禾谷镰刀菌支链氨基酸合成基因FgILV5的生物学功能研究

摘要

麦类赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是麦类作物（黑麦、青稞、大麦、小麦等）上的一种流行性病害，其病原菌为禾谷镰刀菌复合物（Fusarium graminearumcomplex）.在全国各麦区都有发生，长江中下游为主要发生区。近年来由于秸秆还田等耕作方式的改变和全球变暖等气候因素的影响，赤霉病还有蔓延到黄淮麦区的趋势。小麦赤霉病不仅给麦类生产造成巨大的经济损失，还会降低籽粒的质量。由于病原菌在侵染过程中形成的多种真菌毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉蜀黍赤霉烯酮(ZEN)，不但危害人畜健康，对食品安全也构成极大的威胁。目前生产上由于缺乏抗赤霉病的小麦品种，化学防治仍是控制小麦赤霉病流行的最有效的方法。我国自上世纪70年代，主要依赖苯并咪唑类（多菌灵）杀菌剂防治小麦赤霉病，由于常年单一用药，田间多菌灵的抗药性问题严峻。因此，新型杀菌剂的研发对赤霉病的持续防控起着至关重要的作用。从农产品的安全角度出发，某些仅存在于真菌、细菌、藻类和高等植物中，哺乳动物中没有的生物合成途径成为新型安全药剂靶标研发的热点，例如支链氨基酸（Branched-chain amino acids，BCAAs）生物合成途径，BCAAs是一类人体必需氨基酸，人体只能通过外源摄取，缺乏该类氨基酸合成相关的酶。因此，BCAAs途径仅存在于细菌、真菌以及高等植物中，在哺乳动物中不存在，这一事实使得BCAAs合成酶成为研发对哺乳动物无毒或低毒药剂的潜在药靶。
　　本论文以小麦赤霉病的病原菌禾谷镰刀菌为研究对象，通过靶向基因敲除与互补技术对禾谷镰刀菌中编码第二步反应的酮酸-还原异构酶(keto-acid reductoisomerase，KARI) FgILV5基因的生物学功能进行了研究，论文结果将为研发靶向于BCAAs合成酶的新型安全药剂提供理论依据。通过同源比对，禾谷镰刀菌FgIlv5与啤酒酵母菌和白色念珠菌中Ilv5的氨基酸同源性分别为72.24％和71.60％。构建FgILV5基因的敲除载体，并通过原生质体转化获得敲除转化子，RT-PCR和Southern杂交均显示标号为△FgIlv5-4的转化子为单拷贝原位插入。FgILV5基因敲除突变体在营养匮乏的MM和FGA培养基上不能生长，在完全培养基PDA上气生菌丝稀疏、菌落变黄、不产红色素。Realtime-PCR测定敲除突变体中的红色素合成相关基因的表达水平仅为野生型菌株的10％。外源添加两种氨基酸（缬氨酸+异亮氨酸），且最低浓度需达到1 mM能够恢复FgILV5基因敲除突变体的营养缺乏。FgILV5基因的敲除突变体产分生孢子的能力也受到阻滞，外源添加缬氨酸(Valine)和异亮氨酸(Isoleucine)能恢复分生孢子形成，但其不能在2％蔗糖水中正常萌发。FgILV5基因的缺失还会引起突变体对渗透压力和氧化压力的敏感性。在寄主麦穗和非寄主番茄上，敲除突变体的致病力显著减弱，病斑不能扩展;另外一个重要的表型是FgIL V5基因敲除突变体的DON毒素产生量与野生型菌株相比显著降低，菌体内的多个毒素合成基因TRI的表达量也明显下降。以上实验结果表明，FgIL V5基因对禾谷镰刀菌生长发育、毒素合成和致病起着重要作用，是新型安全药剂研发的潜在药靶。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 小麦赤霉病

1．1 小麦赤霉病的发生情况

1．2 小麦赤霉病菌的基本生物学特性

1．3 影响小麦赤霉病发生的条件

1．4 小麦赤霉病的发生规律与危害

1．5 小麦赤霉病的防控

2 禾谷镰刀菌毒素

2．1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的特性

2．2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性机理

2．3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇对人类的影响

3．支链氨基酸(BCAAs)合成途径的研究概况

3．1 支链氨基酸的种类和特性

3．2 支链氨基酸的作用

3．3 支链氨基酸的代谢

3．4 支链氨基酸合成相关基因的生物学功能研究

4 本研究的意义、研究目标及研究内容

4．1 本研究的意义

4．2 研究目标

4．3 研究内容

第二章 FgILV5基因的生物学功能研究

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 试验方法

2．实验结果

2．1 禾谷镰刀菌基因组中FgILV5基因的鉴定和测定分析

2．2 禾谷镰刀菌中FgILV5基因敲除和互补突变体的获得与鉴定

2．3 禾谷镰刀菌FgILV5基因是BCAAs生物合成过程中的重要组分

2．4 FgILV5基因缺失体气生菌丝生长量和色素产生量减少

2．5 禾谷镰刀菌中FgILV5基因的缺失影响分生孢子的产生和萌发

2．6 禾谷镰刀菌中FgILV5基因的缺失将会增加其对渗透胁迫、氧化胁迫以及对AHAS抑制剂的忍耐性

2．7 禾谷镰刀菌中FgILV5基因缺失突变体致病性降低

2．8 禾谷镰刀菌FgILV5基因的缺失使得DON毒素积累量减少

3 讨论

参考文献

致谢