pET32a+-T1菌液，取20μL于20mL LB(cb+100mg/L)液体培养基中，37℃，200rpm摇床培养过夜，第二天抽提质粒，重新转化BL21(方法同Trans1-T1感受态)。涂板，37℃恒温培养箱培养过夜。挑斑，菌检，留阳性克隆菌株。

实施例3蛋白诱导与纯化

1.蛋白诱导表达

a.各取10μL菌液JAR1-pET32a+-BL21，pET32a+-BL21(作阴性对照)加入0.5mL LB(含cb+100mg/L)培养基，过夜培养，活化两次。

b.取20μL菌液加入5mL LB(含cb+100mg/L)培养基中200rpm 37℃培养大约6h。再取1mL菌液加入200mL LB(含amp+100mg/L)培养基中200rpm 37℃培养至OD600值达到0.5-0.6；

c.加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使终浓度为1mmol/L，80rpm 25℃培养过夜(10-16h)；

d.45,000rpm离心15min富集菌体，分次收集到50mL离心管中，20mL PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬，再离心，去上清；再用20mL的PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬菌体。

e.200w(变级杆3，功率35％)，2s超声，4s间隔，冰上超声破碎15min，菌液温度不得超过4℃；

f.超声破碎液于4℃12,000rpm离心15min，收集上清，即粗蛋白液。(预实验中，取1mL超声破碎液于4℃12,000rpm离心15min，收集上清，即粗蛋白液，沉淀用等体积1×PBS缓冲液重悬。)

2.SDS-PAGE电泳分析

上步实验得到的上清、沉淀各取20μL加入4μL蛋白上样缓冲液(6×proteinloading buffer)),混匀后沸水煮5min(加热变性12,000rpm离心2min，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析。

a.配制10％SDS-PAGE胶，分离胶和浓缩胶配方如表14，表中为两块胶的量。先将分离胶加入制胶槽中，约30min凝固后加入浓缩胶，并迅速插入齿梳。凝固后立即使用或者用浸湿的吸水纸包裹后置于4℃保存。

表14分离胶和浓缩凝胶的配方

b.取10μL变性后的样品上清液，均匀加入浓缩胶的泳道中，使用Bio-Rad电泳装置，电泳程序为：80V 30min 120V 60min。

c.反应结束后，将胶取出，小心切下浓缩胶，将分离胶置于加有考马斯亮蓝快染液的玻璃平皿中，侧摆摇床震荡10-30min左右，取出放清水中，微波炉中火加热30s，脱色，反复多次直到蛋白条带明显可见为止。

d.结果分析：JAR1蛋白分子量预测为136.92kDa。结果如图4显示，上清液和沉淀都存在目的蛋白JAR1，且空载pet32+的上清和沉淀在相应的位置上没有条带。

3.蛋白纯化

使用Bio-ScaleTM Mini ProfinityTM IMAC Cartridges纯化柱，按照表15配制纯化所需各溶液，加超纯水至1000mL，KOH或H

表15缓冲溶液配方表

a.将上述所得上清粗蛋白液及各缓冲液过0.22μm微孔滤膜；

b.使用5倍柱体积(5mL)的wash buffer 1平衡柱子，2mL/min缓慢冲洗；

c.粗蛋白液以2mL/min上样；

d.先后使用6倍柱体积的wash buffer 1和wash buffer 2冲洗子，流速为2mL/min；

e.使用10倍柱体积elution buffer洗脱样品，收集目的蛋白纯化的馏分(预实验：每1mL洗脱液用1.5mL离心管分别收集，并依次编号)，2mL/min缓慢洗脱；

f.洗脱后，使用5倍柱体积的wash buffer 1以2mL/min缓慢冲洗柱子。

注：为避免蛋白降解，上述各步骤均在冰上进行。

4.蛋白浓缩

预实验中将上述分别收集到的各蛋白洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，根据电泳结果，合并蛋白浓度较大的样品(如图所示，收集4-12mL组分，纯蛋白收集组分一般不随粗蛋白上样量改变)，使用millipore分子筛浓缩柱(50kDa)浓缩蛋白样品，同时起到除盐的目的。

a.4℃，离心，小于5000×g，浓缩至小于1mL。

b.再加15mL PBS缓冲液，离心至小于500μL。

c.浓缩后的蛋白酶置于冰上，用于后续实验。纯化蛋白每1mL组分电泳图如图5所示。

5.蛋白浓度检测

使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)检测纯化蛋白浓度，产品编号为P0010 BCA。

a.0.5mg/mL蛋白标准品溶液(BCA)分别取0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板中，PBS缓冲液补至20μL。再分别取4μL纯化后蛋白溶液三份，加PBS缓冲液补至20μL

b.各孔加入200μL现配的BCA工作液，37℃静置20min

c.567nm波长下检测各孔吸光度；

d.按照蛋白标准品溶液吸光度绘制标准曲线，计算蛋白浓度为2.19mg/ml，如图6。标准蛋白溶液浓度与吸光度的线性回归方程为：

y＝0.2614x+0.077 R

实施例4体外酶功能验证

反应体系如下表16：

表16体外重组酶活反应体系

恒温混合器，25℃300rpm 12h

对照组：pET32a+-BL21蛋白诱导表达；实验组：JAR1-pET32a+-BL21蛋白诱导表达。(酶促反应使用纯化后酶的PBS溶液，对照组用相同pH的PBS缓冲液代替)

底物：茉莉酸(JA)，L-异亮氨酸

b.反应结束后，用100μL无水乙醇淬灭反应。

c.反应液冻干。

d.用100μL纯甲醇(质谱级)复溶，超声30min，水浴加冰，温度不高于20℃。f.12000×g 4℃，离心30min。取上清90μL于进样小瓶中，测样。

g.利用Agilent Technologies 6410 LC-MS/MS对样品进行定性测定。

色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C8 3.5μm 2.1×100μm

流动相A:0.05％FA(水相)B:CAN(有机相)，进样量5μL

表17色谱条件

h.结果分析：液相质谱结果如图7所示，JA-L-ILE标准品在10.4min时出峰，在加入JAR1酶的酶活反应体系中在10.4min时有与JA-L-ILE标准品相同的峰，而在pET32a+空白载体的对照酶活反应体系中未出现与JA-L-ILE标准品相同的峰，故确定丹参JAR1可催化茉莉酸与L-异亮氨酸结合。

外源JA处理能够诱导丹参酚酸类和丹参酮类化合物的显著积累，本研究丹参JAR1基因的获取以及其功能的评价将为通过基因工程技术提高丹参中酚酸类和丹参酮类活性物质提供条件；同时对提高丹参的抗病性，调节丹参的生长发育等方面都具有潜在的应用价值。

序列表

<110> 上海中医药大学

<120> 来源于丹参的茉莉酸氨基酸合成酶JAR1基因及其编码的蛋白和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1796

<212> DNA

<213> 丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)

<400> 1

atgctggaga aaatggagga aagatttgat ccagaagcag tgatagagga attcgagacg 60

ttgtcaaggg atgcagggag ggttcagagg gaaacactgc agaaaatctt ggatgaaaat 120

ggtggaactg agtatatgca gagatgtggg cttaatggaa ggagtgatcc tgatagtttc 180

aaggcctgtg ttcccattgt ctcccacagt gacttggagc cttacattca gcgaatcgca 240

gacgggaata gcccctgcgc cctcaccgga aaaccaataa ccaccatttc cttgagttct 300

ggtacaactc aagggaagcc taagtttgtg cctttcaacg acgaattgat ggagagcacg 360

atgcagatat acaagacctc attcgcctat aggaataggg agtatccgat tgggaatggg 420

aaggcgttgc agttcatcta tagcagcaag cagttcaaga cgaaaggcgg cctagctgct 480

ggaactgcca caaccaacgt ctaccgcaat gcacagttca agaaaacgat gagggcaatg 540

cagaccccgt gctgcagccc cgatgaagtc atcttcggac cagatttcca ccagtcgttg 600

tactgccatc ttctgtgcgg actgattttc agagacgagg ttcaggttgt ctcgtccacg 660

tttgcccaca gcattgtcca cgctttccgg accttcgaac aagtctggga agagctcgtc 720

actgatatcc gtgaagggac cttgagcagc cggattacag tcccatcaat ccgagcagcc 780

atgggaaagc tgctcgagcc gaatcctgaa ctggcaaata ccatatatag caagatctcg 840

gggctaagca actggtatgg actaatccaa gagctgtttc cgagcaccaa gtacatatac 900

gggatcatga ccgggtccat ggagccgtat ctgaaaaaat tgaggcatta tgccggtgag 960

ctacctttgt taagtgcaga ttacggatct tccgagggat ggataggagc caacgtcaat 1020

cccaagctca ccccggaggt ggccacattt gctgtgctcc ctaatattgg ctatttcgaa 1080

ttcatccctc taagagagga cctgaactgc caagggcaag aggcgaaacc cgtggatctc 1140

accgatgtca agataggcga ggagtatgag atcttaatca ccaattttgc aggattgtac 1200

cgttataggt taggcgacgt agtgaaggtg aaaggtttcc acaactcgac tccggagctg 1260

cagttcatct gcaggaggaa tctcctgctc acgatcaaca tcgacaagaa caccgagaag 1320

gatctgcagc tcgcggtgga agcagcggcc cagctgctgg cgggggagaa gctcgaggtc 1380

gtggacttca ccagccgcgt ggacctgttg tccgagcccg gccactacgt ggtcttctgg 1440

gagatcagcg gggaccccca agacgagctc ctccaggagt gctgcaactg cctcgacagg 1500

tccttcgtgg atgcggggta cctgagctcg cgcaaggtcc gggccatcgg gccgctggag 1560

ctccggatcg tgaggaaggg gaccttccac aagatactgg accactacgt ggggctcggg 1620

gccgccgtca gccagttcaa gacgccgcgc tgcgtgggcc ccaccaacaa caccgtgctg 1680

cagatcctgt ctgtgaatgc tgtgaggagc tacttcagca ctgcatatta gattcttgca 1740

ggattttgat ttgtttggga aagaaaaaat ttgctgttta ttgttccttt gtgtag 1796

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> 丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)

<400> 2

Met Leu Glu Lys Met Glu Glu Arg Phe Asp Pro Glu Ala Val Ile Glu

1 5 10 15

Glu Phe Glu Thr Leu Ser Arg Asp Ala Gly Arg Val Gln Arg Glu Thr

20 25 30

Leu Gln Lys Ile Leu Asp Glu Asn Gly Gly Thr Glu Tyr Met Gln Arg

35 40 45

Cys Gly Leu Asn Gly Arg Ser Asp Pro Asp Ser Phe Lys Ala Cys Val

50 55 60

Pro Ile Val Ser His Ser Asp Leu Glu Pro Tyr Ile Gln Arg Ile Ala

65 70 75 80

Asp Gly Asn Ser Pro Cys Ala Leu Thr Gly Lys Pro Ile Thr Thr Ile

85 90 95

Ser Leu Ser Ser Gly Thr Thr Gln Gly Lys Pro Lys Phe Val Pro Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Leu Met Glu Ser Thr Met Gln Ile Tyr Lys Thr Ser Phe

115 120 125

Ala Tyr Arg Asn Arg Glu Tyr Pro Ile Gly Asn Gly Lys Ala Leu Gln

130 135 140

Phe Ile Tyr Ser Ser Lys Gln Phe Lys Thr Lys Gly Gly Leu Ala Ala

145 150 155 160

Gly Thr Ala Thr Thr Asn Val Tyr Arg Asn Ala Gln Phe Lys Lys Thr

165 170 175

Met Arg Ala Met Gln Thr Pro Cys Cys Ser Pro Asp Glu Val Ile Phe

180 185 190

Gly Pro Asp Phe His Gln Ser Leu Tyr Cys His Leu Leu Cys Gly Leu

195 200 205

Ile Phe Arg Asp Glu Val Gln Val Val Ser Ser Thr Phe Ala His Ser

210 215 220

Ile Val His Ala Phe Arg Thr Phe Glu Gln Val Trp Glu Glu Leu Val

225 230 235 240

Thr Asp Ile Arg Glu Gly Thr Leu Ser Ser Arg Ile Thr Val Pro Ser

245 250 255

Ile Arg Ala Ala Met Gly Lys Leu Leu Glu Pro Asn Pro Glu Leu Ala

260 265 270

Asn Thr Ile Tyr Ser Lys Ile Ser Gly Leu Ser Asn Trp Tyr Gly Leu

275 280 285

Ile Gln Glu Leu Phe Pro Ser Thr Lys Tyr Ile Tyr Gly Ile Met Thr

290 295 300

Gly Ser Met Glu Pro Tyr Leu Lys Lys Leu Arg His Tyr Ala Gly Glu

305 310 315 320

Leu Pro Leu Leu Ser Ala Asp Tyr Gly Ser Ser Glu Gly Trp Ile Gly

325 330 335

Ala Asn Val Asn Pro Lys Leu Thr Pro Glu Arg Gly Pro Glu Leu Pro

340 345 350

Arg Ala Arg Gly Glu Thr Arg Gly Ser His Arg Phe Lys Ile Gly Glu

355 360 365

Glu Tyr Glu Ile Leu Ile Thr Asn Phe Ala Gly Leu Tyr Arg Tyr Ser

370 375 380

Ser Ser Ala Gly Glu Ser Pro Ala His Asp Gln His Arg Gln Glu His

385 390 395 400

Arg Glu Gly Ser Ala Ala Arg Gly Gly Ser Ser Gly Pro Ala Ala Gly

405 410 415

Gly Gly Glu Ala Arg Gly Arg Gly Leu His Gln Pro Arg Gly Pro Val

420 425 430

Val Arg Ala Arg Pro Leu Arg Gly Leu Leu Gly Asp Gln Arg Gly Pro

435 440 445

Pro Arg Arg Ala Pro Pro Gly Val Leu Gln Leu Pro Arg Gln Val Val

450 455 460

Arg Gly Arg Gly Val Pro Glu Leu Ala Gln Gly Pro Gly His Arg Ala

465 470 475 480

Ala Gly Ala Pro Asp Arg Glu Glu Gly Asp Leu Pro Gln Asp Thr Gly

485 490 495

Pro Leu Arg Gly Ala Arg Gly Arg Arg Gln Pro Val Gln Asp Ala Ala

500 505 510

Leu Arg Gly Pro His Gln Gln His Arg Ala Ala Asp Pro Val Cys Glu

515 520 525

Cys Cys Glu Glu Leu Leu Gln His Cys Ile Leu Asp Ser Cys Arg Ile

530 535 540

Leu Ile Cys Leu Gly Lys Lys Lys Phe Ala Val Tyr Cys Ser Phe Val

545 550 555 560