葡萄球菌属细菌的营养缺陷型菌株

摘要

本公开内容提供了依赖于D‑丙氨酸用于生长的重组葡萄球菌属细菌(例如表皮葡萄球菌)。在一个方面，本公开内容的特点在于重组葡萄球菌属细菌，其包含两个失活的丙氨酸消旋酶基因(Δalr1Δalr2)；以及失活的D‑丙氨酸转氨酶(dat)基因。在另一个方面，本公开内容的特点在于制备重组葡萄球菌属细菌的方法。在另一个方面，本公开内容的特点在于治疗或预防受试者的皮疹的方法，其包括以有效治疗或预防受试者的皮疹的量给予所述受试者本文所述的方面或实施方案中任何一个的重组葡萄球菌属细菌的群体。

说明书

优先权要求

本申请要求2018年11月16日提交的美国临时申请系列号62/768,485的权益，其整个内容通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。

发明背景

丙氨酸消旋酶是一种催化l-丙氨酸至d-丙氨酸的转换的含磷酸吡哆醛的同源二聚体酶，d-丙氨酸是细菌细胞壁中的肽聚糖层生物合成的关键构件块。丙氨酸消旋酶通常在真核生物中不存在，但在原核生物中普遍存在，这使得该酶成为用于开发新型抗微生物剂的有吸引力的靶标。

尽管D-丙氨酸对于细菌细胞壁形成是必需的，但已经证明确定在D-丙氨酸生物合成途径中哪些基因是关键的是更加复杂的。细菌包含一个或两个丙氨酸消旋酶基因。在具有两个基因的物种中，一个是组成性表达和合成代谢的，而另一个是可诱导和分解代谢的(Strych，U.等人2007. BMC Microbiol. 7:40；Strych U.等人，Curr. Microbiol. 41:290-294；Strych U.等人，FEMS Microbiol. Lett. 196:93-98)。这些基因供应了对于细胞壁生物合成所需的D-丙氨酸，并且用这些细菌中的几种的敲除研究已确立，丙氨酸消旋酶对于在不存在外源D-丙氨酸的情况下的生长是必需的(Franklin，F. C.和W. A.Venables. 1976. Mol. Gen. Genet. 149:229-237；Hols，P.等人J. Bacteriol. 179:3804-3807；Palumbo，E.等人FEMS Microbiol. Lett. 233:131-138；Steen，A.等人J.Bacteriol. 187:114-124；Wijsman，H. J. 1972. Genet. Res. 20:269-277)。

之前开发了双重丙氨酸消旋酶基因敲除表皮葡萄球菌(

本公开内容因此解决了对于依赖于D-丙氨酸用于生长的葡萄球菌属(

发明简述

本公开内容涉及依赖于D-丙氨酸用于生长的重组葡萄球菌属细菌。

在一个方面，本公开内容的特点在于重组葡萄球菌属细菌，其包含两个失活的丙氨酸消旋酶基因(Δalr1Δalr2)；以及失活的D-丙氨酸转氨酶(dat)基因。在一个实施方案中，葡萄球菌属细菌依赖于D-丙氨酸用于生长。在另一个实施方案中，葡萄球菌属细菌是表皮葡萄球菌(

在另一个方面，本公开内容的特点在于制备重组葡萄球菌属细菌的方法，其包括：(i)将包含D-丙氨酸转氨酶(dat)敲除的质粒转化到葡萄球菌属菌株(SEΔalr1Δalr2)的感受态细胞内；(ii)在转化的细胞中检测敲除质粒的存在；(iii)温育步骤(ii)中鉴定的转化细胞；并且(iv)纯化分离的菌落。在一个实施方案中，该方法进一步包括针对D-丙氨酸营养缺陷型测试分离的菌落。在另一个实施方案中，使用聚合酶链反应(PCR)检测转化体中敲除质粒的存在。在又一个实施方案中，重组葡萄球菌属细菌是表皮葡萄球菌(

在另一个方面，本公开内容的特点在于试剂盒，其包含本文所述方面或实施方案中任何一个的重组葡萄球菌属细菌。

在另一个方面，本公开内容的特点在于治疗或预防受试者的皮疹的方法，其包括以有效治疗或预防受试者的皮疹的量给予所述受试者本文所述的方面或实施方案中任何一个的重组葡萄球菌属细菌的群体。

附图简述

图1显示了在具有三重基因敲除的表皮葡萄球菌菌株(

图2A和图2B显示了三重敲除菌株(

发明详述

I. 定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有由本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。下述参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker编辑，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R. Rieger等人(编辑)，Springer Verlag(1991)；以及Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文使用的，除非另有说明，否则下述术语具有下文归于其的含义。

冠词“a”和“an”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。例如，“元件”意指一个元件或多于一个元件。

术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并且可与该短语互换使用。

除非上下文另有明确说明，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与其互换使用。

术语“例如”在本文中用于意指短语“例如但不限于”，并且可与该短语互换使用。

如本文使用的，术语“营养缺陷型的”或“营养缺陷型”指生物不能合成对于其生长所需的特定有机化合物。营养缺陷体是展示这种特征的生物。

如本文使用的，术语“alrA”和“alr”指D-丙氨酸消旋酶基因，包括alrA基因的正常等位基因。

如本文使用的，术语“dat”和“SE1423”指D-丙氨酸转氨酶基因，包括dat基因的正常等位基因。

如本文使用的，术语“多肽”或“蛋白质”指由在链中键合在一起的氨基酸残基组成的生物分子或大分子。本文使用的多肽的定义预期涵盖由氨基酸残基的一个或多个长链组成的蛋白质(一般较高分子量)以及几个氨基酸的小肽(一般较低分子量)。在其它实施方案中，单个氨基酸，尽管在技术上不是多肽，但也被视为在本发明的范围内。

为了本发明的目的，术语“分离的”指示已从其原始环境(它天然存在于其中的环境)中取出的生物材料(细胞、核酸或蛋白质)。例如，以天然状态存在于植物或动物中的多核苷酸并非分离的，然而，与它天然存在于其中的相邻核酸分开的相同多核苷酸被视为“分离的”。

“分离的核酸分子”(例如，分离的启动子)是与存在于核酸的天然来源中的其它核酸分子分开的核酸分子。例如，关于基因组DNA，术语“分离的”包括与染色体分开的核酸分子，基因组DNA与所述染色体天然缔合。优选地，“分离的”核酸分子不含天然地位于生物的基因组DNA中的核酸分子侧翼的序列，所述核酸分子衍生自所述生物。

如本文使用的，术语“遗传元件”意指包含编码多肽的区域，或者调节对于多肽在宿主细胞中的表达重要的复制、转录或翻译或其它过程的多核苷酸区域的多核苷酸；或者既包含编码多肽的区域，又包含与其可操作地连接的调节表达的区域的多核苷酸。遗传元件可以包含在作为附加体元件复制的载体内；即，作为物理上不依赖于宿主细胞基因组的分子。它们可以包含在质粒内。遗传元件也可以包含在宿主细胞基因组内；并非以其天然状态，而是在操作如分离、克隆以及引入宿主细胞内之后尤其以纯化DNA的形式或在载体中。

如本文使用的，“启动子”指的是指导结构基因的转录的DNA序列。通常，启动子位于基因的5'区域中，邻近结构基因的转录起始位点。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率响应诱导剂而增加。例如，启动子可以以组织特异性方式进行调节，使得它仅在转录特异性组织类型中的相关编码区时才是活性的。

如本文使用的，术语“宿主细胞”意指已进行转化或转染，或者能够通过外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。

如本文使用的，术语“多核苷酸”一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。因此，例如，如本文使用的，多核苷酸尤其指单链和双链DNA；其为单链和双链区域或单链、双链和三链区域的混合物的DNA；单链和双链RNA；以及其为单链和双链区域的混合物的RNA；包含DNA和RNA的杂合分子，其可以是单链的，或更通常地，双链或三链的，或者是单链和双链区域的混合物。另外，如本文使用的，多核苷酸指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。在此类区域中的链可以来自相同分子或不同分子。该区域可以包括一种或多种所述分子的全部，但更通常地仅涉及一些所述分子的区域。三螺旋区域的分子之一经常是寡核苷酸。如本文使用的，术语多核苷酸包括如上所述的DNA或RNA，其含有一个或多个修饰的碱基。因此，具有出于稳定性或出于其它原因而修饰的主链的DNA或RNA是“多核苷酸”，如该术语在本文中预期的。此外，仅举两个例子，包含稀有碱基例如肌苷或修饰碱基例如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是多核苷酸，如该术语在本文中使用的。应了解，已对DNA和RNA进行广泛多样的修饰，所述修饰发挥本领域技术人员已知的许多有用目的。如它在本文中采用的，术语多核苷酸尤其包括多核苷酸的此类化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括简单和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。术语多核苷酸还包括经常被称为寡核苷酸的短多核苷酸。“多核苷酸”和“核酸”在本文中经常可互换使用。

如本文使用的，术语“放射疗法”意指使用强能量束杀死癌细胞的癌症治疗类型。

如本文使用的，术语“化学疗法”意指使用药物杀死癌细胞的癌症治疗类型。

如本文使用的，术语“皮疹”是指放射疗法或化学疗法的任何皮肤相关的副作用。皮疹的特征通常为皮肤上的轻度起鳞、丘疹、粗糙、紧致感以及可能发痒和灼烧感。这包括但不限于斑丘疹(湿疹样棘细胞层水肿性皮炎)、瘙痒症、苔藓样反应、牛皮癣、痤疮状疹、白癜风样损伤、自身免疫性皮肤病(例如，大疱性类天疱疮、皮肌炎、斑秃)、结节病或指甲和口腔粘膜改变。

II. 组合物

本公开内容描述了三重敲除葡萄球菌属细菌，其是D-丙氨酸营养缺陷体。本公开内容提供了改造的葡萄球菌属细菌，例如表皮葡萄球菌，其在遗传上改变为具有双重丙氨酸消旋酶基因敲除和丙氨酸转氨酶基因(

D-丙氨酸是具有肽聚糖层结构的细菌的必需组分。D-丙氨酸的必要性源于二肽D-丙氨酰-D-丙氨酸在肽聚糖链的交联中的关键作用。如本公开内容中所述，先前开发了双重丙氨酸消旋酶基因敲除表皮葡萄球菌菌株(SEΔalr1Δalr2)。然而，与枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和一些其它细菌物种相反，所述双重敲除菌株未显示出D-丙氨酸营养缺陷型。认为表皮葡萄球菌中谷氨酸消旋酶(使L-谷氨酸和D-谷氨酸相互转换)和D-丙氨酸转氨酶(使D-丙氨酸和D-谷氨酸相互转换)的存在可以提供关于丙氨酸消旋酶的旁路。因此，本公开内容提供了显示D-丙氨酸营养缺陷型的双重敲除菌株(

本公开内容提供了细菌宿主细胞，其经遗传改造为在

细菌菌株

本发明提供了遗传改变的微生物，例如细菌。考虑本文所述的方法可以通过以下在任何葡萄球菌属细菌细胞中进行：使该细胞中编码dat的蛋白质同源物的基因失活或敲除，或者以其它方式使这种蛋白质的表达或活性失活。将菌株分配至葡萄球菌属要求其为革兰氏阳性球菌，所述球菌形成聚簇，产生过氧化氢酶，具有适当的细胞壁结构(包括肽聚糖类型和磷壁酸的存在)，以及在30–40摩尔%范围内的DNA的G + C含量。实例包括但不限于金黄色葡萄球菌群，包括银色葡萄球菌(

遗传构建体

本发明利用标准分子生物学技术，例如在(Sambrook等人，2001)中描述的那些。pJB38 (Boss等人，2013)用作敲除载体的质粒主链，所述载体基于pJB38，一种等位基因交换大肠杆菌-葡萄球菌穿梭载体，在质粒上进一步包含另外的设计特点，以改善功能性(Bose，J.L.等人

表1

使用标准分子生物学技术，使用Top10大肠杆菌作为克隆宿主，通过在pJB38中的EcoRI-SalI位点处克隆重叠的PCR产物来构建质粒。通过使用引物1423-5F和1423-3R(表1)的PCR以检测PCR产物，来选择和筛选克隆。将正确的SE1423敲除质粒(pJB-1423KO)的克隆转化到dam-/dcm-大肠杆菌菌株Gm2163内。通过使用Qiagen Midi Prep Kit，从两个Gm2163转化体克隆中分离质粒DNA，并且如上文通过用EcoRI和SalI的限制性消化进行检查。

重组葡萄球菌属细菌的用途

本发明的葡萄球菌属细菌可以照原样使用，或进行修饰以表达治疗性多肽以治疗疾病。在一个实例中，本发明的葡萄球菌属细菌可以用于治疗皮肤疾病或病症。在另一个实施方案中，本发明的葡萄球菌属细菌可以进行修饰，以表达治疗性多肽或其片段以治疗皮肤疾病或病症。

皮疹是使用癌症治疗例如放射疗法或化学疗法的最常见的副作用之一。研究已经表明，使用化学疗法药物例如表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂或免疫检查点抑制剂在大约30-100%的受治疗患者中导致皮疹表现(Fabbrocini等, Skin Appendage Disord.2015, 1(1):31-7和Sibaud等, Am J Clin Dermatol. 2018, 19(3):345-361，通过引用并入本文)。EGFR抑制剂的实例包括但不限于单克隆抗体西妥昔单抗(Erbitux®)和帕尼单抗(Vectibix®)，以及小分子酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼(Tarceva®)和吉非替尼(Iressa®)。EGFR抑制剂的实例实例包括但不限于靶向细胞毒性T淋巴细胞-相关抗原-4 (CTLA-4)、程序化细胞死亡蛋白1 (PD-1)或程序化死亡配体1 (PD-L1)的单克隆抗体。通过使用这些药物表现的皮疹病况可影响这些患者的生活质量，并且有时可导致疗法中断。

因此，在一个方面，本公开内容的特点在于治疗或预防受试者的皮疹的方法，其包括以有效治疗或预防受试者的皮疹的量给予所述受试者本文所述的方面或实施方案中任何一个的重组葡萄球菌属细菌的群体。根据一个实施方案，所述具有皮疹的受试者正经历癌症治疗。根据一个实施方案，癌症治疗是放射疗法。根据一个实施方案，癌症治疗是化学疗法。根据一个实施方案，化学疗法包含表皮生长因子抑制剂。根据一个实施方案，化学疗法包含检查点抑制剂。

制剂

进一步显而易见的是，用于根据本发明使用的制剂可以包含任何药学有效量的重组葡萄球菌属细菌，以产生治疗有效量的所需多肽，例如至少约0.01%、约0.05%、约0.1%、约0.2%、约0.3%、约0.4%、约0.5%、约0.6%、约0.7%、约0.8%、约0.9%、约1.0%、约1.5%、约2.0%、约3.0%、约4.0%、约5.0%、约6.0%、约7.0%、约8.0%、约9.0%、约10.0%、约11.0%、约12.0%、约13.0%、约14.0%、约15.0%、约16.0%、约17.0%、约18.0%、约19.0%、约20.0%、约25.0%、约30.0%、约35.0%、约40.0%、约45.0%、约50.0%或更多重量的遗传改造的微生物例如细菌，其上限为约90.0%重量的遗传改造的微生物例如细菌。

在一个替代实施方案中，用于根据本发明使用的制剂可以包含例如至少约0.01%至约30%、约0.01%至约20%、约0.01%至约5%、约0.1 %至约30%、约0.1%至约20%、约0.1%至约15%、约0.1 %至约10%、约0.1%至约5%、约0.2%至约5%、约0.3%至约5%、约0.4%至约5%、约0.5%至约5%、约1%至约5%或更多重量的重组葡萄球菌属细菌。

III. 方法

本公开内容的特点在于制备重组葡萄球菌属细菌的方法，其包括：(i)将包含D-丙氨酸转氨酶(

IV. 试剂盒

本发明还提供了试剂盒。在一个方面，本发明的试剂盒包含(a)本发明的重组葡萄球菌属细菌和(b)其使用说明书。本发明的组合物在上文描述。在一些实施方案中，本发明的组合物包含依赖于D-丙氨酸用于生长的重组葡萄球菌属细菌。

本发明通过下述实施例进一步说明，所述实施例不应解释为进一步的限制。所有附图以及本申请自始至终引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及附图都明确地通过引用以其整体结合到本文中。

实施例

下述实施例进一步描述且证实了在本发明的范围内的实施方案。实施例仅给出用于说明的目的，而不应解释为本发明的限制，因为其许多变化是可能的，而不脱离本发明的精神和范围。

在一个实施方案中，本发明描述了表皮葡萄球菌(

实施例1：用于缺失SE1423(D-丙氨酸转氨酶)的载体

pJB38 (Boss等, 2013)用作敲除载体的质粒主链。设计特异性引物用于进行SE1423敲除(表1)。

表1. 用于SE1423敲除的引物

● 使用引物1423-5F/1423-3R的重叠PCR：1.5 Kb

● 使用引物1423-5F/1423-3R来自野生型的PCR产物：2.3 Kb

● F：正向引物

● R：反向引物

● 添加的用于克隆的限制性位点以加下划线的粗体字母显示

生成了分别为0.5 Kb和1.0 Kb的5'和3'侧翼区域的PCR产物。它们然后用作重叠PCR中的模板，以生成涵盖5'和3'侧翼区域两者的大PCR产物(1.5 Kb)。使用Top10大肠杆菌作为克隆宿主，在pJB38中的EcoRI-SalI位点处克隆重叠的PCR产物。通过使用引物1423-5F和1423-3R的PCR以检测1.5Kb的PCR产物，来选择和筛选克隆。还分离质粒DNA，并且通过EcoRI和SalI消化，以检测载体主链(7.0 Kb)和插入物(1.5 Kb)的两个片段。将正确的SE1423敲除质粒(pJB-1423KO)的克隆转化到dam

实施例2. 三重敲除菌株(

使用TAS + 氯霉素(10 μg/mL)的平板，将从Gm2163中分离的pJB-1423KO质粒转化到表皮葡萄球菌菌株(

实施例3. 在三重敲除菌株(

将来自TSA+ATC+DA平板的总共25个分离的菌落点到TAS平板和TSA+ATC+DA平板上。使平板在30℃下温育过夜。所有克隆在补充D-丙氨酸的平板(TSA+ATC+DA)上都良好生长。如图1中所示，如果没有D-丙氨酸补充，三个克隆(#7、#12和#18)未能在TSA上生长，指示D-丙氨酸营养缺陷型。当将来自TSA+ATC+DA平板上的菌斑的细胞再次点在TSA平板上时，再次观察到营养缺陷型表型。注意，由于第二轮同源重组可以导致质粒主链的去除而不敲除SE1423，因此预计来自TSA+ATC+DA平板的一些克隆将保留野生型SE1423基因座。

进一步分析了其为D-丙氨酸营养缺陷体的克隆。当将这些1423KO SE克隆点到TSA+Cm (10 μg/mL)上时，它们并未生长，指示在第二轮同源重组的过程中质粒主链(包括氯霉素选择标记物)的去除。使用引物JB-Cm-F和JB-Cm-R(表1)的PCR也确认了抗生素抗性标记物的丧失(数据未显示)。如预计的，使用引物1423-5F和1423-3R的PCR检测到这些KO克隆中1.5 Kb的PCR产物，而来自SE宿主的PCR产物为2.3 Kb(图2A)。野生型SE细胞使用引物1423-F和1423-R(两者均对SE1423编码序列特异性)产生0.7 Kb的PCR产物；从KO质粒DNA和推定的KO克隆中未检测到这种PCR产物(图2B)。

因此，基于所有实验数据，可以得出结论：在双重丙氨酸消旋酶基因敲除菌株中成功地缺失了SE1423(dat，D-丙氨酸转氨酶)，生成了三重敲除表皮葡萄球菌菌株(

D-丙氨酸是细菌细胞肽聚糖合成所必需的。缺失丙氨酸消旋酶基因对于枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中的D-丙氨酸营养缺陷型是足够的。然而，为了在表皮葡萄球菌中开发这种表型，必须敲除两个丙氨酸消旋酶基因(

随着D-丙氨酸营养缺陷型表皮葡萄球菌菌株的成功开发，下一步是使用含有丙氨酸消旋酶基因作为选择标记物的表达载体转化该菌株。通过D-丙氨酸宿主营养缺陷型的质粒互补来选择转化体。

等价方案

本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等价方案。预期此类等价方案由随附权利要求涵盖。

参考文献

Bose JL等, 2013. Genetic tools to enhance the study of gene functionand regulation in Staphylococcus aureus. Applied and EnvironmentalMicrobiology 79:2218-2224.

Moscoso M等, 2017. Protective efficacy of a D-alanine auxotrophStaphylococcus aureus as a vaccine candidate against staphylococcal disease.27th ECCMID, April 22, 2017, Vienna, Austria.

Thompson R等, 1998. Pathogenicity and immunogenicity of a Listeriamonocytogenes strain that requires D-alanine for growth. Infection andImmunity 66:3552-3561.

Fabbrocini G等, 2015. Acneiform Rash Induced by EGFR Inhibitors:Review of the Literature and New Insights, 1(1):31-7.

Sibaud V等, 2018. Dermatologic Reactions to Immune CheckpointInhibitors : Skin Toxicities and Immunotherapy, 19(3):345-361。