一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒及制备方法

摘要

本发明涉及氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，试剂R1的各组分及浓度包括：0.8‑3.2g/L的第一缓冲液A、8.8‑24g/L的第一缓冲液B、5.8‑20.0g/L的电解质、0.2‑1.0ml/L的表面活性剂、0.8‑2.0ml/L的防腐剂；试剂R2的各组分及浓度包括：0.5‑2.8g/L的第二缓冲液A、11.5‑23.4g/L的5.8‑20.0g/L的第二缓冲液B电解质、5‑20g/L的助悬剂、0.8‑2.0ml/L的防腐剂、10‑20ml/L的OX‑LDL抗体、10‑20g/L的链霉亲和素以及5‑10g/L的生物素。本发明的优点是：稳定性好、线性范围宽、精密度好。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒及制备方法。

背景技术

心肌纤维化是指心肌细胞外基质(ECM)中胶原纤维过量积聚、胶原浓度显著提高或胶原成分发生改变。它是胶原合成代谢和降解代谢失衡的结果。这种病理变化在肥厚性心肌病、心力衰竭等多种心血管疾病中存在，现认为其与心率失常、新功能障碍甚至心源性猝死密切相关。心肌纤维化是一个复杂的病理过程，长期的压力超负荷、炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等是其主要原因，涉及到神经内分泌系统、免疫系统等。随着人口老龄化的进展，心肌纤维化越来越引起人们的重视，因此发现心肌纤维化危险因素及对其基质的研究预发显得重要。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)在体内由低密度脂蛋白(LDL)经氧自由基氧化而来，它对心血管系统有着广泛影响。

已有的检测氧化型低密度脂蛋白的试剂和检测方法存在着灵敏度和重复性差、准确性低的缺陷，限制了它的应用。因此，应该提供一种新的技术方案解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是：提供一种可明显改善重复性和灵敏度的氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒及制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：

所述试剂R2的各组分及浓度包括：

上述氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

(1)、试剂R1制备

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入第一缓冲液A和第一缓冲液B,搅拌10-20分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到7.00-8.00之间,之后投入电解质，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入表面活性剂和防腐剂，投料完成后，继续搅拌10-20分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，并贴上标识；

(2)、试剂R2制备

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求，边搅拌边投入第二缓冲液A和第二缓冲液B，搅拌10-20分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值到7.00-8.00之间，之后投入电解质，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入助悬剂和防腐剂，投料完成后，继续搅拌10-20分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀；

烧杯中加入生物素于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边加入OX-LDL抗体，搅拌2-4h反应，反应结束后透析去除未结合上的游离抗体，加入链霉亲和素反应2-4h反应结束后透析去除未结合的生物素抗体，最后把链霉亲和素-生物素-OX-LDL抗体加入配液罐中，继续搅拌10-20分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，并贴上标识。

进一步的技术方案：

所述试剂R1中的第一缓冲液A、第一缓冲液B为PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上的混合物。

所述试剂R2中的第二缓冲液A、第二缓冲液B为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、MOPSO缓冲液、Tris缓冲液中的一种或两种以上的混合物。

所述试剂R1、R2中的防腐剂分别为叠氮钠、Proclin-950、Proclin-300、硫柳汞中的一种或两种以上的混合物。

所述试剂R1中的表面活性剂为Tween-20、Tween-80、TritonX-100、CTAB中的一种。

所述试剂R1、R2中的电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中一种或两种以上的混合物。

所述试剂R2中的助悬剂为葡萄糖、D-海藻糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、丙三醇中的一种或两种以上的混合物。

所述生物素结合OX-LDL抗体比例为0.5:1-2:1，链霉亲和素结合生物素-OX-LDL抗体比例为2:1-5:1。

由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的检测试剂中加入了生物素和链霉亲和素，采用级联放大反应，即OX-LDL抗体连接生物素1:0.5，再与链霉亲和素4:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到0.10-8.00μg/ml。

附图说明

图1是未采用级联放大反应的校准品定标曲线图。

图2是采用级联放大反应的校准品定标曲线图。

其中：X轴表示校准品浓度，Y轴表示吸光度。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：

一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：缓冲液、电解质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲液是浓度为0.8g/L的二水合磷酸二氢钠和浓度为16g/L的十二水合磷酸氢二钠的混合液，所述电解质是浓度为5.8g/L的氯化钠，所述表面活性剂是浓度为0.2ml/L的Tween-20，所述防腐剂是浓度为1.5ml/L的Proclin-950。

所述试剂R2包括：缓冲液、电解质、助悬剂、防腐剂、OX-LDL抗体、链霉亲和素和生物素，所述缓冲液是浓度为0.5g/L的二水合磷酸二氢钠和浓度为18g/L的十二水合磷酸氢二钠的混合液，所述电解质是浓度为12g/L的氯化钠，所述助悬剂是浓度为5g/L的蔗糖，所述防腐剂是浓度为2.0ml/L的Proclin-950，所述OX-LDL抗体的浓度为10ml/L，所述链霉亲和素的浓度为10g/L，所述生物素的浓度为5g/L。

以上对氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，

A)、试剂R1制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠,搅拌10分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为7,之后投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入Tween-20和Proclin-950，投料完成后，继续搅拌15分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，并贴上标识；

B)、试剂R2制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求，边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠，搅拌10分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为7.5，之后投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入蔗糖和Proclin-950，投料完成后，继续搅拌10分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀；

烧杯中加入生物素于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边加入OX-LDL抗体，搅拌2h反应，反应结束后透析去除未结合上的游离抗体，加入链霉亲和素反应4h，反应结束后透析去除未结合的生物素抗体，最后把链霉亲和素-生物素-OX-LDL抗体加入配液罐中，继续搅拌20分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，并贴上标识。

实施例2

一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：缓冲液、电解质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲液是浓度为1.6g/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和浓度为8.8g/L的十二水合磷酸氢二钠的混合液，所述电解质是浓度为13g/L的氯化镁，所述表面活性剂是浓度为1.0ml/L的TritonX-100，所述防腐剂是浓度为0.8ml/L的Proclin-300。

所述试剂R2包括：缓冲液、电解质、助悬剂、防腐剂、OX-LDL抗体、链霉亲和素和生物素，所述缓冲液是浓度为1.7g/L的二水合磷酸二氢钠和浓度为11.5g/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸的混合液，所述电解质是浓度为5.8g/L的氯化镁，所述助悬剂是浓度为12g/L的D-海藻糖，所述防腐剂是浓度为0.8ml/L的Proclin-300，所述OX-LDL抗体的浓度为10ml/L，所述链霉亲和素的浓度为15g/L，所述生物素的浓度为5g/L。

以上对氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，

C)、试剂R1制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入4-羟乙基哌嗪乙磺酸和十二水合磷酸氢二钠,搅拌15分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为7.5,之后投入氯化镁，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入TritonX-100和Proclin-300，投料完成后，继续搅拌10分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，并贴上标识；

D)、试剂R2制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求，边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸，搅拌15分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为7，之后投入氯化钠，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入D-海藻糖和Proclin-300，投料完成后，继续搅拌15分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀；

烧杯中加入生物素于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边加入OX-LDL抗体，搅拌3h反应，反应结束后透析去除未结合上的游离抗体，加入链霉亲和素反应2h，反应结束后透析去除未结合的生物素抗体，最后把链霉亲和素-生物素-OX-LDL抗体加入配液罐中，继续搅拌10分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，并贴上标识。

实施例3

一种氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：缓冲液、电解质、表面活性剂和防腐剂，所述缓冲液是浓度为3.2g/L的二水合磷酸二氢钠和浓度为24g/L的十二水合磷酸氢二钠的混合液，所述电解质是浓度为20g/L的氯化钾，所述表面活性剂是浓度为0.6ml/L的Tween-80，所述防腐剂是浓度为2.0ml/L的硫柳汞。

所述试剂R2包括：缓冲液、电解质、助悬剂、防腐剂、OX-LDL抗体、链霉亲和素和生物素，所述缓冲液是浓度为2.8g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸和浓度为23.4g/L的十二水合磷酸氢二钠的混合液，所述电解质是浓度为20g/L的氯化钾，所述助悬剂是浓度为20g/L的葡萄糖，所述防腐剂是浓度为1.4ml/L的硫柳汞，所述OX-LDL抗体的浓度为15ml/L，所述链霉亲和素的浓度为15g/L，所述生物素的浓度为5g/L。

以上对氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，

E)、试剂R1制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠,搅拌20分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为8,之后投入氯化钾，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入Tween-80和硫柳汞，投料完成后，继续搅拌20分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，并贴上标识；

F)、试剂R2制备；

在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求，边搅拌边投入2-(N-吗啡啉)乙磺酸和十二水合磷酸氢二钠，搅拌20分钟至物料完全溶解，溶液清澈透明配液罐底部无沉淀后，调节pH值为8，之后投入氯化钾，待物料完全溶解后再按照上述投料方式依次投入葡萄糖和硫柳汞，投料完成后，继续搅拌20分钟至全部物料完全溶解，溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀；

烧杯中加入生物素于磁力搅拌器上，打开磁力搅拌器电源开关，调节搅拌子至中档转速，使溶液保持中速转动状态，边搅拌边加入OX-LDL抗体，搅拌4h反应，反应结束后透析去除未结合上的游离抗体，加入链霉亲和素反应2h，反应结束后透析去除未结合的生物素抗体，最后把链霉亲和素-生物素-OX-LDL抗体加入配液罐中，继续搅拌15分钟至溶液清澈透明，配液罐底部无沉淀，定容至最终体积，并贴上标识。

下面通过具体的实验，结合表格和曲线图，对本发明氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒的几个重要指标进行说明，具体如下：

1、现有的R2试剂未采用级联放大反应(即OX-LDL抗体未加入生物素和链霉亲和素)。

1.1、定标

使用校准品进行定标，结果如表1所示，定标曲线如图1所示。

表1、校准品定标结果

结论：校准品浓度大于4.00μg/ml时出现hook效应(平台)。

1.2精密度CV检测：

选取待测样本用生理盐水进行稀释，一般为3个浓度水平，分别为：0.92g/L、3.39g/L、7.97g/L每个浓度水平样本重复测定10次。

结论：精密度CV＞6％。

2、本发明的检测试剂的R2试剂采用级联放大反应(即OX-LDL抗体加入生物素和链霉亲和素)。

2.1、定标

使用校准品进行定标，结果如表2所示，定标曲线如图2所示。

表2、校准品定标结果

结论：线性范围可做到0.10-8.00μg/ml。

2.2精密度CV检测：

结论：精密度CV＜3％。

综上，本发明的氧化型低密度脂蛋白的检测试剂盒，在检测试剂中加入了生物素和链霉亲和素，采用级联放大反应，即OX-LDL抗体连接生物素1:0.5，再与链霉亲和素4:1混合反应，可明显改善重复性和灵敏度，线性范围可做到0.10-8.00μg/ml。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进或替换，这些改进或替换也应视为本发明的保护范围。