天山根瘤菌群体感应调控蛋白MrtR与百脉根根瘤菌MrlI1/MrlR1群体感应调控体系的功能研究

摘要

群体感应体系是细菌调控基因表达的重要调控方式，在根瘤菌与植物的相互作用过程中，群体感应体系发挥着重要作用。在革兰氏阴性细菌中，群体感应体系由自体诱导物（AI）分子，自体诱导物合成酶以及自体诱导物受体蛋白组成。本研究通过对天山根瘤菌MrtR蛋白结构与功能的关系以及百脉根根瘤菌MrlI1/MrlR1群体感应体系的研究，探讨群体感应体系在根瘤菌与植物共生过程中的作用。
　　 天山根瘤菌HMZ0菌株的培养上清液浓缩物进行电喷雾电离质谱(ESI-MS/MS)分析可知，天山根瘤菌主要合成2种AHL分子，进行公式计算并同时结合根癌农杆菌R10(pCF218)菌株产生的AHLs作为对照，推测这2种AHLs分子分别是3-oxodocecanoyl-HSL(3-O-C12-HSL MW300)和3-oxotetradecenoyl-HSL(3-O-C14-HSLMW326)。而当MrtR蛋白与3-O-C12-HSL结合后，既可在体内诱导mrtI基因的表达，也可以在体外与mrtI基因的启动子区域结合。
　　 为研究MrtR蛋白的性质，把mrtR基因克隆到表达载体pET28，得到受T7启动子调控的His-MrtR融合蛋白表达质粒pMH61。把表达质粒转入大肠杆菌BL21λDE3,表达蛋白经过Ni+柱纯化后，对His-MrtR蛋白性质进行研究发现，His-MrtR蛋白在不与天山根瘤菌自体诱导物（MAI）结合的条件下，仍然可以以可溶性蛋白存在，这与其它一些典型的LuxR类蛋白有着明显的区别。对MrtR蛋白与mrtI基因的调控方式研究发现，只有当MrtR-MAI与mrt box结合后，mrtI基因才可以被转录和表达，这说明MrtR与MAI的作用，及其与mrt box的结合是mrtI基因表达所必需的。
　　 对MrtR蛋白进遗传学分析其结构与功能的关系发现，当MrtR蛋白氮端前50个氨基酸缺失后，对mrtI基因的诱导调控功能没有改变，而且当缺失40或50个氨基酸后，MrtR(△2-50)蛋白具有不依赖于MAI的调控作用，能在不含有MAI的条件下诱导mrtI的表达，而当加入MAI分子后，其诱导能力相当于野生型的2倍多。这可能是因为在40-50区域内的某些氨基酸缺失后，改变了MrtR蛋白的结构，使其表现出不依赖于MAI的蛋白活性.
　　 当MrtR缺失氮端80,120和140个氨基酸时，MrtR对mrtI的诱导调控功能完全丧失，推测这可能是由于当这些氨基酸缺失后，MrtR的蛋白结构被严重的改变所致。MrtR(△2-160)突变子尽管在加入MAI的条件下，对mrtI的诱导能力只是野生型的20％，但这与其在没有MAI的条件下的诱导能力相当，也就是MrtR(△2-160)突变子也表现出不依赖于MAI的诱导能力，推测这与LuxR-type蛋白的结构特点有关，即其氮端结构域与碳端结构域的结构与功能相对独立。而当MrtR蛋白羧基末端40个氨基酸被缺失后，蛋白功能几乎完全丧失，这也跟多数LuxR类蛋白结构类似，说明MrtR蛋白具有典型的LuxR类蛋白结构特征。
　　 为研究MrtR蛋白关键氨基酸的功能，利用大肠杆菌XL1 Red菌株，构建得到mrtR基因突变子文库，以LacZ作为报告基因筛选得到11株具有不同的突变位点的突变株，在自体诱导物不存在的条件下，都可以诱导mrtI基因的表达，即其MrtR蛋白活性均表现出的不依赖于与天山根瘤菌自体诱导物分子（MAI）的作用。与LuxR和TraR蛋白的同源比较发现，发生在氮端结构域的突变位点(V105A, G114S, M135I和H142R)位于蛋白的AI结合位点结构域附近，而S6L和R182C这两个位点则位于与蛋白形成二聚体相关的氨基酸序列附近，这些位点的突变有可能改变了蛋白与MAI分子的相互作用，从而使得MrtR蛋白在MAI分子不存在的条件下，仍然具有诱导mrtI基因表达的功能。在碳端结构域的突变位点（N204, P208, H219, T221和Y227）推测都是位于负责与DNA结合的HTH结构域周围，这些位点的突变可能影响蛋白与DNA的结合效率，从而提高蛋白的活性。对其中一个突变子MrtR G114S进行凝胶阻滞分析发现，在没有自体诱导物分子存在的条件下，该突变子仍然能与mrtI基因的启动子区域在体外结合。这说明这些突变株的表型特征是受其基因型的改变而产生的.
　　 本论文的第二部分是对百脉根根瘤菌NZP2213菌株的群体感应系统的研究，利用电喷雾电离质谱( ESI-MS/MS)的方法对百脉根根瘤菌自体诱导物分子进行分析得知，百脉根根瘤菌能合成4种自体诱导物分子，进行公式计算后，推测出这4种AHL分子分别是3-Oxohexanoyl-homoserine lactone(3-O-C6-HSL, MW214), Octanoyl-HSL(C8-HSL, MW228), decanoyl-HSL(C10-HSL, MW256)和docecanoyl-HSL(C12-HSLMW282)。通过研究百脉根根瘤菌MrlI1/MrlR1群体感应体系发现，MrlI1负责合成一种碳链长度较长的AHL分子，结合ESI-MS/MS方法，推测该种AHL分子为C12-HSL。
　　 百脉根根瘤菌MAFF30399菌株的基因组全序列已经公布，参考mlr5638和mlr5637基因的序列，设计引物，利用PCR的方法扩增得到百脉根根瘤菌NZP2213的mrlIl和mr lR1基因。通过基因序列分析发现，mrlIl和mr lR1基因与mlr5638和mlr5637基因的氨基酸序列同源性分别为95％和92％。在大肠杆菌中异源表达mrlIl发现，mrlI1在大肠杆菌中也可以合成自体诱导物分子，而且通过薄层层析(TLC)分析表明mrlIl在大肠杆菌中合成的自体诱导物分子与其在根瘤菌中合成的分子相似.
　　 对mrlIl的表达调控方式分析发现，mrlIl的表达依赖于其自身合成的AHL分子和MrlR1的共同作用，并表现出典型的群体感应调控方式，即其表达与细菌的浓度相关，当细菌生长达到一定阈值时，mrtI的表达表现出明显的提高。而且，当MrlI1/MrlR1群体感应体系突变后，突变株在与植物结瘤的前期结瘤数量表现出明显的减少，推测MrlI1/Mr1R1群体感应体系影响到百脉根根瘤菌与植物之间的结瘤效率。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1.1 根瘤菌中的信号传导

1.1.1 根瘤菌与豆科植物的相互作用

1.1.2 定性根瘤与不定性根瘤

1.2 细菌中的群体感应体系

1.2.1 革兰氏阴性细菌中的群体感应体系

1.2.2 革兰氏阳性细菌中的群体感应体系

1.2.3 AI-2群体感应信号因子

1.3 群体感应体系在植物与微生物相互作用过程中的调控功能

1.3.1 根癌农杆菌中的群体感应体系的研究概述

1.3.2 根瘤菌中的群体感应体系功能研究概述

1.4 AHL类自体诱导物合成酶的结构与功能

1.4.1 AHL分子的合成机理

1.4.2 AHL分子合成酶的结构以及功能

1.4.3 中慢生型百脉根根瘤菌自体诱导物合成酶基因分析

1.5 LuxR类自体诱导物受体蛋白的结构与功能

1.5.1 LuxR类蛋白的结构特点

1.5.2 LuxR类蛋白的调控功能

1.5.3 抑制LuxR类蛋白的作用因子

第二章 中慢生型天山根瘤菌群体感应调控蛋白MRTR功能分析

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 中慢生型天山根瘤菌自体诱导物分子结构的初步鉴定

2.3.2 天山根瘤菌群体感应体系MRTR/PMRTI-LACZ检测体系在大肠杆菌MC4100中的建立

2.3.3 带有组氨酸标签的调控蛋白HIs6-MRTR在大肠杆菌中的融合表达与纯化

2.3.4 HIs TAG-MRTR蛋白结合MRTI基因启动子区的分析

2.4 本章小结

第三章 天山根瘤菌MRTR蛋白的关键氨基酸的结构与功能研究

3.1 前言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 天山根瘤菌MRTI/MRTR群体感应缺失突变株构建

3.3.2 MRTR蛋白氮末端氨基酸缺失突变株的构建

3.3.3 MRTR蛋白氮末端氨基酸缺失对MRTR蛋白功能的影响

3.4 不依赖于MAI的MRTR组成型突变子的筛选及功能分析

3.5 本章小结

第四章 中慢生型百脉根根瘤菌MRLI1/MRLR1群体感应体系的研究

4.1 前言

4.2 实验材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 中慢生型百脉根根瘤菌合成自体诱导物的生物检测及其分子结构的初步鉴定

4.3.2 百脉根根瘤菌MHL0中自体诱导物合成酶与调控蛋白基因的克隆与功能分析

4.3.3 百脉根根瘤菌MRLI1基因缺失菌株MHL1的构建

4.3.4 百脉根根瘤菌MRLR1基因突变株MHL2的构建

4.3.5 百脉根根瘤菌MRLI1/MRLR1基因表达调控的研究

4.3.6 调控蛋白MRLR1的功能分析

4.3.7 百脉根根瘤菌MRLI1/MRLR1群体感应体系对共生关系的影响

4.4 本章小结

第五章 全文总结

参考文献

附录一 MTIANSHANENSE3306的AHLs质谱分析图

附录二 文中所用缩写

附录三 文中所用的试剂和培养基配方

附录四 攻读博士学位期间发表的论文

致谢