一种调控群体感应淬灭的代尔夫特菌及其分离方法和应用

摘要

本发明涉及一种调控群体感应淬灭的代尔夫特菌及其分离方法和应用，所述调控群体感应淬灭的代尔夫特菌命名为代尔夫特菌(Delftia sp.)JL5菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年1月21日，保藏编号为CCTCCM 2021139，地址为：湖北省武汉市武汉大学。本发明所涉及的代尔夫特菌为产酰化酶的细菌，酶表达量很高，较目前最广泛应用的红球菌BH4相比，显示出更强的N‑酰基高丝氨酸内酯(AHL)降解能力，通过其高效的AHL降解能力，在添加到膜生物反应器(MBR)中时，能抑制生物膜附着在膜组件上而防控膜的污堵，提高出水效率，降低运行成本。

说明书

技术领域

本发明属于微生物分离技术领域，具体涉及一种高效淬灭N-酰基高丝氨酸内酯的代尔夫特菌及其分离方法和应用，尤其涉及一种调控群体感应淬灭的代尔夫特菌及其分离方法和应用。

背景技术

群体感应是指微生物群体在其生长过程中，由于群体密度的增加，导致其生理和生化特性的变化，显示出少量菌体或单个菌体所不具备的特征。这个变化的原因在于：当环境中微生物种群密度达到阈值，信号分子的浓度也达到一定的水平，通过包括受体蛋白在内相关蛋白的信号传递，诱导或抑制信号最终传递到胞内，影响特定基因的表达，调控微生物群体的生理特征，如生物发光、抗生素合成、生物膜形成等。

通过细菌细胞产生的物质进行物种间群体感应淬灭是一种先进的可用于废水处理的技术，非常适合膜生物反应器(MBR)中生物污染的控制。MBR膜污堵的主要原因是细菌通过群体感应产生了生物膜，形成膜生物污堵，因此抑制群体感应可有效抑制生物污堵。群体淬灭(QQ)技术主要是通过细菌产生的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)淬灭酶(即内酯酶和酰基转移酶)使AHL降解失活，从而降低细菌间的群体感应强度，最终抑制膜表面的生物膜的产生，达到控制MBR膜污染的目的。

MBR防止膜污堵的常用方法主要是物理和化学的方法，如反冲洗和投加化学试剂等，但物理和化学方法难以解决生物造成的污堵问题(细菌在膜表面形成致密的生物膜)。目前的研究更青睐于从生物的角度进行防控，而细菌群体感应(细菌通讯交流机制)是生物污堵的主要原因，即细菌通过产生和接收信号分子，感知周围菌群变化，产生群体行为(生物膜产生等)。AHL就是普遍存在于G

但现有技术中能产生酰化酶的淬灭细菌大多数都存在酰化酶表达量低、效率低的弊端，不适合实际应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高效淬灭N-酰基高丝氨酸内酯的代尔夫特菌及其分离方法和应用，尤其提供一种调控群体感应淬灭的代尔夫特菌及其分离方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种调控群体感应淬灭的代尔夫特菌，所述调控群体感应淬灭的代尔夫特菌命名为代尔夫特菌(Delftia sp.)JL5菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年1月21日，保藏编号为CCTCCM 2021139，地址为：湖北省武汉市武汉大学。

本发明所涉及的代尔夫特菌为产酰化酶的细菌，酶表达量很高，较目前最广泛应用的红球菌BH4相比，显示出更强的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)降解能力，通过其高效的AHL降解能力，在添加到膜生物反应器(MBR)中时，能抑制生物膜附着在膜组件上而防控膜的污堵，提高出水效率，降低运行成本。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的调控群体感应淬灭的代尔夫特菌的分离方法，所述分离方法包括：

(1)将膜生物反应器中的活性污泥样品转移至以N-酰基高丝氨酸内酯为唯一碳源的培养基中进行富集培养，然后涂布于平板上进行纯化形成单菌落；

(2)挑取形态完整的单菌落进行N-酰基高丝氨酸内酯淬灭能力的比较，筛选出高效率的淬灭菌株；

(3)对筛选出的淬灭菌株进行形态学、生理生化和分子生物学分析，确定种属信息，鉴定获得所述调控群体感应淬灭的代尔夫特菌JL5菌株。

优选地，步骤(1)所述以N-酰基高丝氨酸内酯为唯一碳源的培养基包括Na

优选地，步骤(1)所述以N-酰基高丝氨酸内酯为唯一碳源的培养基包括Na

所述Na

所述KH

所述NaCl的质量百分含量可以为0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％等。

所述NH

所述MgSO

所述CaCl

所述微量元素的的质量百分含量可以为0.5％、1％、1.5％、2％等。

所述N-酰基高丝氨酸内酯的浓度可以为1mM、1.5mM、2mM、3mM等。

上述各项数值范围内的其他具体数值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述N-酰基高丝氨酸内酯为N-己酰高丝氨酸内酯(C6-HSL)。

优选地，步骤(1)所述富集培养在温度为28-32℃(例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等)，100-300r/min(例如100r/min、150r/min、200r/min、250r/min、300r/min等)振荡条件下进行18-30h(例如18h、20h、24h、28h、30h等)。上述各项数值范围内的其他具体数值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤(1)所述将膜生物反应器中的活性污泥样品转移之前，用超纯水稀释样品后接种于培养基中培养。

优选地，所述接种量为3-7％(v/v)，例如3％、4％、5％、6％、7％等，该数值范围内的其他具体数值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述培养的条件为在温度为28-32℃(例如28℃、29℃、30℃、31℃、32℃等)，100-300r/min(例如100r/min、150r/min、200r/min、250r/min、300r/min等)振荡条件下进行40-56h(例如40h、42h、45h、48h、50h、56h等)，上述各项数值范围内的其他具体数值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述转移量为1-3％(v/v)，例如1％、2％、3％等，该数值范围内的其他具体数值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，步骤(2)所述N-酰基高丝氨酸内酯淬灭能力的比较方法为：将单菌落与N-酰基高丝氨酸内酯在培养基中混合培养，离心收集上清液，灭活；然后与报告菌株共培养于培养基中，离心收集上清液，加入二甲基亚砜，超声破碎细胞，离心收集上清液，测OD值，并根据标准曲线计算样品中N-酰基高丝氨酸内酯的浓度，进而比较N-酰基高丝氨酸内酯的淬灭能力。

其中标准曲线的构建方法示例性地可以为：将分别含10、5、2.5、1.25μmol/L的N-酰基高丝氨酸内酯例如C6-HSL的样品分别加10μL至1mL上述相同的报告菌株菌液中，于上述相同的培养条件进行培养，离心收集上清液，加入二甲基亚砜，超声破碎细胞，离心收集上清液，测OD值，绘制标准曲线。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的调控群体感应淬灭的代尔夫特菌在抑制和/或细菌生物膜中的应用。

MBR膜污堵的主要原因是细菌通过群体感应产生了生物膜，形成膜生物污堵，本发明所涉及的代尔夫特菌JL5菌株通过产生的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)淬灭酶(即酰基转移酶)，使AHL降解失活，从而降低细菌间的群体感应强度，最终抑制膜表面的生物膜的产生。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的调控群体感应淬灭的代尔夫特菌在膜生物反应器的防膜污堵中的应用。

本发明所涉及的代尔夫特菌JL5菌株当应用于膜生物反应器中时，通过产生的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)淬灭酶(即酰基转移酶)，使AHL降解失活，从而降低细菌间的群体感应强度，最终抑制膜表面的生物膜的产生，达到控制MBR膜污染的目的。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所涉及的代尔夫特菌为产酰化酶的细菌，酶表达量很高，较目前最广泛应用的红球菌BH4相比，显示出更强的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)降解能力，通过其高效的AHL降解能力，在添加到膜生物反应器(MBR)中时，能抑制生物膜附着在膜组件上而防控膜的污堵，提高出水效率，降低运行成本。

附图说明

图1是各候选菌株对C6-HSL淬灭能力的结果统计图；

图2是代尔夫特菌JL5菌的革兰氏染色图；

代尔夫特菌(Delftia sp.)JL5菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年1月21日，保藏编号为CCTCCM 2021139，地址为：湖北省武汉市武汉大学；

图3是代尔夫特菌JL5菌的扫描电子显微镜图；

图4是单菌生物膜组和双菌生物膜组中生物膜的形成情况以及生物膜生成定量统计结果图；

图5是AHL断链恢复试验结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所涉及的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PAO1(ATCC15692)来源于ATCC菌种库；红球菌Rhodococcus sp.BH4(KCTC 33122)和根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens A136(ATCC 51350)为首尔国立大学化学与生物工程学院李正学教授惠赠；报告菌株紫色色杆菌Chromobacterium violaceum VIR24(ATCC 12472)来源于ATCC菌种库。

实施例1

本实施例提供一种调控群体感应淬灭的代尔夫特菌JL5菌株，分离方法包括如下步骤：

(1)取MBR中的活性污泥样品，用超纯水稀释10倍后，以5％(v/v)接种于LB培养基中，在200r/min，30℃恒温震荡培养48h后将培养液以2％(v/v)转移至以2mmol/L C6-HSL为唯一碳源的基本培养基中(配方如表1所示，配方中的1000×微量元素配方如表2所示)，在200r/min，30℃恒温震荡富集培养24h。

表1

表2

(2)用无菌水将步骤(1)培养液稀释100倍后涂布到LB琼脂平板上，在30℃下恒温培养48h，挑取不同形态菌落进行分离纯化。

(3)将形态完整的单菌落分别接种到LB培养基中，在200r/min，30℃震荡培养24h，用新鲜LB稀释至OD600＝1.0，加入10μmol/L C6-HSL后在200r/min，30℃震荡培养，在5h、10h时分别取500μL培养液，在8000r/min，5min离心，收集取上清液，将上清液放入95℃恒温水浴锅灭活5min，待冷却后于-20℃冷冻保存。

(4)28℃下培养报告菌株VIR24于LB培养基中24h，稀释菌液到OD600＝0.1备用。将含10、5、2.5、1.25、0.625μmol/L C6-HSL的标准样品(由C

(5)将步骤(3)获得的样品分别加10μL至1mL上述VIR24菌液中，重复上述步骤(4)中的步骤，530nm下测样品的吸光值，根据标准曲线计算样品中C6-HSL的含量，筛选AHL淬灭能力最强的菌株。各分离株在5h、10h时对C6-HSL的降解情况如图1所示。由图1可知：与C6-HSL共同培养5h后，JL5将C6-HSL从初始的10μmol/L降低至1.2μmol/L，降解率达88％，而其他分离株SZU83、SZU18、XM19、FF19和SZU68降解了约40％-50％的C6-HSL；培养10h后，JL5几乎完全降解体系中的C6-HSL，SZU18和SZU68的降解量达到70％；SZU83、XM19、FF19的降解量分别为60％、58％和68％，对C6-HSL的分解能力弱于JL5、SZU18和SZU68。不加任何菌株C6-HSL对照样中，经过10h的培养后C6-HSL的含量略微下降，信号分子的自然降解率大约为10％。

上述结果表明JL5具备较强的AHL信号分子降解能力(10h时已基本将培养液中的C6-HSL完全降解)。

(6)对筛选出的菌株分别进行形态学、生理生化和分子生物学分析，确定种属信息，鉴定获得所述调控群体感应淬灭的代尔夫特菌JL5菌株。

实施例2

对实施例1筛选得到的菌株进行形态学观察，对其进行革兰氏染色并在显微镜下观察，如图2所示，由图可知：菌株在LB琼脂平板上菌落边缘整齐，表面光滑，为不透明的淡黄色菌落，革兰氏染色呈阴性。

对其进行扫描电镜观察，如图3所示，由图可知：菌株呈杆状，菌体长度约为2.6-3.1μm，宽度约为0.6-0.8μm。

实施例3

对实施例1筛选得到的菌株进行生理生化特性鉴定实验，结果显示：葡萄糖氧化发酵试验、柠檬酸盐试验、过氧化氢酶试验为阳性；M.R试验、吲哚试验、V.P试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、乙酰甲基甲醇试验为阴性。

实施例4

对实施例1筛选得到的菌株进行16S rDNA分子生物学鉴定。用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取细菌基因组DNA，使用一对通用引物27F(5-AGATTTGATCCTGGCTCAG-3)和1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)扩增细菌的16S rDNA基因。纯化PCR产物并测序(上海生工)，测序结果通过NCBI的BLAST进行序列识别，再与GenBank数据库中的序列进行比对，获得相关物种信息。结果显示其与戴尔福特菌属的Delftialacustris的同源性为99.93％，鉴定其为Delftia sp.。

其16S rDNA碱基序列如下：

TGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGGTCTTCGGACGCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCAGTCGTGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTAGCTAATACCGCATACGATCTGAGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCGATTGGAGCGGCCGATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGGGATAAAAGCTTACCAAGCCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGCAGGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACTGCTTTTGTACGGAACGAAAAAGCTCCTTCTAATACAGGGGGCCCATGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTATGTAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGCATGGCTAGAGTACGGTAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAATCCCCTGGACCTGTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGGAATTAGTTTTCTCAGTAACGAAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCCACCTTTGACATGGCAGGAAGTTTCCAGAGATGGATTCGTGCTCGAAAGAGAACCTGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACATTCAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATAGGTGGGGCTACACACGTCATACAATGGCTGGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCATAAAACCAGTCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTCTCGCCAGAAGTAGGTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTACCACGGCGGGGTTCGTGACTGGGGTGAAGTCGTA。

根据以上生理生化特征结果结合菌落形态特征及个体形态特征结果、分子生物学鉴定结果，最终可以确定为代尔夫特菌。

实施例5

本实施例对菌株JL5的细菌生物膜抑制能力进行评价，操作如下：

通过菌株JL5与QS菌在生物膜发育过程中的物种间相互作用，评价菌株JL5对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响。在实验之前，菌株在10mL LB培养基中30℃，200rpm培养24h。用分光光度计定量细胞密度，并稀释到OD

试验分为单菌生物膜组(即单独的JL5菌和铜绿假单胞菌单独培养时的生物膜形成情况)：在24孔板中加入900μL LB培养基和100μL细菌稀释液；以及双菌生物膜组(即单独的JL5菌和铜绿假单胞菌混合培养时的生物膜形成情况)：在24孔板中加入900μL LB培养基和50μL JL5菌稀释液以及50μL铜绿假单胞菌稀释液。以无菌LB培养基作为阴性对照。

生物膜在30℃无搅拌条件下生长。24h后取出，PBS缓冲液洗涤2次。生物膜用每孔1500mL浓度为0.1％的结晶紫溶液染色15min。然后用去离子水冲洗2次，风干。生物膜层在每孔中加入1500mL 30％乙酸溶解，25℃下孵育15min。在550nm处测定吸光度。结果如图4所示，由图4可知：JL5形成生物膜的能力较弱，而PAO1在单独培养时具有极强的生物膜形成能力，而JL5的加入将PAO1生物膜形成量分别降低了57％，说明JL5对PAO1的生物膜形成有显著的抑制能力。

实施例6

本实施例对菌株JL5进行AHL断链恢复试验，操作如下：

AHL可通过内酯酶和酰化酶降解，但AHL内酯酶水解后会在特定的条件下(酸性)发生逆反应，因此，产内酯酶的细菌在实际操作中可能存在效率较低的问题，目前大多数研究都属于内酯酶类，而为了确认本发明所涉及的菌株JL5是一种产酰基转移酶的细菌，进行如下试验。

将分离的JL5菌株接种到30mL LB培养基中在30℃，200rpm培养24h，然后4℃，6000rpm离心10min。上清液使用0.22μm的针式滤头进行过滤，沉淀重悬于等体积Tris-Cl缓冲液中(50mM，pH 7.0)。然后分别加入N-辛酰基高丝氨酸内酯(C8-HSL，购于Sigma，M.W：227.30，CAS：147852-84-4，货号为44558)(200nM)，在不同时间(1h、2h、3h、4h)进行取样。

将180μL上述各样品与20μL 1M HCl混合，在4℃下孵育48h后，向每个样品中添加40μL 1M磷酸盐缓冲液(pH 7)进行中和，加样10μL至A136琼脂平板进行观察。使用红球菌BH4(一种产内酯酶的淬灭细菌)降解样品作为对照，结果如图5所示，JL5中的C8-HSL结构没有恢复，酰基链发生不可逆的断裂；而BH4为已知产内酰胺酶的QQ细菌，在降解修复实验中检测到C8-HSL。表明这两株QQ细菌所产生的酶类不同(分别是内酰胺酶和酰基转移酶)，因此菌株JL5为产生酰化酶菌株，而关于代尔夫特菌属产生的酶类型属于酰化酶在Maisuria等(Maisuri et al，2015)的研究也得到了验证。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种调控群体感应淬灭的代尔夫特菌及其分离方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。