一种消除背景差异的萝卜与甘蓝同源基因功能研究方法

摘要

本发明公开了一种消除背景差异的萝卜与甘蓝同源基因功能研究方法，该方法通过在萝卜与甘蓝远缘杂种中进行转基因或基因编辑，超表达或敲除萝卜和甘蓝的同源基因，比较分析转基因植株和突变体的表型，研究萝卜和甘蓝同源基因的功能及其功能分化。本发明创造性的利用萝卜与甘蓝的种间杂种为研究受体，有效的消除了研究对象的遗传背景差异；在该受体材料上建立了高效的遗传转化和基因编辑技术体系，该研究体系同时操作萝卜和甘蓝两套基因组，在后基因组时代研究物种间的比较功能基因组提供了巨大的技术优势。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种比较研究萝卜与甘蓝同源基因生物学功能及其功能分化的方法，该方法高效并且可以消除植物背景差异对基因功能分析的影响。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus)是十字花科萝卜属(Raphanus)的重要蔬菜作物，在全球广泛种植，尤其在中、日、韩等亚洲国家占据蔬菜消费的重要份额。我国先民培育出丰富多样的萝卜品种，是重要的农业生物资源。除了以肉质根为产品的萝卜品种(R.sativusvar.longipinnatus)，还有以嫩荚为产品的长角果萝卜(R.sativus var.caudatus)，以种子为产品的油萝卜(R.sativus var.oleiformis)等变种。欧洲萝卜以樱桃萝卜(R.sativusvar.radicula)为主，同时还有黑萝卜(R.sativus var.niger)等变种。萝卜属的野萝卜(Raphanus raphanistrum)有两个亚种，R.raphanistrum ssp.landra和R.raphanistrumssp.raphanistrum，在欧美成为严重的杂草。在美国，野萝卜与栽培萝卜杂交，进化出比野生萝卜适应能力更强的杂草。甘蓝(Brassica oleracea)是十字花科芸薹属(Brassica)的重要蔬菜，包括结球甘蓝(B.oleracea var.capitata)，花椰菜(B.oleraceavar.botrytis)，青花菜(B.oleracea var.italica)，羽衣甘蓝(B.oleraceavar.acephala)等变种。

萝卜与甘蓝各有其独特的优良品质、营养、抗性基因。这些优良性状和基因的聚合与转育在种质资源创制和新品种选育方面具有重要的应用价值。随着基因组、泛基因组、重测序的完成，大量的同源基因被发掘出来。这些同源基因的具体生物学功能及其在物种间的功能分化亟需揭示。

然而，由于萝卜缺乏有效的遗传转化体系，研究其基因的功能非常困难。甘蓝虽然有遗传转化体系，但是，萝卜基因在甘蓝中异源表达不能真实反映基因在原物种中的实际功能。同时，缺乏一套研究体系在消除遗传背景差异的前提下来研究萝卜、甘蓝同源基因的功能分化，在后基因组时代研究物种间的比较功能基因组。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种比较研究萝卜与甘蓝同源基因生物学功能及其功能分化的方法，该方法高效并且可以消除植物背景差异对基因功能分析的影响。

本发明的技术方案为：一种消除背景差异的萝卜与甘蓝同源基因功能研究方法，该方法通过在萝卜与甘蓝远缘杂种中进行转基因或基因编辑，超表达或突变萝卜和甘蓝的同源基因，比较分析转基因植株和突变体的表型，研究萝卜和甘蓝同源基因的功能及其功能分化。由于使用的是同一受体植物，可以有效消除遗传背景差异对实验结果的影响。

进一步地，所述萝卜与甘蓝远缘杂种是利用萝卜与甘蓝远缘杂交，杂种植株加倍成异源四倍体，多代自交后使遗传稳定和育性恢复。

进一步地，所述萝卜包括RR基因组的所有亚种、变种，所述甘蓝包括CC基因组的所有亚种、变种，所述异源四倍体是指含有RRCC基因组的植株。

进一步地，所述萝卜与甘蓝远缘杂种的遗传转化是农杆菌介导的遗传转化。

所述遗传转化步骤为：

无菌苗制备：选取饱满的种子，清洗、消毒后均匀播种于播种培养基上，所述播种培养基组成为：1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌；

预培养：选取苗龄6-10d的幼苗，当外植体用下胚轴时，切取下胚轴，在预培养培养基上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上；当外植体用子叶盘时，切下子叶后平放于预培养培养基上，封口膜将培养皿封好，预培养2-4d；所述预培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加AgNO

摇菌：配置LB，其中加入筛选用的抗生素(根据载体选择，如卡那霉素)和利福平，从平板上挑取含有目的基因超表达或敲除或编辑的载体的农杆菌菌落或直接加入新鲜菌液，震荡培养过夜，震荡条件28℃，250r/min；

农杆菌悬浮液配置：摇菌至OD600＝0.6-0.8，菌液倒入无菌离心管中，离心，弃上清后加入DM悬浮液，重悬后倒入无菌三角瓶，放入摇床中30min-1h，震荡条件250r/min，28℃，之后，取出菌液，以加入乙酰丁香酮(AS)的悬浮液(DM)为背景，稀释菌液至OD600＝0.5-0.6；所述DM悬浮液的制备方法为：MS+蔗糖30g/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后4℃冰箱保存，用前加入乙酰丁香酮(AS)至100μmol/L；

共培养：将预培养2-4d的外植体置于OD600＝0.5-0.6的农杆菌悬浮液中侵染，期间不断摇晃，之后将外植体置于无菌滤纸上，将菌液吸干，在共培养培养基上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上，子叶盘不需滤纸直接放于培养基上，将培养皿封好后，共培养2-4d，所述共培养培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+2,4-D1mg/L，KT 0.3mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入乙酰丁香酮至100μmol/L；

延迟培养:将共培养2-4d的外植体转移到延迟培养培养基上，培养2-4d，所述延迟培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L,调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入AgNO

筛选培养：将延迟培养2-4d的外植体转移到筛选培养培养基上，光照强度为2000-4000lx,培养2-3周后开始出现芽分化。每培养20-30d转到新的培养基中，避免培养基中营养物质减少或抗生素失效对外植体生长产生影响。所述筛选培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入AgNO

生根培养：将发育完全的芽切下，转移至生根培养基中进行生根培养，所述生根培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+NAA0.1mg/L,调节pH为5.8，高压蒸汽灭菌后加入AgNO

炼苗：将组培生根的转基因苗取出，流水冲掉根部的培养基后移栽到蛭石中，置于培养箱中培养，光周期为20h光照+4h黑暗，每天浇水保证湿度，3d后开始浇霍格兰营养液，炼苗7d后移植到温室中。

进一步地，所述遗传转化具体为：

无菌苗制备：选取饱满的种子，无菌水清洗3次，75％酒精消毒1min，无菌水清洗3次，84消毒液稀释一倍后消毒10min，无菌水清洗3-4次，均匀播种于播种培养基上，每个培养基上约30粒种子；所述播种培养基组成为：1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌；

预培养：外植体用下胚轴或子叶盘；选取苗龄6-10d的幼苗，用锋利的手术刀片切取下胚轴，长度为0.5cm，在预培养培养基上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上；切下子叶后直接平放于预培养培养基上，用封口膜将培养皿封好，预培养2-4d；所述预培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加AgNO

摇菌：配置50ml LB培养基，加入筛选用的抗生素(根据载体选择，如卡那霉素)和利福平皆至50mg/L，用无菌牙签从平板上挑取含有载体(目的基因超表达或敲除或编辑的载体)的农杆菌或直接加入新鲜含有载体的农杆菌菌液1ml，震荡培养过夜，培养条件为28℃，250r/min；

农杆菌悬浮液配置：摇菌至OD600＝0.6-0.8，菌液倒入无菌离心管中，转速4000r/min，离心15min，弃上清后加入DM悬浮液，重悬后倒入无菌三角瓶，放入摇床中震荡培养30min-1h，条件为250r/min，28℃，之后，取出菌液，以加入乙酰丁香酮(AS)的DM悬浮液为背景，稀释菌液至OD600＝0.5-0.6；所述DM悬浮液的制备方法为：MS+蔗糖30g/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后4℃冰箱保存，用前加入乙酰丁香酮(AS)至100μmol/L；

共培养：将预培养2-4d的外植体置于OD600＝0.5-0.6的农杆菌悬浮液中侵染10min，期间不断摇晃，之后将外植体置于无菌滤纸上，将菌液吸干，在共培养培养基上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上，子叶盘不需滤纸直接放于培养基上，将培养皿封好后，共培养2-4d，所述共培养培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+2,4-D 1mg/L，KT 0.3mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加AS至100μmol/L；

延迟培养:将共培养2-4d的外植体转移到延迟培养培养基上，培养2-4d，所述延迟培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L,调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入AgNO

筛选培养：将延迟培养2-4d的外植体转移到筛选培养培养基上，光照强度为2000-4000lx,培养2-3周后开始出现芽分化。每培养20-30d周转到新的培养基中，避免培养基中营养物质减少或抗生素失效对外植体生长产生影响。所述筛选培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA 0.1mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入AgNO

生根培养：将发育完全的芽切下，转移至生根培养基中进行生根培养，所述生根培养基组成为：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+NAA0.1mg/L,调节pH为5.8，高压蒸汽灭菌后加入AgNO

炼苗：将组培生根的转基因苗取出，流水冲掉根部的培养基后移栽到蛭石中，置于培养箱中培养，光周期为20h光照+4h黑暗，每天浇水保证湿度，3d后开始浇霍格兰营养液，炼苗7d后移植到温室中。

进一步地，所述超表达或突变的目标基因是指萝卜和甘蓝基因组中的同源编码基因以及非编码基因。

进一步地，所述编辑或突变萝卜及甘蓝同源基因的方法是利用CRISPR-Cas9。

进一步地，所述超标达萝卜和甘蓝同源基因的转基因苗T

进一步地，所述基因编辑或突变植株利用PCR扩增目的基因靶位点所在的DNA片段，测序验证突变。

进一步地，超表达、突变及基因编辑植株进行表型观察，萝卜同源基因超表达或基因编辑突变体、甘蓝同源基因超表达或基因编辑突变体、野生型植株三者对比，研究萝卜与甘蓝同源基因的功能及其功能分化。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、由于萝卜缺乏有效的遗传转化体系，现有技术研究其基因的功能非常困难。因而，在现有技术下的同源基因功能比较中，萝卜的基因功能是未知的或推测的。本发明使得萝卜同源基因功能验证成为可能。

2、甘蓝虽然现有遗传转化体系，但是，萝卜基因在甘蓝中异源表达不能真实反映基因在原物种中的实际功能。本发明创造性的使用种间杂种作为研究受体，萝卜的一整套基因组得以保留，最大限度的保持了研究的准确性。

3、现有技术缺乏一套研究体系在消除遗传背景差异的前提下来研究萝卜、甘蓝同源基因的功能分化。本发明创造性的利用萝卜与甘蓝的种间杂种为研究受体，有效的消除了研究对象的遗传背景差异；在该受体材料上建立了高效的遗传转化和基因编辑技术体系，该研究体系同时操作萝卜和甘蓝两套基因组，在后基因组时代研究物种间的比较功能基因组提供了巨大的技术优势。

附图说明

图1为萝卜与甘蓝靶基因序列比对(局部)和靶位点。FANCM-R5为萝卜基因组FANCM基因序列(部分)，FANCM-C5为甘蓝基因组FANCM基因序列(部分)，框线标注处为gRNA识别位点；

图2为遗传转化再生芽；

图3为生根中的遗传转化再生芽；

图4为遗传转化再生芽生出的根；

图5为萝卜(R)基因组FANCM基因突变体植株；

图6为甘蓝(C)基因组FANCM基因突变体植株；

图7为再生苗PCR产物电泳图，从左至右分别是50bp DNA ladder和再生苗PCR产物。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

1、萝卜与甘蓝远缘杂种的创制

以萝卜(Raphanus sativus)为母本，甘蓝(Brassica oleracea)为父本，授粉杂交后通过胚挽救，并在培养基中加入秋水仙素促进染色体加倍，人工合成了萝卜和甘蓝的远缘杂交种(RRCC基因组)。多代自交后使遗传稳定和育性恢复。

2、基因编辑

以目标基因FANCM举例。FANCM已在多种植物中证实可抑制重组发生，其突变植株重组率提高。

具体方法：在NCBI中找到拟南芥FANCM基因的核酸序列，与RRCC全基因组序列进行对比查找到RRCC中对应的萝卜和甘蓝基因组同源基因(附图1)。针对来自萝卜染色体组和甘蓝染色体组的FANCM同源基因设计gRNA(附图1)，构建多顺反子gRNAs，连接gRNAs到预装载Cas9的植物基因编辑载体上构建重组质粒，转化农杆菌。以农杆菌为介导对RRCC进行遗传转化，具体遗传转化步骤如下：

播种：选取饱满的种子，无菌水清洗3次，75％酒精消毒1min，无菌水清洗3次，84消毒液(有效含氯量34.0-46.0g/L)稀释一倍后消毒10min，无菌水清洗3-4次，均匀播种于播种培养基上(1/2MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌)，每个培养基(三角瓶)中约30粒种子。

预培养：外植体用下胚轴或子叶盘。选取苗龄6-10d的幼苗，用锋利的手术刀片切取下胚轴，长度为0.5cm，在预培养培养基(MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+6-BA 2mg/L+NAA0.1mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加AgNO

转化方法为农杆菌介导的转化方法：

摇菌：

配置50ml LB，其中加入50mg/L卡那霉素(Kan，本实验例中所用载体细菌中抗性是抗Kan)，50mg/L利福平(Rif)，用无菌牙签从平板上挑取含有上述所构建的基因编辑载体的农杆菌菌落或直接加入其新鲜菌液1ml，震荡培养过夜，培养条件28℃，250r/min。

农杆菌悬浮液配置：摇菌至OD600＝0.6-0.8，菌液倒入无菌离心管中，转速4000r/min，离心15min。弃上清后加入DM悬浮液(MS+蔗糖30g/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后4℃冰箱保存，用前加入乙酰丁香酮AS至100μmol/L。注：用前再加防止AS失效)。重悬后倒入无菌三角瓶，放入摇床中30min-1h，震荡条件250r/min，28℃。之后，取出菌液，以加入AS的DM悬浮液为背景，稀释菌液至OD600＝0.5-0.6。

共培养：将预培养2-4d的外植体置于OD600＝0.5-0.6的农杆菌悬浮液中侵染10min，期间不断摇晃。之后将外植体置于无菌滤纸上，将菌液吸干。在共培养培养基(MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+2,4-D 1mg/L+KT 0.3mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加AS至浓度为100μmol/L)上铺一张无菌滤纸，将下胚轴平放于滤纸上，子叶盘不需滤纸直接放于培养基上。将培养皿封好后，共培养2-4d。

延迟培养:将共培养2-4d的外植体转移到延迟培养培养基(MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L，6-BA 2mg/L，NAA 0.1mg/L,调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入AgNO

筛选培养：将延迟培养2-4d的外植体转移到筛选培养培养基(MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L，6-BA 2mg/L，NAA 0.1mg/L，调节pH至5.8±0.1，高压蒸汽灭菌后加入AgNO

生根培养：将发育完全的芽切下，转移至生根培养基(MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L或植物凝胶2.5g/L+NAA 0.1mg/L,调节pH为5.8，高压蒸汽灭菌后加入AgNO

炼苗：将组培生根的转基因苗(附图4)取出，流水冲掉根部的培养基后移栽到蛭石中，置于培养箱中培养。光周期为20h光照+4h黑暗，每天浇水保证湿度。3d后开始浇霍格兰营养液，炼苗7d后移植到温室中(附图5和6)。

检测：对转化的再生苗进行PCR检测确定阳性苗(附图7)，对获得的阳性植株，FANCM基因目的片段PCR扩增并测序，确定是否发生基因功能缺失突变。对获得的阳性苗进行授粉收集种子，对T

功能鉴定：对萝卜(R)基因组FANCM基因突变体(附图5)，甘蓝(C)基因组FANCM基因突变体(附图6)及野生型株系进行表型观察。表型分析显示，萝卜和甘蓝基因组中FANCM基因的功能是保守的，没有明显的功能分化。