禾谷镰刀菌编码支链氨基酸合成酶IPMD的两个同源基因FgLEU2A和FgLEU2B生物学功能研究

摘要

麦类赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是危害黑麦(Secale cereale)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum）等禾本类作物的一种重要病害，其病原菌为禾谷镰刀菌复合物(Fusarium graminearum complex)。小麦赤霉病不仅会降低籽粒的品质，造成巨大的经济损失，其病原菌在侵染过程中形成的多种真菌毒素，不但危害人畜健康，对食品安全也构成极大威胁。迄今为止，因缺少抗小麦赤霉病的高抗品种，化学防治仍是控制小麦赤霉病流行最有效的方法。70年代初，我国开始使用苯并咪唑类（多菌灵）杀菌剂防治小麦赤霉病，但由于常年单一用药，植株对多菌灵的抗药性增强。因此，新型杀菌剂的研发对小麦赤霉病的持续防控起着至关重要的作用。支链氨基酸(Branched-chain amino acids，BCAAs)包括亮氨酸(leucine)，异亮氨酸(isoleucie)和缬氨酸(valine)，是哺乳动物所需的必需氨基酸，但支链氨基酸的合成途径只存在于细菌，真菌和植物中，哺乳动物只能从外界获得。因此，支链氨基酸的合成酶途径成为新型安全药剂靶标研究的热点。
　　由LEU2基因编码的异丙基苹果酸脱氢酶（IPMD）是亮氨酸合成途径中一种重要的酶。禾谷镰刀菌全基因组中含有两个同源的LEU2基因(分别命名为FgLEU2A和FgLEU2B)，同源性比对结果表明，FgLeu2A和FgLeu2B蛋白的氨基酸序列的同源性为45％。通过靶向基因敲除技术构建FgLEU2A/B基因的敲除突变体，通过互补技术构建FgLEU2A基因的互补突变体，表型测定结果显示，FgLEU2A基因在亮氨酸的合成途径中起到更主要的作用。FgLEU2A基因的敲除突变体(△FgLeu2A-10)和FgLEU2A/B基因的双敲除突变体(△FgLeu2AB-8)表现出亮氨酸营养缺陷，FgLEU2B基因的敲除突变体(△FgLeu2B-2)在形态上与野生型菌株PH-1和互补突变体△FgLeu2A-com8没有明显差别。在营养匮乏没有亮氨酸添加的FGA培养基上，△FgLeu2A-10和△FgLeu2AB-8不能生长，外源添加0.25mM亮氨酸可恢复△FgLeu2A-10的亮氨酸营养缺陷，而△FgLeu2AB-8在外源添加1.25mM亮氨酸条件下才能恢复生长。△FgLeu2A-10和△FgLeu2AB-8在完全培养基PDA上气生菌丝稀疏、生长速率减慢、不产红色素。FgLEU2A基因的缺失还会阻碍分生孢子的产生，外源添加0.25mM亮氨酸能恢复分生孢子形成，但其却不能在2％的蔗糖水中萌发。△FgLeu2A-10和△FgLeu2AB-8对渗透压力和氧化压力的敏感性发生变化，在寄主麦穗和非寄主圣女果上的致病力显著减弱，DON毒素产生量显著降低，△FgLeu2B-2与PH-1和△FgLeu2A-com8相比差异不大。以上实验结果表明，FgLEU2A基因对禾谷镰刀菌的生长发育、毒素合成、致病性等方面都起着至关重要的作用，也是研发新型安全药剂的潜在药靶，FgLEU2B基因对禾谷镰刀菌生长发育、毒素合成、致病性等方面起到的影响并不显著。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 小麦赤霉病的概况

1．1 小麦赤霉病的危害

1．2 小麦赤霉病的病原菌

1．3 小麦赤霉病的症状和发生规律

1．4 小麦赤霉病的流行因素

1．5 小麦赤霉病的防治

2 支链氨基酸(BCAAs)合成途径的研究概况

2．1 支链氨基酸的功能研究

2．2 亮氨酸的合成途径

2．3 支链氨基酸合成相关基因的生物学功能研究

3 禾谷镰刀菌研究的分子生物学方法

3．1 禾谷镰刀菌的基因功能研究方法

3．2 小麦赤霉病的遗传化体系

4 本研究的意义及目标

4．1 研究的意义

4．2 研究目标

5 研究内容

第二章 FgLEU2A和FgLEU2B基因的生物学功能研究

1 实验材料与方法

1．1 实验材料

1．2 试验方法

2 实验结果

2．1 FgLEU2A／B基因的克隆、序列分析和进化分析

2．2 FgLEU2A／B基因在不同营养条件下的表达分析

2．3 FgLEU2A／B基因敲除和互补突变体的获得与鉴定

2．4 FgLEU2A／B基因在亮氨酸生物合成中起到不同的作用

2．5 气生菌丝生长测定

2．6 FgLEU2A基因的缺失影响分生孢子的产孢和萌发

2．7 色素及色素基因测定

2．8 细胞敏感性实验

2．9 FgLEU2A／B基因的缺失使得致病性降低

2．10 FgLEU2A／B基因的缺失使得DON毒素积累量减少

2．11 FgLEU2A／B基因敲除突变体中另外一个基因表达量变化情况

3．讨论

参考文献

致谢

硕士期间发表的学术论文