氧化低密度脂蛋白酶联免疫检测试剂盒的研制

摘要

采用一次性密度梯度离心法从正常人血浆中分离得到的低密度脂蛋白(LowDensityLipoprotein，LDL)经体外Cu2+氧化法制备的氧化LDL(OxidizedLDL，OxLDL)做为免疫原，通过杂交瘤技术构建筛选了可稳定表达特异性高亲和力的抗OxLDL单克隆抗体杂交瘤细胞。分别建立了适用于实验室规模以及生产规模的抗OxLDL单克隆抗体制备方法。并根据双抗体夹心法原理，采用自行构建的抗OxLDL单克隆抗体及酶标记抗载脂蛋白B抗体，建立了OxLDL酶联免疫检测法。方法学研究表明，该法重复性好，准确性高，血浆中的其他脂蛋白及内源性干扰物质不干扰检测反应。根据该法组装的OxLDL酶联免疫检测试剂盒与瑞士Mercodia公司同类产品的各项性能指标均较接近。对该试剂盒临床检测性能的考核评价结果表明该试剂盒与瑞士Mercodia公司同类产品的临床检测性能基本一致，在该试剂盒检测系统下测定的血浆OxLDL含量正常值参考范围为≤45.20U/ml，可疑值范围为36.90U/ml～47.80U/ml，诊断临界值为47.70U/ml，在该诊断临界值下，该试剂盒诊断冠心病的灵敏度为87.50％，特异度为89.89％。 本研究研制的OxLDL酶联免疫检测试剂盒填补了目前国内此方面空白，为测定血浆OxLDL含量提供了一种准确、简便、快捷的方法，也为临床预测冠心病发病危险性、诊断冠心病、判断病变严重程度以及观察疗效、评判预后提供了新的更有效的检查手段。

目录

文摘

英文文摘

引言

1目前常用冠心病诊断手段

2氧化低密度脂蛋白与冠心病的关系

3 OxLDL检测方法

第一部分抗OxLDL单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建

1材料及试剂

2方法

2.1人血浆LDL的制备

2.2 OxLDL的制备

2.3免疫动物

2.4免疫脾细胞的制备及富集

2.5细胞融合

2.6饲养层细胞的制备

2.7抗OxLDL单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选及建株

2.8抗OxLDL单克隆抗体杂交瘤细胞的检定

3结果

3.1人血浆LDL的鉴定

3.2人血浆OxLDL的鉴定

3.3 OxLDL单克隆抗体杂交瘤细胞的筛选

3.4 OxLDL单克隆抗体杂交瘤细胞的检定

4讨论

第二部分抗OxLDL单克隆抗体制备方法的研究

1材料及试剂

2方法

2.1小鼠体内法

2.2体外细胞培养法

3结果

3.1小鼠体内法

3.2体外细胞培养法

4讨论

4.1小鼠体内法

4.2体外细胞培养法

第三部分OxLDL酶联免疫检测法的研究

1材料与试剂

2方法

2.1 OxLDL企业参考标准品的制备

2.2 OxLDL校准品的制备

2.3 HRP标记羊抗人apoB抗体的制备

2.4 OxLDL酶联免疫检测试验

3结果

3.1 OxLDL企业参考标准品稳定性考察

3.2 OxLDL校准品剂量-反应曲线

3.3特异性试验

3.4重复性试验

3.5准确性试验

3.6最低检出量

3.7检测线性

3.8干扰试验

3.9待测血浆样本存放时间及存放条件

3.10 OxLDL酶联免疫检测试剂盒与国外同类产品的性能比较

4讨论

4.1 OxLDL企业参考标准品及OxLDL校准品的制备

4.2 OxLDL酶联免疫检测法

第四部分OxLDL酶联免疫检测试剂盒临床研究

1研究对象

1.1正常组及其他组

1.2冠心病组

2方法

2.1样本的采集与处理

2.2 OxLDL含量测定

2.3血脂、脂蛋白、肝功、肾功及空腹血糖检查

2.4统计方法

3结果

3.1华神试剂盒与Mercodia试剂盒检测的全部受试者血浆OxLDL含量

3.2华神试剂盒与Mercodia试剂盒检测的全部受试者血浆OxLDL含量相关性分析

3.3诊断性试验评价

3.4华神试剂盒检测的血浆OxLDL含量正常值参考范围和可疑值范围的确定

4讨论

4.1华神试剂盒与Mercodia试剂盒检测血浆OxLDL含量的对比研究

4.2华神试剂盒检测的血浆OxLDL含量正常值参考范围和可疑值范围的确 定

总结

参考文献

致谢

博士后期间发表的学术论文

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