EGCG-棕榈酸酯组合物及其使用方法

摘要

提供了经修饰的绿茶多酚组合物及其用于治疗流感病毒的方法。一种示例性的绿茶多酚包括可以在至少一个位置用C1‑C30基团酯化的(‑)‑表没食子儿茶素‑3‑没食子酸酯。所述经修饰的绿茶多酚可用于在不与流感病毒细胞发生接触的情况下预防所述病毒。

说明书

相关申请交叉引用

本申请要求于2018年8月17日提交的美国临时专利申请No.62/764,974的权益和优先权，将其全文以引用方式并入。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在政府支持下完成的，由美国国立卫生研究院资助，基金号为AI124738。政府在本发明中享有一定权利。

技术领域

本发明的方面整体涉及用于治疗和预防流感病毒感染的组合物和方法。

背景技术

流感病毒是高度可传播的人类呼吸道病原体，会导致季节性、地方性感染以及周期性的、不可预测的大流行。它们是人类呼吸道感染的最常见原因。流感病毒是在正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中发现的有被膜的单链负义RNA病毒。存在四个流感病毒属，即甲型流感病毒(Influenzavirus A)、乙型流感病毒(Influenzavirus B)、丙型流感病毒(Influenzavirus C)和丁型流感病毒(Influenzavirus D)。流感病毒感染许多脊椎动物，其中甲型、乙型和丙型流感病毒(IAV、IBV和ICV)感染人类。乙型流感病毒可周期性地引起大的流行病，但不会引起大流行。丙型流感病毒是区域性的，偶尔会引起轻度呼吸道疾病。甲型流感病毒被认为是最重要的人类流感病原体，因为它引起最严重的感染。此外，自十七世纪以来，甲型流感病毒已导致十几起流感大流行。

流行性感冒通常称为流感，是一种急性呼吸系统疾病，表征为突发高烧、咳嗽、头痛、疲劳、肌肉无力和疼痛、喉咙痛以及流涕或鼻塞。流感具有高度传染性，主要通过被感染的个体咳嗽或打喷嚏时所释放的空气传播的呼吸道分泌物传播。潜伏期通常是感染后一到两天，大多数人在一周内开始从症状中自然恢复。

流感病毒的当前治疗策略包括通过接种灭活病毒或减毒活病毒来防止感染，或预防性或治疗性施用抗病毒药物。流感疫苗对健康年轻人的有效率可为70％-90％，而对老年人有效率略有下降。然而，由于流感病毒(尤其是甲型流感)中的持续病毒抗原漂移，一度有效的疫苗可能随着时间的推移而失效。因此，建议患者每年重新接种疫苗。抗病毒药可同时具有治疗效果和预防效果。然而，为了防止感染，必须在流感高发时连续施用。由于需要持续施用，耐药病毒株迅速发展，并在大量患者中出现。流感病毒进化的快速、持续和不可预测的性质使疫苗策略和大流行规划变得困难。因此，有必要对流感病毒采取更有效、无害的治疗和预防措施。

因此，本发明的一个目的是提供用于预防性治疗流感病毒感染的组合物及其使用方法。

本发明的另一个目的是提供用于治疗流感病毒感染的组合物及其使用方法。

发明内容

提供了用于抑制或减少病毒感染的方法和组合物。一个实施方案提供了用于抑制或减少受试者中的病毒感染的方法，所述方法通过如下实现：向所述受试者施用组合物以抑制或减少病毒进入所述受试者的呼吸道上皮细胞，所述组合物含有有效量的绿茶多酚和载体，所述绿茶多酚在至少一个位置用C

在一些实施方案中，该病毒是呼吸道病毒。在其它实施方案中，该病毒是流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒或冠状病毒。

可以将该酯化绿茶多酚配制成药物组合物。例如，可以将该酯化绿茶多酚配制用于递送进上呼吸系统中。示例性的制剂包括鼻制剂、支气管制剂、口服制剂和肺部制剂。在一些实施方案中，将该经修饰的绿茶多酚配制用于局部施用，包括但不限于液体、凝胶、蜡或糊剂。在其他实施方案中，将该组合物配制成气溶胶。气溶胶可以是液体或粉末气溶胶。在一些实施方案中，该组合物含有一种或多种药学上可接受的赋形剂，诸如甘油。该组合物可含有0.01％-20％w/v的酯化绿茶多酚和10％至20％的甘油。

已经发现，该酯化绿茶多酚可以包覆细胞(特别是呼吸道上皮细胞)的表面，并阻断、抑制或减少病毒摄入进被包覆的细胞中。示例性的呼吸道上皮细胞包括但不限于纤毛细胞、杯状细胞、基底细胞、表皮细胞以及它们的组合。通常用该酯化绿茶多酚化合物至少部分地包覆呼吸道上皮细胞以阻断或抑制被包覆细胞摄入病毒。

附图说明

图1是示出了通过直接与EC16接触进行的H1N1暴露的病毒灭活测试的结果的图。通过与H1N1病毒混合1分钟，然后进行MDCK感染和TCID50测定，测试了两种浓度的载体(10％和20％)中的两种浓度(0.01％和0.1％)的EC16。使用10％载体中的0.01％和0.1％EC16和20％载体中的0.1％EC16进行了三个重复实验；单独测试了20％载体中的0.01％EC16，并对10％载体中的0.1％EC16进行了另外三个重复测试(空心符号)。示出了平均分对数转换的百分比值(大的水平条)和标准偏差(小的水平条)。

图2是示出了MDCK细胞的EC16预处理对病毒滴度的作用(预防作用)的图。将MDCK细胞单层与EC16处理物一起温育1小时，然后将游离的EC16洗掉，并将细胞暴露于病毒1小时，然后进行TCID50测定法。示出了来自两组实验的合并数据，一组比较不同载体浓度下的0.1％EC16(实心符号)，另一组比较20％载体时不同的EC16浓度。示出了合并数据的平均分对数转换的百分比值(大的水平条)和标准差(小的水平条)。

图3是柱状图，示出了在H1N1感染之前用EC16预处理的细胞中EC16对H1N1感染的预防作用的持续时间。用0.1％EC16、0.05％EC16、DMSO加EC16或对照处理细胞1小时，将EC16洗掉，将细胞在不含EC16的培养基中温育1小时，然后用H1N1感染细胞。X轴代表处理组，Y轴代表相对感染百分数。

图4是示出了EC16制剂对感染病毒的MDCK细胞中的病毒繁殖的作用(治疗作用)的图。用一系列的H1N1稀释液感染单层MDCK细胞1小时，然后施加EC16制剂1小时，之后进行TCID50测定法。X轴代表EC16制剂(载体％和EC16％)，Y轴代表感染力(分对数％)。示出了平均分对数转换的百分比值(大的水平条)和标准偏差(小的水平条)。

图5是示出了包覆MDCK细胞的EC16制剂薄层对后续的H1N1病毒感染的作用(薄层预防作用)的图。X轴代表实验参数(EC16处理的时间(时间(分钟))和EC16制剂(载体％和EC16％)，而Y轴代表感染力(分对数％)。示出了平均分对数转换的百分比值(大的水平条)和标准偏差(小的水平条)。

图6是柱状图，示出了通过MTT测定法测得的制剂的细胞毒性效应。X轴代表EC16制剂(载体％和EC16％)，Y轴代表光密度(OD)。示出了平均值(n＝16)和标准偏差(误差棒)。

具体实施方式

I.定义

应当理解，本公开不限于本文描述的组合物和方法以及描述的实验条件，因为它们可能会有所不同。还应当理解本文所用的术语仅用于描述某些实施方案的目的，并且并非旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由随附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文使用的所有科技术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的一致。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何组合物、方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中。所提及的所有出版物均以引用的方式全文并入本文。

在描述当前要求权利保护的本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用术语“一个”、“一种”、“该(所述)”和类似指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾。

除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的缩略方法，并且将每个单独的值并入本说明书中，就如同其在本文中单独引用一样。

术语“约”的使用旨在描述在大约+/-10％的范围内高于或低于所述值的值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-5％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-2％的范围内高于或低于所述值；在其它实施方案中，值的数值范围可以在大约+/-1％的范围内高于或低于所述值。前面的范围旨在通过上下文解释清楚，并且不暗示进一步的限制。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求权利保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。

如本文所用，术语“绿茶儿茶素(GTC)”和“绿茶多酚”可以互换使用，并且是指来自茶树(Camellia sinesus)叶片的多酚化合物。据报道，GTC具有针对多种疾病的各种健康益处。绿茶多酚包括但不限于(-)-表儿茶素、(-)-表没食子儿茶素、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯、(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和原花青素。经修饰的绿茶多酚是指具有一个或多个烃链(例如C

术语“取代的C

如本文所使用的，术语“治疗”、“进行治疗”、“疗法”和“治疗性用途”是指消除、减轻或改善疾病或障碍的一种或多种症状。如本文所使用的，“治疗有效量”是指足以介导此类症状的临床相关的消除、减轻或改善的治疗药剂量。如果作用大小足以影响受体受试者的健康或预后，则作用是临床相关的。治疗有效量可以指足以使疾病发作延迟或减至最低程度(如，延迟癌症扩散或将癌症扩散减至最低程度)的治疗剂的量。治疗有效量也可以指在疾病治疗或管理中提供治疗益处的治疗剂的量。

如本文所用，“包覆细胞”是指施加至细胞表面的物质的薄层或覆盖物。

如本文所用，术语“预防剂”是指可在检测出此类障碍或疾病的任何症状之前用于抑制或预防这种障碍或疾病的药剂。“预防有效”量是指足以介导这种防范的预防剂的量。预防有效量也可以指在疾病预防中提供预防益处的预防剂的量。

如本文所用，术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人、啮齿动物(诸如小鼠和大鼠)以及其它实验室动物。

甲型、乙型、丙型和丁型流感病毒属于正粘病毒科。流感病毒是有被膜的单链负义RNA病毒。它们呈球形或丝状，球形直径大约100nm，而丝状长度通常超过300nm。甲型流感病毒粒子布满了从源于宿主细胞的脂质膜上凸起的HA和NA糖蛋白棘突。

流感病毒具有分段的基因组，其中甲型和乙型流感病毒基因组具有八个负义、单链病毒RNA片段，丙型流感病毒基因组具有七个分段的基因组。分段的基因组能够进行抗原性转变，在抗原性转变中甲型流感病毒株从不同亚型的流感病毒获取HA片段，可能还获得NA片段。当抗原性转变产生一种人类易感但未曾免疫的病毒时会发生大流行性流感。

流感病毒主要通过受感染个体咳嗽或打喷嚏时所释放的空气传播的呼吸道分泌物来传播。其通过鼻或口进入，并在呼吸道中定居。流感病毒可感染呼吸道细胞。流感病毒的生命周期可以分为以下几个阶段：进入宿主细胞；病毒核糖核酸酶蛋白(vRNP)进入细胞核；病毒基因组的转录和复制；vRNP从细胞核中输出；以及在宿主细胞质膜上组装并出芽。流感病毒的复制周期(从进入到产生新病毒)非常快，第一批流感病毒从受感染的细胞中脱落只需6小时。

如本文所用，“H1N1病毒”是指甲型流感病毒的亚型，其为2009年人流感的最常见病因，并且与1918年爆发的西班牙流感有关。

如本文所用，“EC16”是指由连接至棕榈酸分子(16碳脂肪酸)的一个EGCG分子制成的EGCG-棕榈酸酯。

如本文所用，“丙三醇”和“甘油”可以互换使用，并且是指由两种多元醇构成的糖醇。甘油是附接至三个羟基的丙烷分子。

II.经修饰的绿茶多酚组合物和使用方法

本文所公开的是经修饰的绿茶多酚组合物，其可以预防性和治疗性地治疗呼吸道病毒而无需与病毒本身直接接触。一个实施方案提供了用于抑制或减少受试者中的病毒感染的方法，所述方法通过如下实现：向所述受试者施用组合物以抑制或减少病毒进入所述受试者的呼吸道上皮细胞，所述组合物含有有效量的绿茶多酚，所述绿茶多酚在至少一个位置用C

A.绿茶儿茶素

提供了绿茶儿茶素，优选一种或多种用一个或多个具有C

经修饰的绿茶儿茶素、绿茶儿茶素的衍生物或变体包括具有化学修饰以增加在宿主中的溶解度或生物利用度的绿茶儿茶素。在某些实施方案中，这些化学修饰包括添加在生理条件下具有电荷的化学基团。在其他实施方案中，修饰包括绿茶儿茶素与其他生物部分诸如多肽、碳水化合物、脂质或它们的组合的缀合。优选的修饰包括用一个或多个具有C

另一个实施方案提供了用于预防性或治疗性治疗呼吸道病毒的组合物，包含任选与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、填充剂或其他惰性物质或活性剂组合的一种或多种绿茶儿茶素、经修饰的绿茶儿茶素。在一些实施方案中，该组合物中的活性成分基本上由(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、用一个或多个具有C

绿茶多酚在脂质介质中具有较差溶解性。因此，还公开了亲脂性茶多酚以供用于脂溶性介质。亲脂性茶多酚(LTP或经修饰的绿茶多酚)可以通过绿茶多酚(GTP)的催化酯化来制备。

因而，提供了含有绿茶儿茶素的组合物，所述绿茶儿茶素经修饰以相对于未经修饰的绿茶儿茶素，增加该绿茶儿茶素对皮肤和细胞膜的渗透性或增加其在疏水性介质中的溶解度。可以修饰的绿茶儿茶素包括但不限于(-)-表儿茶素(EC)、(-)-表没食子儿茶素(EGC)、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯(EGC)、(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)、原花青素、它们的对映异构体、它们的差向异构体、它们的异构体、它们的组合和它们的前药。一个实施方案提供了一种绿茶儿茶素，其在一个或多个位置具有酯键连接的C

另一个实施方案提供了具有一个或多个酰氧基基团的绿茶儿茶素化合物，其中所述酰基为C

一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的根据式I的化合物或其药学上可接受的盐或前药：

其中，R

其中R

R

其中R

在式I的优选实施方案中，R

一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式I的化合物或其药学上可接受的盐或前药，条件是当R

一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式I的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

条件是当R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式I的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式I的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的根据式II的化合物或其药学上可接受的盐或前药：

其中，R

R

R

其中R

在式II的优选实施方案中，R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的根据式II的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式II的化合物，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式II的化合物，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的根据式II的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

R

R

其中R

并且其中当R

另一个实施方案提供了组合物，所述组合物包含任选与赋形剂组合的根据式II的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了组合物，所述组合物包含任选与赋形剂组合的如上所述的根据式II的化合物，其中R

另一个实施方案提供了组合物，所述组合物包含任选与赋形剂组合的如上所述的根据式II的化合物，其中R

另一个实施方案提供了组合物，所述组合物包含任选与赋形剂组合的根据式II的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

R

R

其中R

并且其中当R

一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的根据式III的化合物或其药学上可接受的盐或前药：

其中，R

其中R

R

其中R

在式III的特别优选的实施方案中，R

一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式III的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式III的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式III的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式III的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的根据式IV的化合物或其药学上可接受的盐或前药：

其中，R

R

R

其中R

在式IV的特别优选的实施方案中，R

一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式IV的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的根据式IV的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式IV的化合物，其中R

另一个实施方案提供了任选与赋形剂组合的如上所述的根据式IV的化合物，其中R

另一个实施方案提供了组合物，所述组合物包含任选与赋形剂组合的根据式IV的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了组合物，所述组合物包含任选与赋形剂组合的根据式IV的化合物或其药学上可接受的盐或前药，其中R

另一个实施方案提供了组合物，所述组合物包含任选与赋形剂组合的如上所述的根据式IV的化合物，其中R

另一个实施方案提供了组合物，所述组合物包含任选与赋形剂组合的如上所述的根据式IV的化合物，其中R

在一个实施方案中，提供了用一个脂肪酸酯化的绿茶多酚。另一个实施方案提供了用至少两个脂肪酸酯化的绿茶多酚。某些实施方案提供了用一个或多个具有大于16个碳的烃链的脂肪酸酯化的绿茶多酚。一些实施方案提供了用一个或多个具有长度介于17至25个碳的烃链的脂肪酸酯化的绿茶多酚。特别优选的实施方案提供了用一个或多个硬脂酸或棕榈酸链酯化的绿茶多酚。

代表性的绿茶多酚包括但不限于(-)-表儿茶素(EC)、(-)-表没食子儿茶素(EGC)、(-)-表儿茶素-3-没食子酸酯(ECG)、(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)。代表性的脂肪酸包括但不限于丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二碳酸、十四碳酸、十六碳酸(棕榈酸)、9-十六碳烯酸、十八碳酸(硬脂酸)、9-十八碳烯酸、11-十八碳烯酸、9,12-十八碳二烯酸、9,12,15-十八碳三烯酸、6,9,12-十八碳三烯酸、二十碳酸、9-二十碳烯酸、5,8,11,14-二十碳四烯酸、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、二十二碳酸、13-二十二碳烯酸、4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸和二十四碳酸。

1.(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯单棕榈酸酯

(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)是绿茶中含量最丰富的多酚，为一种强大的抗氧化剂。已证明EGCG具有许多健康益处，包括抑制各种人类病毒。EGCG的一个问题是EGCG制剂缺乏稳定性。由于EGCG是抗氧化剂，因此在存在氧气时维持稳定性是制备某些EGCG制剂的主要障碍。在一个实施方案中，例如经由脂肪酸酯化将酰基链添加至绿茶多酚可增加绿茶多酚的稳定性并增加绿茶多酚在疏水介质中的溶解度。脂肪酸可在一个或多个位置具有C

B.酯化绿茶多酚的方法

EGCG的脂质酯可以通过酶或化学方法形成(Chen等人，Journal of ZhejiangUniversity Science.2003；6:714-718)。

EGCG-酯先前由Chen等人在中国纯化。这是通过绿茶多酚与C16脂肪酸之间的催化酯化反应完成的。通过如下进行酯化：混合4克绿茶多酚和6.5克十六酰氯。接着，在40℃下将50mL的乙酸乙酯和催化剂添加至该混合物。搅拌3小时后，将该溶液用30mL去离子水洗涤3次。然后让有机层蒸发并通过在40℃下使用真空进一步干燥。这得到8.7g粉末产物。GTP与十六酰氯之间可能的酯化反应的合成示意图如下所示。(Chen等人，Journal of ZhejiangUniversity Science,2003；6:714-718。)

接着，将高电流色谱分离法用于纯化EGCG-酯产物。在分离柱中使用由(1:1)正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水组成的两相溶剂。将5克EGCG-酯溶解于50mL上相溶液中。纯化和HPLC分析后，可见EGCG酯已成功纯化。EGCG酰基衍生物的结构如下所示。(Chen等人，Journal ofZhejiang University Science,2003；6:714-718。)

在一个优选的实施方案中，根据上面的结构在4'位用硬脂酸酯化EGCG(式V)或用棕榈酸酯化EGCG。

C.药物组合物

提供了包含所公开的经修饰的绿茶儿茶素的药物组合物。绿茶儿茶素的药物单位剂型适合于经口、粘膜(例如鼻、舌下、阴道、颊面或直肠)、局部或透皮施用给患者。剂型的实例包括但不限于：片剂；囊型片剂；胶囊剂，诸如硬明胶胶囊剂和软弹性明胶胶囊剂；扁囊剂；糖锭剂(troches)；锭剂(lozenges)；分散剂；栓剂；软膏剂；泥罨剂(泥敷剂)；糊剂；散剂；敷料；霜剂；硬膏剂；溶液剂；贴剂；气溶胶(如鼻喷剂或吸入剂)；凝胶剂；适于经口或粘膜施用给患者的液体剂型，包括混悬剂(如水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液剂和酏剂。

本公开绿茶儿茶素的剂型的组成、形状和类型将通常取决于它们的用途而变化。本发明所涵盖的具体剂型将彼此不同的这些方式和其他方式对于本领域技术人员将是显而易见的。参见，例如，《雷氏药学大全》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版，麦克出版社(Mack Publishing)，宾夕法尼亚州伊斯顿市(Easton,Pa.)(1990)。

另一个实施方案提供了药物组合物和剂型，其包含一种或多种绿茶儿茶素、经修饰的绿茶多酚(特别是(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯)的药学上可接受的盐或者它们的药学上可接受的多晶型物、溶剂化物、水合物、脱水物、共晶、它们的无水、无定形形式和它们的组合。所公开的化合物的具体盐包括但不限于钠盐、锂盐、钾盐以及它们的水合物。

本公开的药物组合物和单位剂型通常还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。本公开的特定化合物提供的优点，诸如但不限于，增加的溶解度和/或增强的流动性、纯度或稳定性(如吸湿性)特性，可使其比现有技术更适合药物配制和/或施用给患者。合适的赋形剂是调剂学或药剂学领域的技术人员众所周知的，并且本文提供了合适的赋形剂的非限制性实例。特定赋形剂是否适合掺入药物组合物或剂型中取决于本领域众所周知的多种因素，包括但不限于剂型将会施用给患者的方式。例如，口服剂型诸如片剂或胶囊剂可含有不适合用于肠胃外剂型的赋形剂。特定赋形剂的适用性还可取决于剂型中的具体活性成分。例如，某些赋形剂(诸如乳糖)或暴露于水时可加速某些活性成分的分解。包含伯胺或仲胺的活性成分特别容易受到这种加速分解的影响。

本公开还涵盖包含一种或多种可降低活性成分(例如绿茶儿茶素)的分解速率的化合物的药物组合物和剂型。此类化合物(其在本文中称为“稳定剂”)包括但不限于抗氧化剂(诸如抗坏血酸)、pH缓冲剂或盐缓冲剂。另外，本公开的药物组合物或剂型可含有一种或多种溶解度调节剂，诸如氯化钠、硫酸钠、磷酸钠或磷酸钾或有机酸。一具体的溶解度调节剂是酒石酸。

像赋形剂的量和类型一样，剂型中绿茶儿茶素的量和具体类型可能取决于多种因素，诸如但不限于其待施用给患者的途径。然而，本公开的绿茶儿茶素化合物的典型剂型包括其药学上可接受的盐或药学上可接受的多晶型物、溶剂化物、水合物、脱水物、共晶、无水或无定形形式，含量为约10mg至约1000mg，优选含量为约25mg至约750mg，更优选含量为50mg至500mg，甚至更优选含量为约30mg至约100mg。

在一个实施方案中，包含所公开的经修饰的绿茶儿茶素的药物组合物还包含载体，例如糖醇，诸如但不限于甘油、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇和赤藓糖醇。在一个具体的实施方案中，糖醇为甘油。

1.供局部施用的制剂

所公开的经修饰的绿茶儿茶素的局部用剂型包括但不限于液体剂、霜剂、洗剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、糊剂、喷雾剂、气溶胶、溶液剂、乳剂和本领域技术人员已知的其他形式。参见，例如，《雷氏药学大全》，第18版，麦克出版社，宾夕法尼亚州伊斯顿市(1990)；和《药物剂型介绍》(Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)，第4版，Lea&Febiger出版社，宾夕法尼亚州费城市(Philadelphia,Pa)(1985)。在一个优选的实施方案中，所公开的经修饰的绿茶儿茶素以合适的局部用剂型递送至口腔组织、鼻组织或支气管组织。

对于非喷雾型局部用剂型，通常采用包含与局部施用相容并且具有的动态粘度优选大于水的载体或一种或多种赋形剂的粘稠形式至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于溶液剂、混悬剂、乳剂、霜剂、软膏剂、散剂、凝胶剂、蜡、糊剂、搽剂、油膏剂等，如果需要，可将其灭菌或与影响各种特性(诸如，例如渗透压)的辅剂(如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合。

鼻喷剂药物产品含有溶解或悬浮于非加压分配器中的赋形剂溶液或混合物中的治疗活性成分，该非加压分配器可递送含有定量剂量的活性成分的喷雾剂。剂量可以通过喷雾泵计量，或者可以在制造过程中预先计量。鼻喷剂单元可以设计用于单位给药，或者可以排出多达数百定量的含有药物的制剂喷雾。将鼻喷剂施加至鼻腔以达成局部和/或全身作用。

吸入溶液剂和混悬剂药物产品通常是水基制剂，该制剂含有治疗活性成分并且可还含有其他赋形剂。水基经口吸入溶液剂和混悬剂必须是无菌的。吸入溶液剂和混悬剂旨在通过经口吸入递送至肺部以达成局部和/或全身作用并且与特定的雾化器一起使用。

吸入喷雾药物产品由制剂和容器封闭系统组成。制剂通常是水基的并且必须是无菌的。吸入喷雾剂旨在通过经口吸入递送至肺部以达成局部和/或全身作用。含有所公开的组合物的吸入喷雾剂药物产品还可含有其他赋形剂。

其他合适的局部用剂型包括可喷射气溶胶制品，其中活性成分(优选与固体或液体惰性载体组合)包装在与加压挥发性物质(如气体推进剂，诸如氟利昂)的混合物中，或包装在挤压瓶中。可喷射气溶胶制品的实例包括但不限于定量剂量吸入器、干粉吸入器和喷雾器。如果需要，也可以将湿润剂或保湿剂添加至药物组合物和剂型中。这种附加成分的实例是本领域众所周知的。参见，例如，《雷氏药学大全》，第18版，麦克出版社，宾夕法尼亚州伊斯顿市(1990)。

本公开组合物的透皮和粘膜用剂型包括但不限于眼用溶液剂、贴剂、喷雾剂、气溶胶、霜剂、洗剂、栓剂、软膏剂、凝胶剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或本领域技术人员已知的其他形式。参见，例如，《雷氏药学大全》，第18版，麦克出版社，宾夕法尼亚州伊斯顿市(1990)；和《药物剂型介绍》，第4版，Lea&Febiger出版社，宾夕法尼亚州费城市(1985)。适用于治疗口腔内粘膜组织的剂型可以配制成漱口水、口服凝胶剂或口腔贴剂。另外的透皮剂型包括“贮库型”或“基质型”贴剂，其可以施加至皮肤并穿戴特定的时间段以允许期望量的活性成分渗透。

可用于施用本公开的绿茶儿茶素的透皮剂型和施用方法的实例包括但不限于美国专利No.7,097,853、No.7,376,460、No.7,537,590、No.7,658,728、No.8,386,027、No.10,231,938中公开的那些，将这些专利每一者全文以引用方式并入本文中。

可用于提供本公开所涵盖的透皮和粘膜用剂型的合适赋形剂(如载体和稀释剂)和其他材料是药学领域的技术人员众所周知的，并且取决于将施加给定药物组合物或剂型的特定组织或器官。有鉴于此，典型赋形剂包括但不限于水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1,3-二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油以及它们的混合物，以形成无毒且药学上可接受的剂型。

取决于待治疗的具体组织，可以在用本公开的绿茶多酚的药学上可接受的盐治疗之前、与之联合或之后使用其他组分。例如，渗透促进剂可用于协助将活性成分递送至组织或跨组织递送。合适的渗透促进剂包括但不限于：丙酮；各种醇，诸如乙醇、油醇、四氢糠醇；烷基亚砜，诸如二甲基亚砜；二甲基乙酰胺；二甲基甲酰胺；聚乙二醇；吡咯烷酮，诸如聚乙烯吡咯烷酮；Kollidon级(聚维酮、聚乙烯吡咯烷酮)；尿素；以及各种水溶性或水不溶性糖酯，诸如吐温80(聚山梨醇酯80)和SPAN 60(一硬脂酸脱水山梨醇酯)。

还可以调节药物组合物或剂型的pH或药物组合物或剂型所施加到的组织的pH，以改善活性成分的递送。类似地，可以调节溶剂载体的极性、其离子强度或张度以改善递送。还可以将诸如硬脂酸酯之类的化合物添加至药物组合物或剂型，以有利地改变活性成分的亲水性或亲脂性，从而改善递送。就这一点而言，硬脂酸酯可充当制剂的脂质媒介物、充当乳化剂或表面活性剂，以及充当递送增强剂或渗透增强剂。紧连接调节剂的药学上可接受的盐的不同水合物、脱水物、共晶、溶剂化物、多晶型物、无水或无定形形式可用于进一步调节所得组合物的性质。

所公开的绿茶儿茶素组合物还可以配制成延长释放制剂或延迟释放制剂。用于各种活性成分的延长释放制剂和延迟释放制剂是本领域已知的，例如通过包囊。

绿茶儿茶素化合物，特别是用C

D.使用方法

所公开的经修饰的绿茶儿茶素化合物及其组合物可用于治疗病毒感染的一种或多种症状。在一个实施方案中，该病毒是呼吸道病毒。呼吸道病毒可以是流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒或冠状病毒。优选地，将所公开的组合物配制用于经鼻或经口施加，诸如滴剂、涂敷剂(applicators)或喷雾剂。一个实施方案提供了用于在对其有需要的受试者中预防性或治疗性地治疗流感病毒的绿茶儿茶素组合物。在一个实施方案中，所公开的组合物及其使用方法防止通过空气传播途径的病毒感染。

在一些实施方案中，将经修饰的绿茶儿茶素化合物及其组合物对受试者的作用与对照进行比较。例如，可以将组合物对特定症状、药理或生理指标的作用与未经治疗的受试者或在治疗之前受试者的状况进行比较。在一些实施方案中，在治疗之前在受试者中测量症状、药理或生理指标，并且在治疗开始之后再次测量一次或多次。在一些实施方案中，对照是参考水平，或通过测量一个或多个不具有待治疗疾病或病症的受试者(例如，健康受试者)中的症状、药理或生理指标而确定的平均值。在一些实施方案中，将治疗的作用与本领域已知的常规治疗进行比较。

1.治疗流感

有大量已公布的数据证明EGCG或绿茶多酚对甲型和乙型流感病毒具有有效的抑制活性。在基于细胞培养的实验中，EGCG与流感病毒直接接触会导致病毒感染性失活(Song等人，Antiviral Research,2005，Colpitts和Schang,J Virology,2014)。然而，将细胞与EGCG一起预先温育但不与病毒接触并没有显示抗病毒活性(Colpitts和Schang,JVirology,2014)。动物研究表明，含有EGCG的制剂只有在预先与流感病毒混合的情况下，才能保护小鼠免于流感病毒诱导的死亡(Smee等人，2011)。这些数据表明，只有EGCG与流感病毒直接接触，EGCG才是预防和治疗流感病毒感染的良好候选者。此外，由于绿茶多酚的抗氧化特性，含有EGCG或绿茶提取物的制剂在存在氧气时无法维持分子稳定性。

本文公开了使用所公开的组合物来治疗流感病毒的方法。方法通常包括向对其有需要的受试者施用有效量的包含经修饰的绿茶儿茶素的组合物。在一个实施方案中，绿茶儿茶素是(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯单棕榈酸酯(EC16)和甘油的制剂。EC16可以0.01％-0.1％w/v的量存在于药物组合物中。在一个实施方案中，EC16可以0.5％w/v的量存在于药物组合物中用于治疗流感感染。在一个实施方案中，经修饰的绿茶儿茶素组合物包含0.01％至0.1％w/v EC16和10％至20％甘油。在一个具体的实施方案中，该组合物包含0.1％w/v EC16和20％w/v甘油。

在一个实施方案中，EC16可以抑制流感病毒而不会负面影响宿主细胞。可将所公开的经修饰的绿茶儿茶素组合物根据需要经鼻或经口施用给受试者持续1、2、3、4、5、6、7天或更长时间，直至流感症状消退。所述组合物可根据需要每天施用1次、2次、3次或更多次。

2.预防流感

本文公开了使用所公开的组合物来预防流感病毒感染的方法。方法通常包括给对其有需要的受试者经鼻或经口施用有效量的包含经修饰的绿茶儿茶素的组合物。在一个实施方案中，绿茶儿茶素是(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯单棕榈酸酯(EC16)和甘油的制剂。不受任何理论的束缚，据信所公开的经修饰的绿茶儿茶素可以保护鼻、口和肺的气道上皮细胞免受病毒感染。对未主动感染流感病毒的受试者预防性地施用所公开的经修饰的绿茶儿茶素制剂可以防止他们感染流感。EC16可通过将脂肪酰基链插入细胞膜的疏水部分而对气道上皮细胞产生“包覆”作用，从而保留EGCG来在病毒随后遇到细胞膜时灭活病毒。另一个潜在的机制是EC16与细胞表面含唾液酸的糖蛋白结合，从而阻止H1N1结合细胞并内化进细胞中。

EC16可以0.01％-0.1％w/v的量存在于药物组合物中。在另一个实施方案中，EC16以0.2％w/v的量存在于药物组合物中。在一个实施方案中，经修饰的绿茶儿茶素组合物包含0.01％至0.1％w/v EC16和10％至20％甘油。在一个具体的实施方案中，该组合物包含0.1％w/v EC16和20％w/v甘油。可每天三次、每天两次、每天一次或每隔一天预防性地施用所公开的组合物。在一个优选的实施方案中，所公开的组合物每天施用两次。在一个实施方案中，在流感高发期间，将经修饰的绿茶儿茶素组合物连续施用给受试者。在另一个实施方案中，受试者每天施用所公开的组合物持续延长的一段时间，例如六个月、一年、两年或两年以上。

a.高风险受试者

在一些实施方案中，某些受试者感染流感病毒的风险更高。发生流感感染的高风险受试者包括但不限于65岁及以上的人、孕妇、幼儿和患有某些慢性疾病(诸如哮喘、糖尿病或心脏病)的人。这些高风险受试者不仅更有可能感染流感，而且更容易患流感并发症。流感相关并发症的实例包括但不限于肺炎、支气管炎、鼻窦感染和耳部感染。并发症可能导致住院，有时甚至会导致死亡。在一个实施方案中，可以向高风险受试者施用所公开的组合物以预防性地治疗流感病毒感染。

在一个实施方案中，在流感高发期间连续给高风险受试者施用所公开的经修饰绿茶儿茶素组合物。可以每天1、2、3次或更多次向高风险受试者施用所公开的组合物。

3.其他呼吸道病毒

本文公开了使用所公开的组合物来防止呼吸道病毒感染的方法。方法通常包括给对其有需要的受试者经鼻或经口施用有效量的包含经修饰的绿茶儿茶素的组合物，以抑制或减少病毒进入受试者的呼吸道上皮细胞。在一个实施方案中，所公开的组合物至少部分包覆鼻或呼吸道细胞以抑制或减少病毒进入呼吸道上皮细胞。在一个实施方案中，绿茶儿茶素是(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯单棕榈酸酯(EC16)和甘油的制剂。示例性的呼吸道病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒和冠状病毒。

实施例

实施例1：EC16使H1N1病毒失活

细胞和病毒：从ATCC购买MDCK细胞，并在补充有10％胎牛血清和三抗生素的MEM细胞培养基中培养。H1N1病毒购自ATCC并储存在-80℃下。

MDCK细胞感染和TCID50病毒滴度测定法：将MDCK细胞在补充有10％胎牛血清(热灭活，Neuromics公司，明尼苏达州伊代纳市(Edina,MN))和1X青霉素、链霉素和两性霉素B(康宁公司(Corning)，纽约州康宁市(Corning,NY))的最低必需培养基(MEM，生命技术公司(Life Technologies Corporation)，加利福尼亚州卡尔斯巴德市(Carlsbad,CA))中培养。使用已达到汇合的MDCK细胞在96孔细胞培养板(经组织培养处理，Southern Labware公司，乔治亚州卡明市(Cumming,GA))中进行病毒感染测定法。使用含抗生素的MEM无血清培养基制备H1N1病毒母液的系列稀释液至10

病毒灭活测试：通过将EC16溶于甘油(下文称为“载体”)并然后用MEM无血清培养基和载体的混合物稀释至10％或20％载体中的0.01％(w/v)或0.1％(w/v)EC16，制得含有EC16的制剂。在2ml微量离心管中，将50μl H1N1病毒母液添加至450μl含有EC16和载体的制剂中。然后封闭试管，通过摇晃60秒混合内容物进行直接接触，然后立即将病毒/EC16混合物在MEM无血清培养基中稀释10倍(100μl混合物加至900μl MEM)以使EC16失活，随后连续10倍稀释至10-6。将稀释液加载到96孔板中的MDCK细胞单层上(每孔100μl，4个重复)。吸收1小时后，移除稀释液，温育细胞并如上所述测定病毒感染率。

预实验表明，在MEM无血清培养基中，对于单独的10％或20％的载体没有抗病毒活性(数据未示出；p>0.4)。

本实验设计用于确定EC16与H1N1病毒混合后是否能够通过直接接触1分钟而快速灭活H1N1病毒。图1显示，在含有10％载体的制剂中，0.01％的EC16将H1N1的感染力降低至对照组的20.5％±17.1(n＝3)，而0.1％的EC16将感染力降低至6.1％±3.0。对于20％载体中的0.1％EC16，该值为2.4％±1.1。匹配无效(p＝0.6；n＝3，分对数转换后的值)。测试10％载体中的0.1％EC16的另外三个单独的重复实验显示出一致的结果(3.8％±1.5；总平均值(n＝6)为对照的5.0％±2.4)，并且在测试20％载体中的0.01％EC16的单独实验中，感染力降低至对照的7.3％±9.2％。

使用所有值的普通双因素方差分析显示无显著相互作用(p＝0.48)，对于EC16浓度显示无显著影响(p＝0.07)，但对于载体浓度显示出边界显著影响(p＝0.048)。(然而，在不同的组样本量和低的n，应谨慎看待这些p值。)因此，主要趋势是在0.1％EC16下标准偏差降低，表明治疗效果更加一致。所有四个测试组的病毒活性均显著低于99.9％(单样本t检验，p≤0.008)，并且除0.01％EC16，20％载体(p＝0.020；在邦费罗尼校正后不显著n＝4)外，全部显著高于0.01％的病毒活性(p<0.004)。也就是说，活性的降低是显著的，但宽泛来看，其仍然显著高于0％的病毒活性。

实施例2：EC16预防H1N1感染

预防测试：将不同的EC16制剂(100μl)与MDCK细胞在细胞培养箱中温育1小时，然后移除该制剂并用MEM无血清培养基洗涤。将H1N1病毒在MEM无血清培养基中的系列稀释液添加至汇合的MDCK细胞单层，并温育1小时。如上所述，温育4天后更换培养基并测定TCID50感染率。

为了测试EC16预防细胞被H1N1感染的能力，将MDCK细胞单层与EC16处理物温育1小时，然后将游离的EC16洗掉，随后使细胞暴露于病毒。进行了两组实验：第一组比较了10％载体中的0.01％EC16、10％载体中的0.1％EC16和20％载体中的0.1％EC16的效果(n＝4)；第二组比较了20％载体中的0.01％EC16和0.1％EC16(n＝3)。在载体为10％时，0.01％EC16显示对病毒滴度无影响(100％活力，n＝4；数据未示出)。在这两个实验中，均没有显著的匹配效应(p≥0.34)，并且两组使用0.1％EC16 20％载体的实验的平均病毒滴度也没有显著差异(非配对t检验；p＝0.08)。因此，将来自这两个实验的结果结合起来进行分析(图2)。0.1％EC16，20％载体的值(n＝7)呈正态分布(夏皮罗-威尔克检验，p＝0.06)。

所有这三种处理(10％和20％载体中的0.1％EC16、20％载体中的0.01％EC16)的感染力值均显著低于对照组的99.9％(p<0.004)，但大于0.01％(p<0.002)；0.1％EC16，10％载体以及20％载体中的0.01％和0.1％EC16的平均值(±SD)分别为10.5％±3.6、2.3％±0.9和2.4％±1.6。分对数转换的数据的普通单因素方差分析显示各组之间存在显著差异(p＝0.003)，0.1％EC16，10％载体的平均值显著高于其他组(p<0.015)，与混悬剂测试中所见的载体浓度的效应一致。标准偏差没有显著差异(Brown-Forsythe检验，p＝0.11)。

为了进一步检查载体在EC16降低病毒滴度中的作用，我们使用2％二甲基亚砜(DMSO)作为EC16溶剂进行预防测试，使用了不同浓度的EC16而不是载体，与对照病毒滴度相比，DMSO中浓度为0％至0.1％的EC16没有导致统计学上显著的差异(数据未示出)。制剂中的载体含量是降低病毒滴度所必需的，因为使用2％DMSO时相同浓度的EC16不能产生类似的结果。

总的来说，这些结果表明，EC16在存在载体的情况下可显著降低H1N1病毒对MDCK的感染，并且20％载体中的0.1％EC16使滴度降低最大(42倍)。

为了测试EC16制剂是否具有持久的预防作用，将细胞用EC16制剂预处理1小时，然后洗掉该制剂。将不含EC16的新培养基添加至细胞培养物并温育1小时。然后将细胞用H1N1病毒感染1小时。该实验允许洗去细胞上包覆的EC16，并让细胞在无EC16的情况下放置一小时，然后再用H1N1病毒感染细胞一小时。

结果表明，在首次施加制剂2小时后0.1％EC16几乎完全阻断了H1N1感染，即使是在将EC16洗掉并在没有EC16的情况下温育细胞1小时时(图3)。在0.05％EC16下，平均90％的细胞免受H1N1感染。

实施例3：EC16治疗H1N1感染

治疗测试：为了测试含有EC16的制剂是否具有治疗(感染后)作用，将96孔细胞培养板中的MDCK细胞最初用系列稀释液中的H1N1病毒感染1小时。然后，将100μl含有EC16的制剂施加至每个孔的细胞上1小时，然后用MEM无血清培养基洗掉。如上所述测定TCID50。

为了确定EC16是否能够降低刚刚感染病毒的MDCK细胞中的病毒繁殖，将MDCK细胞单层用H1N1系列稀释液感染1小时，然后以10％载体中的0.01％或20％载体中的0.01％或0.1％施加EC16。所有治疗的值均显著低于对照(99.99％,p<0.005)，从而表明具有抗病毒作用，但显著高于对照的0.01％(p<0.008)，与剩余一些活性病毒一致。图4表明，10％载体中的0.01％EC16相对较差，在治疗感染的细胞时有些不一致(病毒TCID50降至对照的15.4％±15.2)。

然而，在0.1％下，10％或20％载体中的EC16可使病毒滴度分别降至对照的4.6％±3.5和1.6％±0.2。匹配不显著(p＝0.3)，标准偏差也没有显著差异(Brown-Forsythe检验，p＝0.42)。用普通的单因素方差分析对三个组进行分析表明，三种治疗之间无显著差异(p＝0.057；n＝3)。

实施例4：薄层包覆测试

薄层包覆测试：为了测试在细胞单层上施加的一薄层含有EC16的制剂是否可以减少H1N1感染，将10μl含有EC16的制剂施加至MDCK细胞的96孔板的每个孔(面积为0.3cm2)上10分钟或30分钟。然后，在不移除该制剂的情况下让细胞暴露于系列稀释液中的H1N1攻击持续1小时。移除病毒稀释液，并添加200μl含0.2μg/ml胰蛋白酶的新鲜MEM无血清培养基，并如上所述测定TCID50。

这些实验设计用于确定包覆MDCK细胞单层的EC16制剂薄层(33μl/cm2孔面积)是否能防止后续的H1N1病毒感染。在第一组实验中，将细胞用10％载体中的0.01％和0.1％EC16以及20％载体中的0.1％EC16处理10分钟和30分钟。在第二组实验中，在处理30分钟时比较20％载体中的0.01％EC16和0.1％EC16(图5)。匹配无效(p≥0.4)，用20％载体中的0.1％EC16处理30分钟的两组数据之间无显著差异(非配对t检验，p＝0.94)。因此，将两组数据结合起来进行分析。

带10％载体的0.01％的EC16处理10分钟导致不一致且较差的病毒抑制作用(剩余活力为48.4％±46.4)，剩余感染力的范围为10％至100％。因此，该组被排除在后续分析之外。用10％和20％载体中的0.1％EC16进行的10分钟处理组和用20％载体中的0.01％和0.1％EC16进行的30分钟处理组，平均值分别为9.5％±1.4、12.1％±5.8、7.6％±7.2和0.9％±0.7。这些均显著小于99.9％(单样本t检验，p≤0.007)，但是(除了0.01％EC16，20％载体，30分钟以外，p＝0.016，在邦费罗尼校正后不显著，n＝4)，显著大于0.01％(p≤0.003)。对于两种10分钟的0.1％EC16处理，在10％和20％的载体之间，病毒滴度没有显著差异(采用Welch校正的非配对t检验，p＝0.65)。

相似地，在20％载体中处理30分钟，0.01％和0.1％EC16之间也没有显著差异。然而，当将用20％载体中的0.1％EC16处理10分钟与30分钟相比较时，30分钟处理显著降低了滴度(p＝0.004)。分别对实验进行分析，得到了相似的结果。

实施例5：用EC16处理时的细胞活力

细胞活力：该实验测试了EC16制剂是否与MDCK细胞中的细胞毒性有关。将MDCK细胞在96孔板中培养直至汇合。将MEM无血清培养基、含有10％载体和20％载体的MEM培养基(载体对照)或含有0.1％EC16和10％或20％载体的MEM培养基添加至孔中，然后在35℃和5％CO

该实验设计用于确定EC16是否在MDCK细胞中诱导细胞毒性。重复测量结果的单因素方差分析显示处理组有显著作用(p<0.0001；匹配有效(p＝0.033)；Geisser-Greenhouseε为0.638)。如图6中所示，与所有四种处理相比，仅用20％载体温育1小时诱导的细胞活力显著降低(p<0.0005；与单独的MEM相比，MTT值降低了29％，1.04±0.15OD单位对1.47±0.17OD单位)。然而，10％载体和具有10％或20％载体的含EC16制剂与MEM对照在统计学上没有差异(p>0.6)。也就是说，EC16保护了细胞免受与高载体浓度相关的细胞活力降低(或通过MTT测定法测定的代谢率降低)。

尽管在前面的说明书中已关于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且出于说明的目的已经提出了许多细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可容许有额外实施方案，并且在不脱离本发明的基本原理的情况下，本文所述的某些细节可以进行相当大的改变。

本文引用的所有参考文献均以引用的方式全文并入。在不脱离本发明的精神或本质属性的情况下，本发明可以以其他特定形式来体现，并且因此，应参考所附权利要求，而不是前述说明书，来指示本发明的范围。