一种内源性糖皮质激素的检测方法及其应用

摘要

本发明属于分析化学技术领域，更具体的，本发明涉及一种内源性糖皮质激素的检测方法及其应用，所述内源性糖皮质激素的检测方法包括：尿液样本中几种内源性糖皮质激素的提取条件优化、质谱检测流程建立以及运动训练样本人群值分析。本发明提出的内源性糖皮质激素的检测方法所得到的LOD为0.1ng/mL，LOQ为1ng/mL，提取回收率大于87％，基质效应、精密度、准确度均在±15％以内。本发明提出的方法足以满足日常检测需求，同时在实际样本检测时能够实现高通量样本前处理，节省时间成本，减小人为操作误差，提高重现性和稳定性。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，更具体的，本发明涉及一种内源性糖皮质激素的检测方法及其应用。

背景技术

糖皮质激素(GC)是机体内极为重要的一类调节分子，它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要调节作用，是机体应激反应最重要的调节激素，也是临床上使用最为广泛而有效的抗炎和免疫抑制剂。在紧急或危重情况下，糖皮质激素往往为首选。临床常见的糖皮质激素类药物有泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松等，具有抗毒、抗过敏、抗休克、非特异性抑制免疫及退热作用等多种作用，可以防止和阻止免疫性炎症反应和病理性免疫反应的发生，对任何类型的变态反应性疾病几乎都有效。几种常见的糖皮质激素类药物结构如下：

另外，临床研究表明，糖皮质激素类物质能够有不同程度的抗炎、损伤修复作用，能够增强运动耐力和爆发力，提升运动成绩，因此它被世界反兴奋剂机构(WADA)列为兴奋剂，禁止运动员使用。目前，各国实验室利用LC-MS、GC-MS、液相色谱、气相质谱等检测手段对尿液、唾液和血浆等基质进行定性定量分析。但是由于可的松和氢化可的松是内源性的，自然存在于人体当中，并且其浓度水平依赖于不同体质、年龄、种族以及运动项目等，在进行方法确认时无法实现统一的阈值建立。基于此，化学家们从其代谢产物角度出发，典型代表为泼尼松和泼尼松龙，由于代谢产物的浓度更依赖于母体浓度，且在短时间内不会出现太大波动，因此，可以通过对这两种物质的监控，保障运动竞技的公平公正。目前国际反兴奋剂机构的官方文件对于泼尼松和泼尼松龙的浓度要求是不超过60ng/ml，如果检测浓度在30-60ng/ml之间，此时需要使用同位素比质谱法对其来源进行进一步的明确，如果确认为自身产生的属于内源性来源，如果测定结果显示外部引入，那么就会定性为违反反兴奋剂规定，会产生一定的禁赛处罚。因其具有一定的调节运动极限能力以及疾病治疗功效，关于糖皮质激素的合成、检测以及进一步的应用研究受到广泛关注。然而，现有的糖皮质激素检测的灵敏度差，定量限高，不能适用不同种族、不同年龄、不同体质人群的检测。

发明内容

针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种内源性糖皮质激素的检测方法，包括下面步骤：

(1)糖皮质激素的提取：取生物液于容器中，加入内标物、酸化试剂以及酶，于50-60℃酶解1-3h；酶解结束后加入碱液、醚类物质震荡、离心，离心结束后，取上清液，N

(2)对待检测液进行液相色谱、质谱检测，分析，即得。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述碱液选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中一种或多种。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述碱液为碳酸氢钠和碳酸钠，碱液的pH为9-10。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述醚类物质的碳原子数为4-8。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述醚类物质和碱液的体积比为(70-90)：1。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述生物液和内标物的体积比为(8-12)：1。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述提取液为水和乙腈。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述水和乙腈的体积比为(2-6)：1。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述液相色谱检测中，液相色谱柱选自反向C18、T3、F5色谱柱中任一种。

本发明第二个方面提供了一种所述内源性糖皮质激素的检测方法在尿液、唾液、血浆中定量检测糖皮质激素的应用。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

(1)本发明提出的内源性糖皮质激素的检测方法，选择性良好，基质中其他物质不会对内源性糖皮质激素(可的松、氢化可的松、泼尼松以及泼尼松龙)的测定进行干扰，四种混合糖皮质激素(氢化可的松、可的松、泼尼松、泼尼松龙)的LOD和LOQ分别为0.1ng/mL和1ng/mL。基质效应为84.35-97.68％；提取回收率均大于87％；日内精密度均小于7.8％；日间精密度均小于5.71％；准确度为93.59-107.71％，该方法学验证结果足以满足日常检测需求，同时在实际样本检测分析时能够实现自动化处理，可以将整个流程设置的自动化程度高一些，能够实现进行流水线操作，节省时间成本，减小人为操作误差，提高重复性和稳定性。

(2)本申请中控制碱液为碳酸氢钠和碳酸钠，且pH为9.5，方便后期离心效果，离心结束后取上清液容易。

(3)通过控制醚类物质为甲基叔丁基醚，且与碱液的体积比为(70-90)：1，得到的待检测液在随后的液相色谱、质谱检测分析时不受不同种族、不同年龄、不同体质人群的限制。

附图说明

图1为本发明实施例1绘制得到的氢化可的松的标准曲线图；

图2为本发明实施例1检测得到的氢化可的松的定量、定性选择离子色谱图；

图3为本发明实施例1绘制得到的可的松的标准曲线图；

图4为本发明实施例1检测得到的可的松的定量、定性选择离子色谱图；

图5为本发明实施例1绘制得到的泼尼松的标准曲线图；

图6为本发明实施例1检测得到的泼尼松的定量、定性选择离子色谱图；

图7为本发明实施例1绘制得到的泼尼松龙的标准曲线图；

图8为本发明实施例1检测得到的泼尼松龙的定量、定性选择离子色谱图；

图9为本发明实施例1氢化可的松检出限浓度的检测谱图；

图10为本发明实施例1氢化可的松定量限浓度的检测谱图；

图11为本发明自动化检测仪器图；

图12为运动前后可的松浓度变化图；

图13为运动前后氢化可的松浓度变化图；

图14为运动前后泼尼松浓度变化图；

图15为运动前后泼尼松龙浓度变化图。

具体实施方式

本发明实现了一种检测技术的创新，具体实现过程依托以下关于四种具体糖皮质激素实施例，进行详细说明。实施本发明所提到的过程、条件、实验、方法学验证等内容，除以下专门提及的信息之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制。

本发明第一个方面提供了一种内源性糖皮质激素的检测方法，包括下面步骤：

(1)糖皮质激素的提取：取生物液于容器中，加入内标物、酸化试剂以及酶，于50-60℃酶解1-3h；酶解结束后加入碱液、醚类物质震荡、离心，离心结束后，取上清液，N

(2)对待检测液进行液相色谱、质谱检测，分析，即得。

在一种实施方式中，所述碱液选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中一种或多种。

优选的，所述碱液为碳酸氢钠和碳酸钠，碱液的pH为9-10；更优选的，所述碱液的pH为9.5。

本申请中控制碱液为碳酸氢钠和碳酸钠，且pH为9.5，方便后期离心效果，离心结束后取上清液容易。

在一种实施方式中，所述醚类物质的碳原子数为4-8。

优选的，所述醚类物质的碳原子数为5；更优选的，所述醚类物质为甲基叔丁基醚。

在一种实施方式中，所述醚类物质和碱液的体积比为(70-90)：1。

优选的，所述醚类物质和碱液的体积比为80：1。

本申请通过控制醚类物质为甲基叔丁基醚，且与碱液的体积比为(70-90)：1，得到的待检测液在随后的液相色谱、质谱检测分析不受不同种族、不同年龄、不同体质人群的限制。

在一种实施方式中，所述生物液和内标物的体积比为(8-12)：1。

优选的，所述生物液和内标物的体积比为10：1。

在一种实施方式中，所述提取液为水和乙腈。

优选的，所述水和乙腈的体积比为(2-6)：1；更优选的，所述水和乙腈的体积比为4：1。

在一种实施方式中，所述酸化试剂为磷酸盐缓冲液。

优选的，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液，所述磷酸盐缓冲液的pH为6-6.9；更优选的，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合溶液，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.75。

在一种实施方式中，所述生物液和酸化试剂的体积比为(1-3)：1。

优选的，所述生物液和酸化试剂的体积比为2：1。

在一种实施方式中，所述生物液和酶的体积比为(18-22)：1。

优选的，所述生物液和酶的体积比为20：1。

在一种实施方式中，所述上清液和提取液的体积比为(10-15)：1。

优选的，所述上清液和提取液的体积比为12：1。

在一种实施方式中，所述步骤(1)包括：取生物液于容器中，加入内标物、酸化试剂以及酶，混合均匀，于50-60℃酶解1-3h；酶解结束后加入碱液、醚类物质以2000-3000rpm转速震荡1-5min，在1-5℃，转速为10000-15000rpm离心10-20min，离心结束后，取上清液，N

在一种优选的实施方式中，所述步骤(1)包括：取生物液于容器中，加入内标物、酸化试剂以及酶，混合均匀，于55℃酶解2h；酶解结束后加入碱液、醚类物质以2500rpm转速震荡3min，在4℃，转速为13000rpm离心15min，离心结束后，取上清液，N

本发明所述酶不作特别限制，本领域技术人员可作常规选择。

在一种实施方式中，所述酶为葡萄糖醛酸甙酶。

本申请所述葡萄糖醛酸甙酶使得与葡萄糖结合的糖皮质激素水解完全，使其全部以游离态的形式存在。

本申请所述内标物为糖皮质激素的内标物。

在一种实施方式中，所述液相色谱检测中，液相色谱柱选自反向C18、T3、F5色谱柱中任一种。

优选的，所述液相色谱柱为T3色谱柱。

本申请所述色谱柱均购自waters公司生产。

在一种实施方式中，在液相色谱检测中，流动相A为水和甲酸。

优选的，所述水和甲酸的体积比为(900-1100)：1；更优选的，所述水和甲酸的体积比为1000：1。

在一种实施方式中，在液相色谱检测中，流动相A还包括乙酸铵。

优选的，所述乙酸铵在流动相A中的浓度为0.8-1.2M；更优选的，所述乙酸铵在流动相A中的浓度为1M。

在一种实施方式中，在液相色谱检测中，流动相B为乙腈。

本申请通过控制特定的流动相A以及流动相B，可以得到较低的检出限和定量相，扩大了该检测方法的适用性。

在一种实施方式中，在液相色谱检测中，液相分离梯度为梯度洗脱，洗脱时间为5-10min。

优选的，所述洗脱时间为8min。

在一种实施方式中，在液相色谱检测中，流动相流速为0.1-0.5mL/min。

优选的，所述流动相流速为0.3mL/min。

在一种实施方式中，在液相色谱检测中，柱温为10℃-45℃。

优选的，所述柱温为40℃。

在一种实施方式中，在液相色谱检测中，进样量5μl，分析时间8min。自动进样器保持在10℃。

在一种实施方式中，梯度洗脱条件为：0～1min，20vol％B；1～4min:20→70vol％B；4～5.5min，70→95vol％B；5.5～6.2min，95vol％B；6.2～6.3min，95％→20vol％B；6.3～8min，20vol％B。

在一种实施方式中，质谱检测条件为：电喷雾离子源采用正离子模式(ESI+)；毛细管电压：4000V；离子源温度为350℃；干燥气流速6L/min；雾化气：45psi；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。

实施例

在下文中，通过实施例对本发明进行更详细地描述，但应理解，这些实施例仅仅是示例的而非限制性的。如果没有其它说明，下面实施例所用原料都是市售的。

本发明的实施例1提供了一种内源性糖皮质激素的检测方法，具体如下：

(1)糖皮质激素的提取：

取200uL尿液，加入20μL内标物，100μL磷酸缓冲盐溶液(PBS)以及10μL酶，混合均匀，于水浴55℃下酶解2h；酶解结束，加入10μL碱液，800μL甲基叔丁基醚，震荡(2500rpm转速)3min；接着离心15min，离心温度4℃，转速13000rpm，取上清600μL，N

(2)液相色谱检测：

对步骤(1)得到的尿液检测样本进行液相色谱检测，条件如下：

液相色谱柱为Waters T3色谱柱(2.1×100mm,1.8μm)；柱温40℃；流动相A为(水，含1M乙酸铵和0.1vol％甲酸)和B相(乙腈)组成。梯度洗脱；流速0.3mL/min；柱温：40℃；进样量5μL，分析时间8min。自动进样器保持在10℃。梯度洗脱条件为：0～1min，20％B；1～4min，20→70％B；4～5.5min，70→95％B；5.5～6.2min，95％B；6.2～6.3min，95％→20％B；6.3～8min，20％B。

(3)质谱检测：

对步骤(1)得到的尿液样本检测液进行质谱检测分析，条件如下：

电喷雾离子源采用正离子模式(ESI+)；毛细管电压：4000V；离子源温度为350℃；干燥气流速6L/min；雾化气：45psi；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。

图2为检测得到的氢化可的松的定量、定性选择离子色谱图；图4为检测得到的可的松的定量、定性选择离子色谱图；图6为检测得到的泼尼松的定量、定性选择离子色谱图；图8为检测得到的泼尼松龙的定量、定性选择离子色谱图。

通过比较空白尿样加糖皮质激素内标和纯水中糖皮质激素内标中的峰保留时间和各离子对的相对丰度比值来判断是否为同一物质，结果表明尿液中其他物质不会对糖皮质激素内标的检测造成干扰，说明本发明提供的检测方法能够满足日常检测中的选择性要求。

标准曲线的绘制：

分别配制1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL,10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，250ng/mL，300ng/mL。母液为1mg/ml的糖皮质激素甲醇溶液，梯度稀释过程配制所用的溶剂为甲醇。对各浓度样本进行LC-MS测定，得出的数据以浓度X(ng/mL)为横坐标，目标物峰面积和内标峰面积比值Y为纵坐标，做线性回归，自动处理求得回归方程和相关系数。R

检出限和定量限测试：

最低检出限通过信噪比法(S/N≥3)进行浓度确认；定量限需要完成精密度和准确度，同时满足信噪比法(S/N>10)的最低检测浓度。图9为氢化可的松检出限浓度的检测谱图，图10为氢化可的松定量限浓度的检测谱图。

本发明得到的LOD为0.1ng/mL，LOQ为1ng/mL。与调研的文献最低定量限60ng/mL相比，本发明提出的检测方法体现了超高的灵敏度，完全可以满足日常检测要求。

精密度、准确度测试：按照本实施例中标准曲线的制备过程中方法配制糖皮质激素稀释溶液，配制浓度为高(250ng/mL)、中(20ng/mL)、低(1ng/mL)的溶液，平行10份进行本实施例中前处理并进行检测分析，以单天每种浓度样品的相对标准偏差(RelativeStandard Deviation，RSD)作为日内精密度。连续2天配制高、中、低三种浓度，每个浓度点10个重复质控样品进行检测，计算每种浓度样品的RSD作为日间精密度。以质控样品的浓度平均值与添加浓度的百分比为准确度。精密度和准确度的标准是RSD在LOQ附近是在±20％以内，高于LOQ的在±15％以内。其精密度和准确度如下表所示：

回收率和基质效应测试：按照本实施例中标准曲线的制备过程中方法配制糖皮质激素稀释溶液，配制浓度为高(250ng/mL)、中(20ng/mL)、低(1ng/mL)浓度的尿样，平行3份进行前处理并进行检测分析。

第1组：取3组空白尿样，每组6个，分别加入高(250ng/mL)、中(20ng/mL)浓度的标样和一定量内标，按照本实施例前处理方法进行处理和检测分析，测得响应值A。

第2组：取3组空白尿样，每组6个，按照前处理方法进行处理，在酶解后，分别加入高(250ng/mL)、中(20ng/mL)浓度的标样和一定量内标，然后吹干、复溶、检测分析。测得响应值B。

第3组：直接用水配制成与上面四种相同浓度溶液直接进样，测得响应值C。

根据以下公式计算：提取回收率＝A/B×100％，基质效应＝B/C×10％。

最终检测得到的基质效应为；提取回收率大于87％，满足验证方法的要求。

按前处理方法进行处理，用于评估提取回收率和基质效应。直接用水配制上述浓度的标准品溶液，将其峰面积视作为A；用六个不同来源的空白尿液基质分别加入高(250ng/mL)、中(20ng/mL)浓度的标样，按照前处理方法处理和检测分析，测得响应值为B；使用六种不同人的空白尿液并加入相同浓度的标准品，进行检测，分析结果如下。

自动化检测实际尿液样本：结合目前人工智能趋势，可以将整个流程设置的自动化程度高一些，能够实现进行流水线操作，节省时间成本，减小人为操作误差，提高重复性和稳定性。通过对进行运动训练的人员的收集，完成运动前后两批实际样本的检测，图12为运动前后可的松浓度变化图，图13为运动前后氢化可的松浓度变化图，图14为运动前后泼尼松浓度变化图，图15为运动前后泼尼松龙浓度变化图，分析得到的结果为可的松的体内含量在2.1-124.6ng/mL，平均值为53.69ng/mL；氢化可的松的体内含量为0.37-72.37ng/mL，平均值为20.92ng/mL；泼尼松的体内含量范围是0.16-8.88ng/mL，平均值为2.71ng/mL；泼尼松龙的体内含量范围是0-1.64ng/mL，平均值为0.37ng/mL。作为进一步的代谢产物泼尼松和泼尼松龙，其在体内浓度含量是比较低的，因此，国际反兴奋剂机构规定二者的测定含量高于60ng/ml即确定为阳性(阳性即说明运动员违反反兴奋剂规定，为达到提升运动效果，使用相关违禁药品)。

图11为自动化检测仪器图，其工作原理是：使用时，使用编程程序对所需的操作步骤进行定义，确认命令后即可开始进行自动化运行状态。通过自动机械臂固定移液枪头完成试剂的添加和样品的转移。混合液转移到振荡器模块之后，命令随后触发震荡模式，完成样本的混合，随后进行加热酶解过程，整个糖皮质激素的提取过程均可通过自动化仪器完成，提高实验的便捷性，机械操作便捷、结果稳定，重复性高。

本发明的实施例2提供了一种内源性糖皮质激素的检测方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5。

可的松标准曲线绘制、检出限、定量限测试方法同实施例1，得到R

本发明的实施例3提供了一种内源性糖皮质激素的检测方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述甲基叔丁基醚的加入量为0。

可的松标准曲线绘制、检出限、定量限测试方法同实施例1，得到R

本发明的实施例4提供了一种内源性糖皮质激素的检测方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述色谱柱为反向C18色谱柱。

可的松标准曲线绘制、检出限、定量限测试方法同实施例1，得到R

本发明的实施例5提供了一种内源性糖皮质激素的检测方法，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述碱液的pH为10.5。

可的松标准曲线绘制、检出限、定量限测试方法同实施例1，得到R

前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。