本申请要求2019年1月31日提交的美国临时专利申请62/799,513和2018年5月31日提交的美国临时专利申请62/678,878的优先权，所述申请的公开内容据此以引用方式并入，如同整体写入本文一样。
本文公开了基因组编辑的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)以及将其用于免疫治疗的方法。具体地，本公开涉及可以被基因修饰以表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，以及使用所述T细胞治疗癌症的方法。
T细胞(一类淋巴细胞)在细胞介导的免疫中起核心作用。通过细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在，将所述T细胞与其他淋巴细胞诸如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分开来。T辅助细胞(T
可以对本文所述的T细胞进行基因修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体是由抗原识别部分和T细胞激活结构域组成的融合蛋白。表达CAR的T细胞可以识别特定的蛋白质，即肿瘤细胞上的抗原。这些表达CAR的T细胞可以在输注到患者体内之前在实验室中扩增。
临床试验已显示出抗CD19 CAR输注后患有B细胞恶性肿瘤(包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(ALL))的患者的高应答率，产生两种FDA批准的疗法Yescarta
附图说明
图1示出双CAR-T细胞(dCAR-T细胞)的示意图。
图2示出串联CAR-T细胞(tCAR-T细胞)的示意图。
图3示出双和串联CAR构建体的示意图。
图4示出串联的靶向CAR构建体的示意图。
图5示出没有机械耗尽CD3+或CD2+CAR-T细胞情况下的CAR-T产物纯度。如通过FACS分析所示，存在高纯度的CD3
图6示出没有机械耗尽CD3+或CD2+CAR-T细胞情况下的CAR-T产物纯度。如通过FACS分析所示，存在高纯度的CD3-和CD2-CAR-T细胞，而无需CD3+细胞的磁性耗尽选择。代表性FACS图示出CD3(y轴)和CD2(x轴)的FITC染色。示出克隆7(顶部)和8(底部)。
图7示出没有机械耗尽CD3+或CD2+CAR-T细胞情况下的CAR-T产物纯度。如通过FACS分析所示，存在高纯度的CD3-和CD2-CAR-T细胞，而无需CD3+细胞的磁性耗尽选择。代表性FACS图示出CD3(y轴)和CD2(x轴)的FITC染色。示出克隆13(顶部)和14(底部)。
图8示出没有机械耗尽CD3+或CD2+CAR-T细胞情况下的CAR-T产物纯度。如通过FACS分析所示，存在高纯度的CD3-和CD2-CAR-T细胞，而无需CD3+细胞的磁性耗尽选择。代表性FACS图示出CD3(y轴)和CD2(x轴)的FITC染色。示出克隆15(顶部)和16(底部)。
图9A示出串联CD2-CD3 CAR-T克隆5(顶部)和6(底部)的肿瘤细胞杀伤；图例示出效应子与靶细胞的比率(E:T比)。
图9B示出串联CD2-CD3 CAR-T克隆7(顶部)和8(底部)的肿瘤细胞杀伤；图例示出效应子与靶细胞的比率(E:T比)。
图9C示出串联CD2-CD3 CAR-T克隆13(顶部)和14(底部)的肿瘤细胞杀伤；图例示出效应子与靶细胞的比率(E:T比)。
图9D示出串联CD2-CD3 CAR-T克隆15(顶部)和16(底部)的肿瘤细胞杀伤；图例示出效应子与靶细胞的比率(E:T比)。
图10A示出待转导到T细胞中的BCMA CAR构建体的示意图，其将靶向BCMA。
图10B示出
图10C示出BCMA CAR-T细胞的体内功效。与在第50天左右死亡的对照相比，用BCMACAR-T治疗的所有七只小鼠都存活将近150天或更长。
图10D示出以所揭示的光子通量测量的连续生物发光成像(BLI)，显示出在接受BCMA CAR-T细胞治疗的小鼠中，在整个实验持续时间内从未增加的背景信号水平(signalto background level)的稳健降低。
图11A示出待转导到T细胞中的CS1-CAR构建体的示意图，其将靶向CS1。
图11B示出CS1-CAR-T细胞的体内功效。作为测试CS1-CAR-T细胞的特异性的方法，向小鼠中植入MM.1S-CG细胞和缺乏CS1的MM.1S-CG细胞(使用CAS9/CRISPR技术；MM.1S-CGΔCS1)。用CS1-CAR-T细胞治疗的所有小鼠(n＝10)存活>90天，而CD19对照小鼠(n＝8)的中值生存期为43天。
图11C示出连续生物发光成像(BLI)，显示出用CS1-CAR-T细胞治疗的小鼠的光子通量和骨髓肿瘤清除率降低了三个log(实验1至实验3)。
图12A示出单(CD19、CS1)和串联(BCMA-CS1)构建体的示意图。
图12B示出表达CD19 CAR的Jurkat细胞不结合BCMA或CS1蛋白的FACS分析(每个图的左下象限)。表达BCMA CAR蛋白的Jurkat细胞结合BCMA蛋白(每个图的左上象限)。表达CS1 CAR蛋白的Jurkat细胞结合CS1蛋白(每个图的右下象限)。表达串联BCMA-CS1 CAR蛋白的Jurkat细胞结合两种重组蛋白(每个图的右上象限)，表明两种scFv均有表达。
图12C示出使用标准的四小时铬释放(
图13示出在T-ALL的异种模型中测试CD2*CD3Δ-dCARTΔCD2ΔCD3ε的功效。
具体实施方式
以下公开内容将详细描述工程改造的细胞的实施方案、替代方案和用途，以及此类细胞在例如免疫疗法和过继性细胞转移中治疗疾病的用途。因此，本文提供了以下实施方案。
实施方案1.一种CAR-T细胞，其包含靶向一种或多种抗原的一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR-T细胞缺乏T细胞受体复合物的亚基和/或缺乏所述一种或多种CAR所特异性结合的至少一种或多种抗原。
实施方案2.一种CAR-T细胞，其包含靶向一种或多种抗原的一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR-T细胞缺乏所述一种或多种CAR所特异性结合的一种或多种抗原。
实施方案3.如实施方案1所述的CAR-T细胞，其中所述T细胞受体复合物的所述亚基选自TCRα、TCRβ、TCRδ、TCRγ、CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3ζ。
实施方案4.如实施方案1-2中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述嵌合抗原受体(CAR)特异性结合在恶性T细胞或骨髓瘤细胞上表达的一种或多种抗原。
实施方案5.如实施方案1-4中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述嵌合抗原受体(CAR)对选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的氨基酸序列表现出至少95％的序列同一性。
实施方案6.如实施方案1-4中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述嵌合抗原受体(CAR)对选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的氨基酸序列表现出至少98％的序列同一性。
实施方案7.如实施方案1-4中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述嵌合抗原受体(CAR)是选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
实施方案8.如实施方案1-4中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性结合选自以下的一种或多种抗原：BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim-3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56和CD1a。
实施方案9.如实施方案1-5中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性结合在恶性T细胞上表达的至少一种抗原。
实施方案10.如实施方案9所述的CAR-T细胞，其中在恶性T细胞上表达的所述抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、TCRA和TCRβ。
实施方案11.如实施方案1-5中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性结合在恶性浆细胞上表达的至少一种抗原。
实施方案12.如实施方案11所述的CAR-T细胞，其中在恶性浆细胞上表达的所述抗原选自BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138和CD19。
实施方案13.如实施方案1-5中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性结合在恶性B细胞上表达的至少一种抗原。
实施方案14.如实施方案13所述的CAR-T细胞，其中在恶性B细胞上表达的所述抗原选自CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38和CD45。
实施方案15.如实施方案14所述的CAR-T细胞，其中在恶性B细胞上表达的所述抗原选自CD19和CD20。
实施方案16.如实施方案1-15中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞还包含自杀基因。
实施方案17.如实施方案1-16中任一项所述的CAR-T细胞，其中内源性T细胞受体介导的信号传导在所述CAR-T细胞中被阻断。
实施方案18.如实施方案1-17中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞不诱发同种异体反应性或移植物抗宿主疾病。
实施方案19.如实施方案1-18中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞不引起自相残杀。
实施方案20.一种如实施方案1-19中任一项所述的双或串联CAR-T细胞。
实施方案21.如实施方案20所述的CAR-T细胞，其中所述CAR特异性结合选自以下的两种不同靶标：CD2xCD3ε、CD2xCD4、CD2xCD5、CD2xCD7、CD3εxCD4、CD3εxCD5、CD3εxCD7、CD4xCD5、CD4xCD7、CD5xCD7、TRACxCD2、TRACxCD3ε、TRACxCD4、TRACxCD5、TRACxCD7、TCRβxCD2、TCRβxCD3ε、TCRβxCD4、TCRβxCD7、CD2xCD3ε、CD2xCD4、CD2xCD5、CD2xCD7、CD3εxCD4、CD3εxCD5、CD3εxCD7、CD4xCD5、CD4xCD7、CD5xCD7、TRACxCD2、TRACxCD3ε、TRACxCD4、TRACxCD5、TRACxCD7、TCRβxCD2、TCRβxCD3ε、TCRβxCD4、TCRβxCD5、TCRβxCD7、BCMAxCS1、BCMAxCD19、BCMAxCD38、CS1xCD19、CD19xCD38、APRILxCS1、APRILxBCMA、APRILxCD19、APRILxCD38、CS1xCD38、CD79AxBCMA、CD79AxCS1、CD79AxCD19、CD79AxCD38、CD79AxCD38、CD79AxAPRIL、CD79AxCD79B、CD79BxBCMA、CD79BxCS1、CD79BxCD19、CD79BxCD38、CD79BxAPRIL、CD79BxCD79A、CD138xBCMA、CD138xCS1、CD138xCD19、CD138xCD38、CD138xAPRIL、CD138xCD79A、CD138xCD79B、CD138xBCMA和CD138xCS1。
实施方案22.如实施方案21所述的CAR-T细胞，其中所述CAR特异性结合选自以下的两种不同靶标：CD2xCD3ε、CD2xCD4、CD2xCD5、CD2xCD7、CD3εxCD4、CD3εxCD5、CD3εxCD7、CD4xCD5、CD4xCD7、CD5xCD7、TRACxCD2、TRACxCD3ε、TRACxCD4、TRACxCD5、TRACxCD7、TCRβxCD2、TCRβxCD3ε、TCRβxCD4、TCRβxCD7、CD2xCD3ε、CD2xCD4、CD2xCD5、CD2xCD7、CD3εxCD4、CD3εxCD5、CD3εxCD7、CD4xCD5、CD4xCD7、CD5xCD7、TRACxCD2、TRACxCD3ε、TRACxCD4、TRACxCD5、TRACxCD7、TCRβxCD2、TCRβxCD3ε、TCRβxCD4、TCRβxCD5和TCRβxCD7。
实施方案23.如实施方案21所述的CAR-T细胞，其中所述CAR特异性结合选自以下的两种不同靶标：BCMAxCS1、BCMAxCD19、BCMAxCD38、CS1xCD19、CD19xCD38、APRILxCS1、APRILxBCMA、APRILxCD19、APRILxCD38、CS1xCD38、CD79AxBCMA、CD79AxCS1、CD79AxCD19、CD79AxCD38、CD79AxCD38、CD79AxAPRIL、CD79AxCD79B、CD79BxBCMA、CD79BxCS1、CD79BxCD19、CD79BxCD38、CD79BxAPRIL、CD79BxCD79A、CD138xBCMA、CD138xCS1、CD138xCD19、CD138xCD38、CD138xAPRIL、CD138xCD79A、CD138xCD79B、CD138xBCMA和CD138xCS1。
实施方案24.如实施方案21所述的CAR-T细胞，其中所述CAR特异性结合选自以下的两种不同靶标：CD123xCD371、CD123xCLEC12A、CD123xCD117、CD123xFLT3、CD123xCD7、CD123xTim3、CD371xCLEC12A、CD371xCD117、CD371xFLT3、CD371xCD7、CD371xTim3、CLEC12AxCD117、CLEC12AxFLT3、CLEC12AxCD7、CLEC12AxTim3、CD117xFLT3、CD117xCD7、CD117xTim3、FLT3xCD7、FLT3xTim3和CD7xTim3。
实施方案25.一种如实施方案21-24中任一项所述的双CAR-T细胞。
实施方案26.一种如实施方案21-34中任一项所述的串联CAR-T细胞。
实施方案27.如实施方案1-26中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞还包含自杀基因。
实施方案28.如实施方案1-26中任一项所述的CAR-T细胞，其中内源性T细胞受体介导的信号传导在所述CAR-T细胞中被阻断。
实施方案29.如实施方案1-26中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞不诱发同种异体反应性或移植物抗宿主疾病。
实施方案30.如实施方案1-26中任一项所述的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞不引起自相残杀。
实施方案31.一种双或串联嵌合抗原受体(dCAR或tCAR)，其靶向两种或更多种浆细胞抗原。
实施方案32.如实施方案31所述的CAR，其中所述浆细胞抗原选自BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138和CD19。
实施方案33.如实施方案32所述的CAR，其中所述CAR特异性结合选自以下的两种不同靶标：BCMAxCS1、BCMAxCD19、BCMAxCD38、CS1xCD19、CD19xCD38、APRILxCS1、APRILxBCMA、APRILxCD19、APRILxCD38、CS1xCD38、CD79AxBCMA、CD79AxCS1、CD79AxCD19、CD79AxCD38、CD79AxCD38、CD79AxAPRIL、CD79AxCD79B、CD79BxBCMA、CD79BxCS1、CD79BxCD19、CD79BxCD38、CD79BxAPRIL、CD79BxCD79A、CD138xBCMA、CD138xCS1、CD138xCD19、CD138xCD38、CD138xAPRIL、CD138xCD79A、CD138xCD79B、CD138xBCMA和CD138xCS1。
实施方案34.如实施方案31-33中任一项所述的CAR，其中所述CAR是dCAR。
实施方案35.如实施方案31-33中任一项所述的CAR，其中所述CAR是tCAR。
实施方案36.一种双或串联嵌合抗原受体(dCAR或tCAR)，其靶向两种或更多种白血病细胞抗原。
实施方案37.如实施方案36所述的CAR，其中所述浆细胞抗原选自CD123、CLEC12A、CD117、FLT3、CD7和Tim3。
实施方案38.如实施方案37所述的CAR，其中所述CAR特异性结合选自以下的两种不同靶标：CD123xCD371、CD123xCLEC12A、CD123xCD117、CD123xFLT3、CD123xCD7、CD123xTim3、CD371xCLEC12A、CD371xCD117、CD371xFLT3、CD371xCD7、CD371xTim3、CLEC12AxCD117、CLEC12AxFLT3、CLEC12AxCD7、CLEC12AxTim3、CD117xFLT3、CD117xCD7、CD117xTim3、FLT3xCD7、FLT3xTim3和CD7xTim3。
实施方案39.如实施方案36-38中任一项所述的CAR，其中所述CAR是dCAR。
实施方案40.如实施方案36-38中任一项所述的CAR，其中所述CAR是tCAR。
实施方案41.一种串联嵌合抗原受体(tCAR)，其靶向两种或更多种T细胞抗原。
实施方案42.如实施方案41所述的tCAR，其中所述T细胞抗原选自CD5、CD7、CD2、CD4和CD3。
实施方案43.如实施方案42所述的tCAR，其靶向一对(即两个)抗原。
实施方案44.如实施方案43所述的tCAR，其中所述抗原对选自CD2xCD3ε、CD2xCD4、CD2xCD5、CD2xCD7、CD3εxCD4、CD3εxCD5、CD3εxCD7、CD4xCD5、CD4xCD7、CD5xCD7、TRACxCD2、TRACxCD3ε、TRACxCD4、TRACxCD5、TRACxCD7、TCRβxCD2、TCRβxCD4、TCRβxCD7、CD2xCD3ε、CD2xCD4、CD2xCD5、CD2xCD7、CD3εxCD4、CD3εxCD5、CD4xCD5、CD4xCD7、CD5xCD7、TRACxCD2、TRACxCD3ε、TRACxCD4、TRACxCD5、TRACxCD7、TCRβxCD2、TCRβxCD3ε、TCRβxCD4、TCRβxCD5和TCRβxCD7。
实施方案45.如实施方案43所述的tCAR，其中所述抗原对选自CD2xCD3ε、CD2xCD4、CD2xCD5、CD2xCD7、CD3εxCD4、CD3εxCD5、CD3εxCD7、CD4xCD5、CD4xCD7和CD5xCD7。
实施方案46.如实施方案35和40-45中任一项所述的tCAR，其中所述CAR构建体是线性tCAR构建体。
实施方案47.如实施方案46所述的tCAR，其中所述线性tCAR构建体包含第一重(V
实施方案48.如实施方案46所述的tCAR，其中所述线性tCAR构建体包含第一重(V
实施方案49.如实施方案46所述的tCAR，其中所述线性tCAR构建体包含第一轻(V
实施方案50.如实施方案46所述的tCAR，其中所述线性tCAR构建体包含第一轻(V
实施方案51.如实施方案46所述的tCAR，其中所述线性tCAR构建体包含选自7-I至7-XXXII的结构。
实施方案52.如实施方案35和40-45中任一项所述的tCAR，其中所述CAR构建体是发夹tCAR构建体。
实施方案53.如实施方案52所述的tCAR，其中所述发夹tCAR构建体包含衍生自第一scFv的第一重(V
实施方案54.如实施方案52所述的tCAR，其中所述发夹tCAR构建体包含衍生自第二scFv的第二重(V
实施方案55.如实施方案52所述的tCAR，其中所述发夹tCAR构建体包含衍生自第一scFv的第一轻(V
实施方案56.如实施方案52所述的tCAR，其中所述发夹tCAR构建体包含衍生自第二scFv的第二轻(V
实施方案57.如实施方案52所述的tCAR，其中所述发夹tCAR构建体包含选自9-I至9-XXXII的结构。
实施方案58.如实施方案35和40-45中任一项所述的tCAR，其中所述CAR构建体是在所述接头中具有(Cys＝Cys)双链键(DSB)的发夹DSB tCAR构建体。
实施方案59.如实施方案58所述的tCAR，其中所述发夹tCAR构建体包含衍生自第一scFv的第一重(V
实施方案60.如实施方案58所述的tCAR，其中所述发夹tCAR构建体包含衍生自第二scFv的第二重(V
实施方案61.如实施方案58所述的tCAR，其中所述发夹tCAR构建体包含衍生自第一scFv的第一轻(V
实施方案62.如实施方案58所述的tCAR，其中所述发夹tCAR构建体包含衍生自第二scFv的第二轻(V
实施方案63.如实施方案58所述的tCAR，其中所述发夹DSB tCAR构建体包含选自11-I至11-XXXII的结构。
实施方案64.如实施方案41-63中任一项所述的tCAR，其中所述V
实施方案65.如实施方案64所述的tCAR，其中所述V
实施方案66.如实施方案64所述的tCAR，其中所述V
实施方案67.如实施方案64所述的tCAR，其中所述V
实施方案68.如实施方案35、39和41-67中任一项所述的tCAR，其包含选自CD28和4-1BB的至少一个共刺激结构域。
实施方案69.如实施方案68所述的tCAR，其中所述共刺激结构域是CD28。
实施方案70.如实施方案35和40-69中任一项所述的tCAR，其包含CD3
实施方案71.如实施方案41-63和68-70中任一项所述的tCAR，其中所述V
实施方案72.如实施方案64所述的tCAR，其中所述tCAR构建体选自克隆5、克隆6、克隆7、克隆8、克隆13、克隆14、克隆15和克隆16。
实施方案73.如实施方案64所述的tCAR，其中所述tCAR构建体对选自SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:46的氨基酸序列表现出至少95％的序列同一性。
实施方案74.一种串联嵌合抗原受体(CAR)T细胞(tCAR-T细胞)，其包含靶向两种或更多种T细胞抗原的tCAR，如实施方案35和40-73中任一项所述。
实施方案75.如实施方案74所述的tCAR-T细胞，其中所述细胞缺乏所述一种或多种CAR所特异性结合的一种或多种抗原。
实施方案76.如实施方案74和75中任一项所述的tCAR-T细胞，其中所述tCAR-T细胞缺乏T细胞受体复合物的亚基。
实施方案77.如实施方案76所述的tCAR-T细胞，其中所述T细胞受体复合物的所述亚基选自TCRα(TRAC)、TCRβ、TCRδ、TCRγ、CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3ζ。
实施方案78.如实施方案77所述的tCAR-T细胞，其中所述T细胞受体复合物的所述亚基选自TCRα(TRAC)和CD3ε。
实施方案79.如实施方案78所述的tCAR-T细胞，其中所述T细胞受体复合物的所述亚基是TRAC。
实施方案80.如实施方案35和40-79中任一项所述的tCAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞还包含自杀基因。
实施方案81.如实施方案35和40-80中任一项所述的tCAR-T细胞，其中内源性T细胞受体介导的信号传导在所述CAR-T细胞中被阻断。
实施方案82.如实施方案35和40-81中任一项所述的tCAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞不诱发同种异体反应性或移植物抗宿主疾病。
实施方案83.如实施方案35和40-82中任一项所述的tCAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞不引起自相残杀。
实施方案84.一种具有靶向CD2和CD3的CAR的串联CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞缺乏T细胞受体复合物的亚基并且缺乏CD2。
实施方案85.如实施方案85所述的CAR-T细胞，其中所述CAR对选自SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:44的氨基酸序列表现出至少95％的序列同一性。
实施方案86.如实施方案85所述的CAR-T细胞，其中所述CAR对选自SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:44的氨基酸序列表现出至少98％的序列同一性。
实施方案87.如实施方案85所述的CAR-T细胞，其中所述CAR是选自SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:44的氨基酸序列。
实施方案88.一种具有靶向CD2和CD7的CAR的串联CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞缺乏T细胞受体复合物的亚基并且缺乏CD2和CD7。
实施方案89.如实施方案88所述的CAR-T细胞，其中所述CAR对选自SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:46的氨基酸序列表现出至少95％的序列同一性。
实施方案90.如实施方案88所述的CAR-T细胞，其中所述CAR对选自SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:46的氨基酸序列表现出至少98％的序列同一性。
实施方案91.如实施方案88所述的CAR-T细胞，其中所述CAR是选自SEQ ID NO:45至SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
实施方案92.一种CAR-T细胞，其包含靶向CD7的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR-T细胞缺乏TRAC并且缺乏CD7，并且包含CD28共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。
实施方案93.如实施方案92所述的CAR-T细胞，其中所述CAR对选自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:39的氨基酸序列表现出至少95％的序列同一性。
实施方案94.如实施方案92所述的CAR-T细胞，其中所述CAR对选自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:39的氨基酸序列表现出至少98％的序列同一性。
实施方案95.如实施方案92所述的CAR-T细胞，其中所述CAR是选自SEQ ID NO:32至SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
一种治疗组合物，其包含如实施方案1-30和74-95中任一项所述的CAR-T细胞的群，或包含包括如实施方案31-73中任一项所述的CAR的CAR-T细胞群，以及至少一种治疗学上可接受的载剂和/或佐剂。
实施方案96.一种治疗患者的癌症的方法，其包括向有需要的患者施用如实施方案1-30和74-95中任一项所述的基因组编辑的CAR-T细胞、基因组编辑的CAR-T细胞群、双CAR-T细胞或串联CAR-T，或包含如实施方案31-73中任一项所述的CAR的CAR-T细胞群。
实施方案97.如实施方案97所述的方法，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤。
实施方案98.如实施方案98所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是T细胞恶性肿瘤。
实施方案99.如实施方案99所述的方法，其中所述T细胞恶性肿瘤是T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)。
实施方案100.如实施方案99所述的方法，其中所述T细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。
实施方案101.如实施方案99所述的方法，其中所述T细胞恶性肿瘤是T细胞慢性淋巴细胞性白血病(T-CLL)。
实施方案102.如实施方案98所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
实施方案103.如实施方案98所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是急性髓性白血病(AML)。
实施方案104.一种制备如以上或本文任何实施方案所述的CAR-T细胞的方法，其使用Cas9-CRISPR和选自本文公开的那些的gRNA实现。
实施方案105.一种制备如以上或本文任何实施方案所述的CAR-T细胞的方法，其使用Cas9-CRISPR和选自表12和表15-47公开的那些的gRNA实现。
实施方案106.一种制备如以上或本文任何实施方案所述的CAR-T细胞的方法，其使用Cas9-CRISPR和选自表12公开的那些和表15-47中用粗体显示的那些的gRNA实现。
实施方案107.一种制备如以上或本文任何实施方案所述的CAR-T细胞的方法，其使用Cas9-CRISPR和选自表12公开的那些的gRNA实现。
M
本文公开了一种基因组编辑的CAR-T细胞，其衍生自辅助T细胞、细胞毒性T细胞、病毒特异性细胞毒性T细胞、记忆T细胞或gamma delta(γδ)T细胞，其包含靶向一种或多种抗原的一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR-T细胞缺乏一种或多种CAR所特异性结合的一种或多种抗原。
还提供了一种基因组编辑的CAR-T细胞，其衍生自辅助T细胞、细胞毒性T细胞、病毒特异性细胞毒性T细胞、记忆T细胞或gamma delta(γδ)T细胞，其包含靶向一种或多种抗原的一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR-T细胞缺乏T细胞受体复合物的亚基以及一种或多种CAR所特异性结合的一种或多种抗原。
还提供了一种CAR-T细胞，其衍生自辅助T细胞、细胞毒性T细胞、病毒特异性细胞毒性T细胞、记忆T细胞或gamma delta(γδ)T细胞，其中T细胞受体复合物的缺乏亚基选自TCRα、TCRβ、TCRδ、TCRγ、CD3ε、CD3γ、CD3δ和CD3ζ。
在某些实施方案中，嵌合抗原受体特异性结合在恶性T细胞上表达的至少一种抗原。
在某些实施方案中，一种或多种抗原选自BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim-3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56和CD1a。
在某些实施方案中，CAR-T细胞还包含自杀基因治疗系统。
在某些实施方案中，内源性T细胞受体介导的信号传导在CAR-T细胞中被阻断。
在某些实施方案中，CAR-T细胞不诱发同种异体反应性或移植物抗宿主疾病。
在某些实施方案中，CAR-T细胞不引起自相残杀。
还提供了一种双或串联CAR-T细胞。
还提供了一种药物组合物，其包含如本文公开的CAR-T细胞群，以及至少一种治疗学上可接受的载剂和/或佐剂。
还提供了用于治疗血液系统恶性肿瘤的方法，其包括向有需要的患者施用基因组编辑的CAR-T细胞、基因组编辑的CAR-T细胞群，其中基因组编辑的CAR-T细胞群是如本文公开的单CAR-T细胞、双CAR-T细胞或串联CAR-T细胞，或包含如本文公开的所述细胞的药物组合物。
在某些实施方案中，血液系统恶性肿瘤是T细胞恶性肿瘤。
在某些实施方案中，T细胞恶性肿瘤是T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)。
在某些实施方案中，T细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。
在某些实施方案中，T细胞恶性肿瘤是T细胞慢性淋巴细胞性白血病(T-CLL)。
在某些实施方案中，血液系统恶性肿瘤是多发性骨髓瘤。
在某些实施方案中，血液系统恶性肿瘤是急性髓性白血病(AML)。
CAR-T细胞
本公开提供了携带嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)、包含所述细胞的药物组合物，以及用于治疗癌症，特别是血液系统恶性肿瘤的免疫治疗方法。
CAR-T细胞是表达嵌合抗原受体的T细胞。表达CAR分子的T细胞可以是辅助T细胞、细胞毒性T细胞、病毒特异性细胞毒性T细胞、记忆T细胞或gamma delta(γδ)T细胞。
嵌合抗原受体(CAR)是包含以下的重组融合蛋白：1)细胞外配体结合结构域，即抗原识别结构域，2)跨膜结构域，以及3)信号转导结构域。
细胞外配体结合结构域是能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，细胞外配体结合结构域将能够与细胞表面分子相互作用，所述分子可以是抗原、受体、肽配体、靶标的蛋白质配体，或靶标的多肽。细胞外配体结合结构域可以约0.1pM至约10pM，至约0.1pM至约1pM，或更优选地至约0.1pM至约100nM之间的亲和常数或相互作用亲和力(K
在一个实施方案中，细胞外配体结合结构域包括包含通过接头(例如，GGGGS
在恶性T细胞上表达的CAR靶向的抗原的非限制性实例包括CD5、CD7、CD2、CD4和CD3。在一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞包含具有特异性结合CD5的细胞外配体结合结构域的嵌合抗原受体。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞包含具有特异性结合CD7的细胞外配体结合结构域的嵌合抗原受体。换句话说，特异性结合CD7的CAR包含细胞外配体结合结构域，其包含对选自SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列表现出至少80％、90％、95％、97％或99％的同一性的多肽序列，并且通过包含序列(GGGGS)
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞包含具有特异性结合CD2的细胞外配体结合结构域的嵌合抗原受体。换句话说，特异性结合CD2的CAR包含细胞外配体结合结构域，其包含对选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13或SEQ ID:14和SEQ ID NO:15的氨基酸序列表现出至少80％、90％、95％、97％或99％的同一性的多肽序列，并且通过包含序列(GGGGS)
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞包含具有特异性结合CD4的细胞外配体结合结构域的嵌合抗原受体。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞包含特异性结合CD3的嵌合抗原受体的细胞外配体结合结构域。换句话说，特异性结合CD3的CAR包含细胞外配体结合结构域，其包含对选自SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17或SEQ ID:18和SEQ ID NO:19的氨基酸序列表现出至少80％、90％、95％、97％或99％的同一性的多肽序列，并且通过包含序列(GGGGS)
在白血病细胞(例如，异常成髓细胞、红血细胞或血小板)的表面上表达的CAR靶向抗原的非限制性实例包括CD123(IL3RA)、CD371(CLL-1；CLEC12A)、CD117(c-kit)和CD135(FLT3)、CD7以及Tim3。可使用靶向这些抗原的细胞外配体结合结构域构建CAR，以用于治疗白血病，即急性髓性白血病(AML)。
在多发性骨髓瘤细胞(例如，恶性浆细胞)的表面上表达的CAR靶向抗原的非限制性实例包括BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138和CD19。可使用靶向这些抗原的细胞外配体结合结构域构建CAR，以用于治疗多发性骨髓瘤。在另一个实施方案中，可使用靶向B细胞成熟抗原(BCMA)和跨膜激活剂-CAML相互作用因子(Transmembrane Activator and CAMLInteractor，TACI)的配体(其有效共靶向BCMA和TACI)的APRIL蛋白质的一部分构建CAR，以用于治疗多发性骨髓瘤。信号肽指导分泌或跨膜蛋白运输至细胞膜和/或细胞表面，以使多肽正确定位。具体地，本公开的信号肽将附加多肽(即，CAR受体)引导至细胞膜，其中附加多肽的细胞外配体结合结构域展示在细胞表面上，附加多肽的跨膜结构域跨越细胞膜，并且附加多肽的信号转导结构域处于细胞的胞质部分中。在一个实施方案中，信号肽是来自人CD8α的信号肽(SEQ ID NO:1)。在一个实施方案中，信号肽是CD8α信号肽的功能片段。功能片段定义为CD8α信号肽的将附加多肽引导至细胞膜和/或细胞表面的至少10个氨基酸的片段。人CD8α信号肽的功能片段的实例包括氨基酸序列MALPVTALLLPLALLLHAA、MALPVTALLLP、PVTALLLPLALL和LLLPLALLLHAARP。
通常，细胞外配体结合结构域通过跨膜结构域(Tm)与嵌合抗原受体(CAR)的信号转导结构域连接。跨膜结构域横穿细胞膜，将CAR锚定至T细胞表面，并将细胞外配体结合结构域与信号转导结构域连接，从而影响CAR在T细胞表面的表达。
本公开的跨膜结构域的区别性特征是在免疫细胞的表面上表达以指导针对预限定的靶细胞的免疫细胞应答的能力。跨膜结构域可以来源于天然或合成来源。可替代地，本公开的跨膜结构域可衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。
本公开的跨膜多肽的非限制性实例是T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CDS、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CDS0、CD86、CD134、CD137和CD154。可替代地，跨膜结构域可以是合成的，并且主要包含疏水性氨基酸残基(例如，亮氨酸和缬氨酸)。在一个实施方案中，跨膜结构域衍生自T细胞表面糖蛋白CD8α链同种型1前体(NP_001139345.1)(SEQ ID NO:4)，并且更优选地CD28(SEQ ID NO:3)。
跨膜结构域还可以包含介于细胞外配体结合结构域与所述跨膜结构域之间的铰链区。术语“铰链区”通常是指用于将跨膜结构域与细胞外配体结合结构域连接的任何寡肽或多肽。具体地讲，铰链区用于为细胞外配体结合结构域提供更多灵活性和可接近性。铰链区可包含最多至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸并且最优选地25至50个氨基酸。铰链区可来源于整个或部分诸如CD28、4-1BB(CD137)、OX-40(CD134)、CD3ζ、T细胞受体α或β链、CD45、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、ICOS、CD154的天然存在的分子，或来源于整个或部分抗体恒定区。可替代地，铰链区可以是与天然存在的铰链序列相对应的合成序列，或铰链区可以是完全合成的铰链序列。在一个实施方案中，铰链结构域包含人CD8α(SEQ ID NO:2)、FcγRIIIα受体或IgGl的一部分，并且与其具有至少80％、90％、95％、97％或99％的序列同一性。
本公开的嵌合抗原受体(CAR)包含CAR的信号转导结构域或细胞内信号传导结构域，其负责在细胞外配体结合结构域与靶标结合后进行细胞内信号传导，从而导致免疫细胞和免疫应答的激活。换句话说，信号转导结构域负责激活CAR在其中表达的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或包括细胞因子分泌的辅助T细胞活性。因此，术语“信号转导结构域”是指蛋白质的转导效应子功能信号并且指导细胞执行特化功能的部分。
用于CAR中的信号转导结构域的实例可以是T细胞受体和共受体的配合作用来起始抗原受体接合之后的信号转导的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何合成序列。信号转导结构域包括两类不同的细胞质信号传导序列，即起始抗原依赖性初级激活的那些以及以不依赖抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些。初级细胞质信号传导序列可以包含信号传导基序，所述信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。ITAM是存在于多种受体的胞质内尾中的良好限定的信号传导基序，其用作syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。可以用于本公开的ITAM的非限制性实例可以包括衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一个实施方案中，CAR的信号转导结构域可以包含具有与其具有至少80％、90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列的CD3ζ信号传导结构域。
另外，本公开的CAR-T细胞还可包含一种或多种自杀基因治疗系统。本领域已知的合适的自杀基因治疗系统包括但不限于几种单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)/更昔洛韦(GCV)或诱导型半胱天冬酶9蛋白。在一个实施方案中，自杀基因是嵌合CD34/胸苷激酶。
本文公开的T细胞可缺乏嵌合抗原受体所特异性结合的抗原并且因此是具有自相残杀抗性的。在一些实施方案中，T细胞的抗原经过修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰抗原。例如，嵌合抗原受体所识别的抗原的表位可通过一种或多种氨基酸变化(例如，取代或缺失)进行修饰，或表位可从抗原中缺失。在其他实施方案中，抗原的表达在T细胞中降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。用于降低蛋白质表达的方法是本领域已知的，并且包括但不限于修饰或替换与编码该蛋白质的核酸序列可操作地连接的启动子。在其他实施方案中，对T细胞进行修饰，使得不表达抗原，例如通过使编码抗原的基因缺失或受破坏。在以上实施方案中的每一个中，T细胞可缺乏嵌合抗原受体所特异性地结合的一种或优选所有抗原。用于对T细胞进行基因修饰以使其缺乏抗原的方法是本领域众所周知的，并且上文提供了非限制性实例。在一个示例性实施方案中，CRISPR/cas9基因编辑可以用于对T细胞进行修饰以使其缺乏抗原，例如，如下文所述。可替代地，可使用TALEN编辑基因。
在以上方法的变型中，可将编码一种或多种蛋白表达阻断剂(PEBL)的构建体转导到细胞中，作为编辑步骤或编辑步骤的一部分，或作为CAR转导的一部分。例如，可转导编码对CD3ε具有特异性的抗体衍生的单链可变片段的构建体，例如通过慢病毒载体。一旦表达，PEBL就与CD3ε在细胞内共定位，从而阻断表面CD3和TCRαβ表达。因此，表面CD3/TCRαβ表达的PEBL阻滞是制备同种异体CAR-T细胞的替代方法。此外，PEBL和CAR表达可以组合于单个构建体中。这些方法中的任一种可使用本文公开的方法实现，并且可产生PEBL以用于阻滞本文公开的基因抑制的任何靶标。
上文所述的方法可适于将CAR插入编码抗原、细胞表面蛋白或可分泌蛋白诸如细胞因子的基因的基因座中。以此方式，通过CAR的转染实现基因组的编辑。此后，可如本文所述将细胞激活，从而在某些实施方案中去除单独的基因组编辑步骤。理想地，应在细胞主动分裂的同时执行这一步骤。还预期此类方法导致工程改造细胞的稳健扩增。
在某些情况下，可选择缺乏嵌合抗原受体所特异性结合的抗原的T细胞。某些T细胞将产生并展示出较少的给定表面蛋白，相反，如果将作为T-CAR靶标的抗原缺失或非功能化，可以选择缺乏该抗原的T细胞，并且对缺乏抗原的细胞群进行扩增以用于CAR的转导。这样的细胞也将具有自相残杀抗性。
表1.不同CAR组分的氨基酸序列。
表2.scFv的可变重链(V
单CAR-T细胞(mCAR-T)
本公开涵盖的CAR-T细胞缺乏嵌合抗原受体所特异性结合的一种或多种抗原并且因此是具有自相残杀抗性的。在一些实施方案中，T细胞的一种或多种抗原经过修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合一种或多种经修饰抗原。例如，嵌合抗原受体识别的一种或多种抗原的表位可通过一种或多种氨基酸变化(例如，取代或缺失)进行修饰，或表位可从抗原中缺失。在其他实施方案中，一种或多种抗原的表达在T细胞中降低至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多。用于降低蛋白质表达的方法是本领域已知的，并且包括但不限于修饰或替换与编码该蛋白质的核酸序列可操作地连接的启动子。在其他实施方案中，对T细胞进行修饰，使得不表达一种或多种抗原，例如通过使编码一种或多种抗原的基因缺失或受破坏。在以上实施方案中的每一个中，CAR-T细胞可缺乏嵌合抗原受体所特异性地结合的一种或优选所有抗原。对T细胞进行基因修饰以使其缺乏一种或多种抗原的方法是本领域众所周知的，并且本文提供了非限制性实例。在实施例1-6所述的实施方案中，使用CRISPR-Cas9系统修饰T细胞，以使其缺乏一种或多种抗原。
本公开涵盖的CAR-T细胞可由于缺失T细胞受体(TCR)-CD3复合物的一部分而进一步缺乏内源性T细胞受体(TCR)信号传导。在各种实施方案中，可期望消除或抑制本文公开的CAR-T细胞中的内源性TCR信号传导。例如，当使用同种异体T细胞产生CAR-T细胞时，减少或消除CAR-T细胞中的内源性TCR信号传导可预防或减少移植物抗宿主疾病(GvHD)。用于消除或抑制内源性TCR信号传导的方法是本领域已知的，并且包括但不限于缺失TCR-CD3受体复合物的一部分，例如，TCR受体α链(TRAC)、TCR受体β链(TCRβ)、TCRδ、TCRγ、CD3ε、CD3γ和/或CD3δ。缺失TCR受体复合物的一部分可阻断TCR介导的信号传导，并且因此可允许安全地使用同种异体T细胞作为CAR-T细胞的来源，而不引起威及生命的GvHD。
另外，本公开涵盖的CAR-T细胞还可包含一种或多种如本文所述的自杀基因。
在一个实施方案中，本公开提供一种包含特异性结合CD5的嵌合抗原受体的T细胞，其中T细胞缺乏CD5，例如CD5ΔCART5细胞。在非限制性实例中，CD5的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD5进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD5，(b)对T细胞进行修饰，使得抗原的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD5不表达(例如，通过编码CD5的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因和/或修饰，使得内源性T细胞受体(TCR)介导的信号传导在T细胞中被阻断。在非限制性实例中，在CD5ΔCART5细胞中表达与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列。
在另一个实施方案中，本公开提供一种包含特异性结合CD7的嵌合抗原受体的T细胞，其中T细胞缺乏CD7，例如CD7ΔCART7细胞。在非限制性实例中，CD7的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD7，(b)对T细胞进行修饰，使得抗原的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7不表达(例如，通过编码CD7的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因和/或修饰，使得内源性T细胞受体(TCR)介导的信号传导在T细胞中被阻断。在非限制性实例中，在CD7ΔCART7细胞中表达与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列。
在另一个实施方案中，本公开提供一种包含特异性结合CD2的嵌合抗原受体的T细胞，其中T细胞缺乏CD2，例如CD2ΔCART2细胞。在非限制性实例中，CD2的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD2，(b)对T细胞进行修饰，使得抗原的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2不表达(例如，通过编码CD2的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因和/或修饰，使得内源性T细胞受体(TCR)介导的信号传导在T细胞中被阻断。在非限制性实例中，在CD2ΔCART2细胞中表达与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列。
在另一个实施方案中，本公开提供一种包含特异性结合CD4的嵌合抗原受体的T细胞，其中T细胞缺乏CD4，例如CD4ΔCART4细胞。在非限制性实例中，CD4的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD4进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD4，(b)对T细胞进行修饰，使得抗原的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD4不表达(例如，通过编码CD4的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因和/或修饰，使得内源性T细胞受体(TCR)介导的信号传导在T细胞中被阻断。在非限制性实例中，在CD4ΔCART4细胞中表达与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列。
在另一个实施方案中，本公开提供一种包含特异性结合CD3的嵌合抗原受体的T细胞，其中T细胞缺乏CD3ε，例如CD3ΔCART3e细胞。在非限制性实例中，CD3的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD3进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD3，(b)对T细胞进行修饰，使得抗原的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD3不表达(例如，通过编码CD3ε的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因和/或修饰，使得内源性T细胞受体(TCR)介导的信号传导在T细胞中被阻断。在非限制性实例中，在CD3ΔCART3ε细胞中表达与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合的经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列。
公开了可以在衍生自细胞毒性T细胞、记忆T细胞或gamma delta(γδ)T细胞的基因组编辑的CAR-T细胞的表面上表达的CAR氨基酸序列的实施方案。
表3.单嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列。
以类似的方式，可构建其他单CAR-T细胞并在下表4中给出。
表4.单CAR和CAR-T。
双CAR-T细胞(dCAR-T)
可通过以下方式产生双CAR-T细胞(dCAR-T)：将编码第一细胞外配体结合结构域的序列的蛋白质克隆到包含一个或多个共刺激结构域和信号转导结构域的慢病毒载体中，并且将编码第二细胞外配体结合结构域的序列的第二蛋白质克隆到包含另外的一个或多个共刺激结构域和信号转导结构域的相同慢病毒载体中，从而产生质粒，从所述质粒中由相同载体表达两种CAR构建体。
在一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含双嵌合抗原受体(dCAR)，即，编码由单一慢病毒构建体表达的两种CAR的序列的蛋白质，其特异性结合CD5和TCR受体α链(TRAC)，其中T细胞缺乏CD5和TRAC(例如，CD5*TRAC-dCARTΔCD5ΔTRAC细胞)。在非限制性实例中，CD5和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD5和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD5和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD5和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD5和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD5和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合并且在CD5*TRAC-CARTΔCD5ΔTRAC细胞中表达。
在第二实施方案中，本公开提供一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD7和TCR受体α链(TRAC)的dCAR，其中T细胞缺乏CD7和TRAC，例如CD7*TRAC-dCARTΔCD7ΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD7和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD5和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD7和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD7和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合并且在CD7*TRAC-dCARTΔCD7ΔTRAC细胞中表达。
在第三实施方案中，本公开提供一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD2和TCR受体α链(TRAC)的dCAR，其中T细胞缺乏CD2和TRAC，例如CD2*TRAC-dCARTΔCD2ΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD2和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD2和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD2和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合并且在CD2*TRAC-dCARTΔCD2ΔTRAC细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD4和TCR受体α链(TRAC)的dCAR，其中T细胞缺乏CD4和TRAC，例如CD4*TRAC-dCARTΔCD4ΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD4和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD4和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD4和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD4和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD4和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合并且在CD4*TRAC-dCARTΔCD4ΔTRAC细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD3和TCR受体α链(TRAC)的dCAR，其中T细胞缺乏CD3和TRAC，例如CD3*TRAC-dCARTΔCD3TRAC细胞。在非限制性实例中，CD3和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD3和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD3和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD3和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD3和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD3和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合并且在CD3*TRAC-dCARTΔCD3ΔTRAC细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD2和CD3 epsilon(ε)链的dCAR，其中T细胞缺乏CD2和CD3ε，例如CD2*CD3ε-dCARTΔCD2ΔCD3ε细胞。在非限制性实例中，CD2和CD3 epsilon(ε)链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和CD3ε进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD2和CD3ε，(b)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD3ε的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD3ε不表达(例如，通过编码CD2和/或CD3ε的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合并且在CD2*CD3ε-dCARTΔCD2ΔCD3ε细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD4和CD3 epsilon(ε)链的dCAR，其中T细胞缺乏CD2和CD3ε，例如CD4*CD3ε-dCARTΔCD4ΔCD3ε细胞。在非限制性实例中，CD4和CD3ε链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD4和CD3ε进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD4和CD3ε，(b)对T细胞进行修饰，使得CD4和CD3ε的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD4和CD3ε不表达(例如，通过编码CD4和/或CD3ε的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合并且在CD4*CD3ε-dCARTΔCD4ΔCD3ε细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD5和TCR beta(β)链的dCAR，其中T细胞缺乏CD5和TCRβ，例如，CD5*TCRβ-dCARTΔCD5ΔTCRβ细胞。在非限制性实例中，CD5和TCRβ链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD5和TCRβ进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD5和TCRβ，(b)对T细胞进行修饰，使得CD5和TCRβ的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD5和TCRβ不表达(例如，通过编码CD5和/或TCRβ的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，在CD5*TCRβ-dCARTΔCD5ΔTCRβ细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD7和TCR beta(β)链的dCAR，其中T细胞缺乏CD5和TCRβ，例如，CD7*TCRβ-dCARTΔCD7ΔTCRβ细胞。在非限制性实例中，CD7和TCRβ链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7和TCRβ进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD7和TCRβ，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCRβ的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCRβ不表达(例如，通过编码CD7和/或TCRβ的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，在CD7*TCRβ-dCARTΔCD7ΔTCRβ细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD2和TCR beta(β)链的dCAR，其中T细胞缺乏CD2和TCRβ，例如，CD2*TCRβ-dCARTΔCD7ΔTCRβ细胞。在非限制性实例中，CD2和TCRβ链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和TCRβ进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD2和TCRβ，(b)对T细胞进行修饰，使得CD2和TCRβ的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和TCRβ不表达(例如，通过编码CD2和/或TCRβ的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD2*TCRβ-dCARTΔCD2ΔTCRβ细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD4和TCR beta(β)链的dCAR，其中T细胞缺乏CD2和TCRβ，例如，CD4*TCRβ-dCARTΔCD4ΔTCRβ细胞。在非限制性实例中，CD4和TCRβ链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD4和TCRβ进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD4和TCRβ，(b)对T细胞进行修饰，使得CD4和TCRβ的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD4和TCRβ不表达(例如，通过编码CD4和/或TCRβ的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD4*TCRβ-dCARTΔCD4ΔTCRβ细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD7和CD2的dCAR，其中T细胞缺乏CD7和CD2，例如，CD7*CD2-dCARTΔCD7ΔCD2细胞。在非限制性实例中，CD7和CD2的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7和CD2进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD7和CD2，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD2的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD2不表达(例如，通过编码CD7和/或CD2的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD7*CD2-dCARTΔCD7ΔCD2细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD7和CD5的dCAR，其中T细胞缺乏CD7和CD5，例如，CD7*CD5-dCARTΔCD7ΔCD5细胞。在非限制性实例中，CD7和CD5的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7和CD5进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD7和CD5，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD5的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD5不表达(例如，通过编码CD7和/或CD5的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合并且在CD7*CD5-dCARTΔCD7ΔCD5细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD7和CD4的dCAR，其中T细胞缺乏CD7和CD4(例如，CD7*CD4-dCARTΔCD7ΔCD4细胞)。在非限制性实例中，CD7和CD4的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7和CD4进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD7和CD4，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD4的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD4不表达(例如，通过编码CD7和/或CD4的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，在CD7*CD4-dCARTΔCD7ΔCD4细胞中表达自杀基因，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因与人CD34cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD7*CD4-dCARTΔCD7ΔCD4细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD2和CD5的dCAR，其中T细胞缺乏CD2、CD5和TRAC，例如，CD2*CD5-dCARTΔCD2ΔCD5ΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD2和CD5的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和CD5进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD2和CD5，(b)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD5的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD5不表达(例如，通过编码CD2和/或CD5的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD2*CD5-dCARTΔCD2ΔCD5细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD2和CD4的dCAR，其中T细胞缺乏CD2、CD4和TRAC，例如，CD2*CD4-dCARTΔCD2ΔCD4ΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD2和CD4的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和CD4进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD2和CD4，(b)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD4的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD4不表达(例如，通过编码CD2和/或CD4的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD2*CD4-dCARTΔCD2ΔCD4细胞中表达。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程改造的T细胞，其包含特异性结合CD5和CD4的dCAR，其中T细胞缺乏CD5和CD4,，例如，CD5*CD4-dCARTΔCD5ΔCD4细胞。在非限制性实例中，CD5和CD4的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD5和CD4进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD5和CD4，(b)对T细胞进行修饰，使得CD5和CD4的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD5和CD4不表达(例如，通过编码CD5和/或CD4的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合并且在CD5*CD4-dCARTΔCD5ΔCD4细胞中表达。
在一个实施方案中，双CAR-T细胞包含(i)第一嵌合抗原受体(CAR)多肽，其包含第一信号肽、第一细胞外配体结合结构域、第一铰链区、第一跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域，以及第一信号转导结构域；以及(ii)第二嵌合抗原受体多肽，其包含第二信号肽、第二细胞外配体结合结构域、第二铰链区、第二跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域以及第二信号转导结构域；其中第一细胞外配体结合结构域和第二细胞外配体结合结构域对不同的细胞表面分子具有亲和力；并且其中双CAR-T细胞具有一种或多种基因破坏，导致细胞表面分子在双CAR-T细胞中的表达降低。
在第二实施方案中，第一信号肽是CD8α信号序列。
在第三实施方案中，第一细胞外配体结合结构域是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的融合蛋白，所述可变区命名为V
在另一个实施方案中，第一铰链区包含CD8α。
在另一个实施方案中，第一跨膜结构域是CD8或CD28。
在一些实施方案中，第一共刺激结构域以任一顺序包含4-1BB、CD28，或两者的组合，即4-1BB-CD28或CD28-4-1BB。
在一些实施方案中，第一信号传导结构域是CD3ζ或CD3ζ二肽，即CD3ζ–CD3ζ。
在一些实施方案中，第二信号肽是SEQ NO:1的CD8α信号序列。
在一些实施方案中，第二细胞外配体结合结构域是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的融合蛋白，所述可变区命名为V
在另一个实施方案中，第二铰链区包含CD8α。
在另一个实施方案中，第二跨膜结构域是CD8或CD28。
在一些实施方案中，第二共刺激结构域以任一顺序包含4-1BB、CD28，或两者的组合，即4-1BB-CD28或CD28-4-1BB。
在一些实施方案中，第二信号传导结构域是CD3ζ或CD3ζ二肽，即CD3ζ–CD3ζ。
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一细胞外配体结合结构域融合蛋白V
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一细胞外配体结合结构域融合蛋白V
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一细胞外配体结合结构域融合蛋白V
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一细胞外配体结合结构域融合蛋白V
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一细胞外配体结合结构域融合蛋白V
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一细胞外配体结合结构域融合蛋白V
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一细胞外配体结合结构域融合蛋白V
在一些实施方案中，CAR多肽包含第一细胞外配体结合结构域融合蛋白V
在一些实施方案中，CAR多肽包含至少一个高效切割位点，其中高效切割位点选自P2A、T2A、E2A和F2A。
在一些实施方案中，CAR多肽包含自杀基因。
在一些实施方案中，CAR多肽包含突变细胞因子受体。
在一些实施方案中，双CAR-T细胞靶向选自CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD33、CD123(IL3RA)、CD371(CLL-1；CLEC12A)、CD117(c-kit)、CD135(FLT3)、BCMA、CS1、CD38、CD79A、CD79B、CD138和CD19、APRIL以及TACI的两种抗原。
下文在表5中给出双CAR的另外实例。
表5.双CAR和dCAR-T
串联CAR-T细胞(tCAR-T)
串联CAR-T细胞(tCAR-T)是具有单个嵌合抗原多肽的T细胞，所述多肽包含能够与两种不同的细胞表面分子相互作用的两个不同的细胞外配体结合结构域，其中细胞外配体结合结构域通过柔性接头连接在一起并共享一个或多个共刺激结构域，其中第一或第二细胞外配体结合结构域的结合将通过一个或多个共刺激结构域和信号转导结构域进行信号传导。
在一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD5并且第二细胞外配体结合结构域结合TCR受体α链(TRAC)，其中T细胞缺乏CD5和TRAC，例如CD5*TRAC-tCARTΔCD5ΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD5和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD5和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD5和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD5和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD5和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD5和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD5*TRAC-tCARTΔCD5ΔTRAC细胞中表达。
在第二实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD7并且第二细胞外配体结合结构域结合TCR受体α链(TRAC)，其中T细胞缺乏CD7和TRAC，例如CD7*TRAC-tCARTΔCD7ΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD7和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD7和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD7和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD7*TRAC-tCARTΔCD7ΔTRAC细胞中表达。
在第三实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD2并且第二细胞外配体结合结构域结合TCR受体α链(TRAC)，其中T细胞缺乏CD2和TRAC，例如CD2*TRAC-tCARTΔCD2ΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD2和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD2和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD2和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD2和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，在CD2*TRAC-tCARTΔCD2ΔTRAC细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD4并且第二细胞外配体结合结构域结合TCR受体α链(TRAC)，其中T细胞缺乏CD4和TRAC，例如CD4*TRAC-tCARTΔCD4ΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD4和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD4和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD4和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD4和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD4和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD4和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD4*TRAC-tCARTΔCD4ΔTRAC细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD3 epsilon(ε)链并且第二细胞外配体结合结构域结合TCR受体α链(TRAC)，其中T细胞缺乏CD3ε和TRAC，例如CD3ε*TRAC-tCARTΔCD3εΔTRAC细胞。在非限制性实例中，CD3ε和TCR受体α链(TRAC)的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD3ε和TCR受体α链(TRAC)进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD3ε和TCR受体α链(TRAC)，(b)对T细胞进行修饰，使得CD3ε和TCR受体α链(TRAC)的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD3ε和TCR受体α链(TRAC)不表达(例如，通过编码CD3ε和/或TCR受体α链(TRAC)的基因的缺失或破坏。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD3ε*TRAC-tCARTΔCD3εΔTRAC细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD2并且第二细胞外配体结合结构域结合CD3 epsilon(ε)链，其中T细胞缺乏CD2和CD3ε，例如CD2*CD3ε-tCARTΔCD2ΔCD3ε细胞。在非限制性实例中，CD2和CD3ε的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和CD3ε进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD2和CD3ε，(b)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD3ε的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD3ε不表达(例如，通过编码CD2和/或CD3ε的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD2*CD3ε-tCARTΔCD2ΔCD3ε细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD4并且第二细胞外配体结合结构域结合CD3 epsilon(ε)链，其中T细胞缺乏CD4和CD3ε，例如CD4*CD3ε-tCARTΔCD4ΔCD3ε细胞。在非限制性实例中，CD4和CD3ε的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD4和CD3ε进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD4和CD3ε，(b)对T细胞进行修饰，使得CD4和CD3ε的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD4和CD3ε不表达(例如，通过编码CD4和/或CD3ε的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD4*CD3ε-tCARTΔCD4ΔCD3ε细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD5并且第二细胞外配体结合结构域结合TCRβ链，其中T细胞缺乏CD5和TCRβ链，例如CD5*TCRβ-tCARTΔCD5ΔTCRβ细胞。在非限制性实例中，CD5和TCRβ链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD5和TCRβ进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD5和TCRβ，(b)对T细胞进行修饰，使得CD5和TCRβ的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD5和TCRβ不表达(例如，通过编码CD5和/或TCRβ的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD5*TCRβ-tCARTΔCD5ΔTCRβ细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD7并且第二细胞外配体结合结构域结合TCRβ链，其中T细胞缺乏CD7和TCRβ链，例如CD7*TCRβ-tCARTΔCD7ΔTCRβ细胞。在非限制性实例中，CD7和TCRβ链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7和TCRβ进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD7和TCRβ，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCRβ的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和TCRβ不表达(例如，通过编码CD7和/或TCRβ的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD7*TCRβ-tCARTΔCD7ΔTCRβ细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD2并且第二细胞外配体结合结构域结合TCRβ链，其中T细胞缺乏CD2和TCRβ链，例如CD2*TCRβ-tCARTΔCD7ΔTCRβ细胞。在非限制性实例中，CD2和TCRβ链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和TCRβ进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD2和TCRβ，(b)对T细胞进行修饰，使得CD2和TCRβ的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和TCRβ不表达(例如，通过编码CD2和/或TCRβ的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD2*TCRβ-tCARTΔCD2ΔTCRβ细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD4并且第二细胞外配体结合结构域结合TCRβ链，其中T细胞缺乏CD4和TCRβ链，例如CD4*TCRβ-tCARTΔCD4ΔTCRβ细胞。在非限制性实例中，CD4和TCRβ链的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD4和TCRβ进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD4和TCRβ，(b)对T细胞进行修饰，使得CD4和TCRβ的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD4和TCRβ不表达(例如，通过编码CD4和/或TCRβ的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD4*TCRβ-tCARTΔCD4ΔTCRβ细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD7并且第二细胞外配体结合结构域结合CD2，其中T细胞缺乏CD7和CD2，例如CD7*CD2-tCARTΔCD7ΔCD2细胞。在非限制性实例中，CD7和CD2的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7和CD2进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD7和CD2，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD2的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD2不表达(例如，通过编码CD7和/或CD2的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD7*CD2-tCARTΔCD7ΔCD2细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD7并且第二细胞外配体结合结构域结合CD5，其中T细胞缺乏CD7和CD5，例如CD7*CD5-tCARTΔCD7ΔCD5细胞。在非限制性实例中，CD7和CD5的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7和CD5进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD7和CD5，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD5的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD5不表达(例如，通过编码CD7和/或CD5的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD7*CD5-tCARTΔCD7ΔCD5细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD7并且第二细胞外配体结合结构域结合CD4，其中T细胞缺乏CD7和CD4，例如CD7*CD4-tCARTΔCD7ΔCD4细胞。在非限制性实例中，CD7和CD4的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD7和CD4进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD7和CD4，(b)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD4的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD7和CD4不表达(例如，通过编码CD7和/或CD4的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD7*CD4-tCARTΔCD7ΔCD4细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD2并且第二细胞外配体结合结构域结合CD5，其中T细胞缺乏CD2和CD5，例如CD2*CD5-tCARTΔCD2ΔCD5细胞。在非限制性实例中，CD2和CD5的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和CD5进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD2和CD5，(b)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD5的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD5不表达(例如，通过编码CD2和/或CD5的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD2*CD5-tCARTΔCD2ΔCD5细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD2并且第二细胞外配体结合结构域结合CD4，其中T细胞缺乏CD2和CD4，例如CD2*CD4-tCARTΔCD2ΔCD4细胞。在非限制性实例中，CD2和CD4的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD2和CD4进行修饰，使得tCAR不再特异性结合经修饰的CD2和CD4，(b)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD4的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD2和CD4不表达(例如，通过编码CD2和/或CD4的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD2*CD4-tCARTΔCD2ΔCD4细胞中表达。
在另一个实施方案中，工程改造的T细胞包含串联嵌合抗原受体(tCAR)，其中一个细胞外配体结合结构域特异性结合CD5并且第二细胞外配体结合结构域结合CD4，其中T细胞缺乏CD5和CD4，例如CD5*CD4-tCARTΔCD5ΔCD4细胞。在非限制性实例中，CD5和CD4的缺乏由以下造成：(a)对T细胞表达的CD5和CD4进行修饰，使得嵌合抗原受体不再特异性结合经修饰的CD5和CD4，(b)对T细胞进行修饰，使得CD5和CD4的表达在T细胞中减少至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多，或(c)对T细胞进行修饰，使得CD5和CD4不表达(例如，通过编码CD5和/或CD4的基因的缺失或破坏)。在另外的实施方案中，T细胞包含自杀基因。在非限制性实例中，经修饰的人单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶(TK)基因的蛋白质编码序列与人CD34 cDNA的细胞外和跨膜结构域同框融合，并且在CD5*CD4-tCARTΔCD5ΔCD4细胞中表达。
在另一个实施方案中，线性串联CAR-T细胞包含嵌合抗原受体(CAR)多肽，所述多肽包含第一信号肽、第一细胞外配体结合结构域、第二细胞外配体结合结构域、铰链区、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域，以及信号转导结构域，其中第一细胞外配体结合抗原识别结构域和第二细胞外配体结合抗原识别结构域对不同的细胞表面分子，即癌细胞(例如，恶性T细胞、恶性B细胞或恶性浆细胞)上的抗原具有亲和力；并且其中线性串联CAR-T细胞具有一种或多种基因修饰、缺失或破坏，从而导致线性串联CAR-T细胞中细胞表面分子的表达降低。
在另一个实施方案中，信号肽是来自人CD8α的信号肽(SEQ ID NO:1)。
在第三实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含轻(V
在一些实施方案中，第二细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含轻(V
在另外的实施方案中，第一抗原识别结构域和第二抗原识别结构域通过5个氨基酸的短接头肽(GGGGS)连接。在一些实施方案中，此接头肽重复2、3、4、5或6次。
线性串联CAR构建体
在线性串联CAR构建体的一个实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含重(V
在线性串联CAR构建体的第二实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含重(V
在线性串联CAR构建体的第三实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含重(VL)和轻(VH)可变片段，命名为V
在线性串联CAR构建体的第四实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含重(V
对于线性串联CAR构建体实施方案中的每一个，第一和第二细胞外配体结合结构域靶向表面分子，即在恶性T细胞上表达的抗原，其选自但不限于BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim-3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56和CD1a。
下文在表6中给出线性串联CAR的另外实例。
表6.串联CAR和CAR-T(线性或发夹)。
例如，本文提供了线性串联CAR构建体，其可掺入靶向上表6中提供的任何抗原对的scFv的V
表7.线性串联CAR构建体。
发夹串联CAR构建体
在发夹串联CAR构建体的一个实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含两个重链可变片段，命名为V
在发夹串联CAR构建体的第二实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含两个重链可变片段，命名为V
在发夹串联CAR构建体的第三实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含两个轻链可变片段，命名为V
在发夹串联CAR构建体的第四实施方案中，第一细胞外配体结合结构域包含单链抗体片段(scFv)，其包含两个轻链可变片段，命名为V
对于发夹串联CAR构建体实施方案中的每一个，第一和第二细胞外配体结合结构域靶向表面分子，即在恶性T细胞上表达的抗原，其选自但不限于BCMA、CS1、CD38、CD138、CD19、CD33、CD123、CD371、CD117、CD135、Tim-3、CD5、CD7、CD2、CD4、CD3、CD79A、CD79B、APRIL、CD56和CD1a。
上文在表6中给出发夹串联CAR的另外实例。
此外，本文提供了可掺入靶向(1)CD2和CD3；以及(2)CD2和CD7的scFv的V
表8.发夹串联嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列。
另外，本文提供了发夹串联CAR构建体，其可掺入靶向表6中提供的任何抗原对的scFv的V
表9.发夹串联CAR构建体。
例如，本文在表10中提供了掺入CD2和CD3 scFv的V
表10.靶向CD2和CD3的发夹串联CAR构建体。
本文还在表11中提供了具有(Cys＝Cys)双链键(DSB)的发夹串联CAR构建体，其可掺入靶向表6中提供的任何抗原对的scFv的V
表11.具有(Cys＝Cys)双链键(DSB)的发夹串联DSB CAR构建体。
通过基因编辑以双或串联构造工程改造CAR的方法
在另一方面，可产生CAR-T细胞对照。例如，对照CAR-T细胞可包括与不在恶性T细胞上表达的抗原结合的细胞外结构域。例如，如果治疗性CAR-T细胞靶向诸如CD7的T细胞抗原，或诸如CD2和CD3的多个T细胞抗原，那么对照CAR-T细胞结合的抗原可以是CD19。CD19是在B细胞但不在T细胞上表达的抗原，因此具有适于结合CD19的细胞外结构域的CAR-T细胞将不与T细胞结合。这些CAR-T细胞可用作对照，以分析靶向感兴趣的癌症和/或识别感兴趣的抗原的CAR-T细胞的结合效率和非特异性结合。
CAR可如WO2018027036A1中所公开进行进一步设计，任选地采用本领域技术人员将已知的变型。可以如本文所公开的那样以及通过本领域已知的方法和从商业来源获得慢病毒载体和细胞系，并且设计、验证和合成指导RNA。
可使用逆转录病毒将工程改造的CAR引入T细胞中，所述逆转录病毒将编码嵌合抗原受体的核酸序列有效且稳定地整合到靶细胞基因组中。本领域已知的其他方法包括但不限于慢病毒转导、基于转座子的系统、直接RNA转染和CRISPR/Cas系统(例如，I型、II型或III型系统，其使用合适的Cas蛋白，诸如Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Casl Od、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966等)。也可使用锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。参见，例如，Shearer RF和Saunders DN,“Experimental design for stable genetic manipulation in mammaliancell lines:lentivirus and alternatives,”Genes Cells 2015年1月；20(1):1-10。
PI3K信号传导的操纵可以用于防止由组成型CAR自身信号传导引起的CAR-T细胞分化的改变，并促进长寿记忆T细胞的发育。在CAR-T制造和离体扩增期间PI3K的药理阻滞可以消除优先效应T细胞的发育，并使CAR-T效应/记忆比恢复至在空载体转导的T细胞中观察到的比率，这可以改善体内T细胞持久性和治疗活性。p110δPI3K的抑制可以增强肿瘤特异性治疗性CD8 T细胞的功效和记忆，而p110αPI3K的抑制则可以增加细胞因子的产生和抗肿瘤反应。
提出这一点是因为即使在不存在配体的情况下，T细胞表面上CAR的存在也可以改变其激活和分化。与scFv框架和信号传导结构域相关的通过CAR的组成型自身信号传导可以导致异常T细胞行为，包括分化改变和存活率降低。这很重要，因为CAR-T细胞在患者中的有效性与其体内寿命直接相关。CD28共刺激结构域的存在增加由持久性CAR自身信号传导引起的CAR-T细胞耗竭；4-1BB共刺激结构域的影响较小。此外，CD3-ζ显著增强PI3K、AKT、mTOR和糖酵解途径的组成型激活，并且相对于中央/干记忆细胞促进短时效应细胞的形成。参见，例如，Zhang W.等,“Modulation of PI3K signaling to improve CAR T cellfunction,”Oncotarget,2018年11月9日；9(88):35807–35808。
细胞因子基因缺失或抑制
除了对TCR以及细胞表面蛋白和抗原进行基因编辑外，还可对可分泌蛋白(诸如细胞因子和趋化因子)的基因进行编辑。将进行这样的编辑，例如以减少或防止细胞因子释放综合征(CRS)的发展或维持。CRS是由免疫细胞响应于免疫疗法(或其他免疫刺激)而大量、快速地释放细胞因子引起的。可以使用本领域已知的方法来完成一种或多种细胞因子或趋化因子基因的修饰、破坏或缺失，诸如基因消融(基因沉默)，其中通过基因序列信息的改变或缺失来消除基因表达。这可以使用本领域已知的基因工程工具来实现，所述工具诸如转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、CRISPR、小发夹RNA(shRNA)的转导、CAR到细胞因子的基因序列中的靶向转导等。
可以例如使用Cas9-CRISPR或通过将CAR靶向转导到细胞因子的基因序列中而从如本文公开的免疫效应细胞中缺失的细胞因子或趋化因子包括但不限于以下：XCL1、XCL2、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CX3CL1、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-18、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-5、GM-CSF、IL-6、IL-11、G-CSF、IL-12、LIF、OSM、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、LT-β、TNF-α、TNF-β、4-1BBL、APRIL、CD70、CD153、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCE、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、Epo、Tpo、Flt-3L、SCF、M-CSF、MSP、A2M、ACKR1、ACKR2、ACKR3、ACVR1、ACVR2B、ACVRL1、ADIPOQ、AGER、AGRN、AIMP1、AREG、BMP1、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMPR2、C10orf99、C1QTNF4、C5、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR6、CCR7、CD109、CD36、CD4、CD40LG、CD74、CER1、CHRD、CKLF、CLCF1、CMTM1、CMTM2、CMTM3、CMTM4、CMTM5、CMTM6、CMTM7、CMTM8、CNTF、CNTFR、COPS5、CRLF1、CSF1、CSF1R、CSF2、CSF3、CSF3R、CTF1、CX3CR1、CXCL16、CXCL17、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、EBI3、EDN1、ELANE、ENG、FAM3B、FAM3C、FAM3D、FAS、FASLG、FGF2、FLT3LG、FZD4、GBP1、GDF1、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF5、GDF6、GDF7、GDF9、GPI、GREM1、GREM2、GRN、HAX1、HFE2、HMGB1、HYAL2、IFNA10、IFNA14、IFNA16、IFNA2、IFNA5、IFNA6、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNK、IFNL1、IFNL3、IFNW1、IL10RA、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL17A、IL17B、IL17C、IL17D、IL17F、IL18BP、IL-19、IL1F10、IL1R1、IL1R2、IL1RAPL1、IL1RL1、IL1RN、IL20RA、IL20RB、IL21、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL25、IL26、IL27、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL31、IL31RA、IL32、IL33、IL34、IL36A、IL36B、IL36G、IL36RN、IL37、IL6R、IL6ST、INHA、INHBA、INHBB、INHBC、INHBE、ITGA4、ITGAV、ITGB1、ITGB3、KIT、KITLG、KLHL20、LEFTY1、LEFTY2、LIFR、LTA、LTB、LTBP1、LTBP3、LTBP4、MIF、MINOS1-、MSTN、NAMPT、NBL1、NDP、NLRP7、NODAL、NOG、NRG1、NRP1、NRP2、OSMR、PARK7、PDPN、PF4、PF4V1、PGLYRP1、PLP2、PPBP、PXDN、SCG2、SCGB3A1、SECTM1、SLURP1、SOSTDC1、SP100、SPP1、TCAP、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、THBS1、THNSL2、THPO、TIMP1、TNF、TNFRSF11、TNFRSF1A、TNFRSF9、TNFRSF10、TNFSF11、TNFSF12、TNFSF12-、TNFSF13、TNFSF13B、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、TNFSF4、TNFSF8、TNFSF9、TRIM16、TSLP、TWSG1、TXLNA、VASN、VEGFA、VSTM1、WFIKKN1、WFIKKN2、WNT1、WNT2、WNT5A、WNT7A和ZFP36。
这些基因的序列是本领域已知且可获得的。
ACT(CAR-T)疗法的适应症和护理标准
在一些实施方案中，本文公开和/或使用本文公开的方法产生的基因组编辑的免疫效应细胞表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，并且可以用作药物，即用于治疗疾病。在许多实施方案中，细胞是CAR-T细胞。
本文公开和/或使用本文公开的方法产生的细胞可用于免疫疗法和过继性细胞转移，以用于治疗或制造药物以用于治疗癌症、自身免疫疾病、传染病和其他病状。
癌症可以是血液系统恶性肿瘤或实体肿瘤。血液系统恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及其亚型。淋巴瘤可以多种方式归类，通常基于恶性细胞的基础类型，包括霍奇金淋巴瘤(通常是Reed-Sternberg细胞的癌症，但有时也起源于B细胞；所有其他淋巴瘤都是非霍奇金淋巴瘤)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤以及如本文定义和本领域已知的其他淋巴瘤。
B细胞淋巴瘤包括但不限于弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，以及如本文定义和本领域已知的其他淋巴瘤。
T细胞淋巴瘤包括T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、T细胞慢性淋巴细胞性白血病(T-CLL)塞萨里(Sezary)综合征，以及如本文定义和本领域已知的其他淋巴瘤。
白血病包括急性髓性(或骨髓性)白血病(AML)、慢性髓性(或骨髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞性(或成淋巴细胞性)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)毛细胞白血病(有时归类为淋巴瘤)，以及如本文定义和本领域已知的其他白血病。
浆细胞恶性肿瘤包括淋巴浆细胞性淋巴瘤、浆细胞瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，所述药物可以用于治疗患者的癌症，特别是用于治疗实体肿瘤，诸如黑素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤或癌瘤，诸如脑部肿瘤、头颈肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤(例如，非小细胞肺癌，NSCLC)、生殖道(例如，卵巢)肿瘤、上消化道肿瘤、胰腺肿瘤、肝脏肿瘤、肾脏系统(例如，肾)肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤和结肠直肠肿瘤。
在另一个实施方案中，所述药物可以用于治疗患者的癌症，特别是用于治疗选自多发性骨髓瘤和急性髓性白血病(AML)的血液系统恶性肿瘤以及选自T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)、非霍奇金淋巴瘤和T细胞慢性淋巴细胞性白血病(T-CLL)的T细胞恶性肿瘤。
在一些实施方案中，所述细胞可用于治疗自身免疫疾病，诸如狼疮、自身免疫性(类风湿性)关节炎、多发性硬化症、移植排斥、克罗恩病、溃疡性结肠炎、皮炎等。在一些实施方案中，细胞是嵌合自身抗体受体T细胞，或展示抗原或其片段而非抗体片段的CAR-T；在过继性细胞转移的这一型式中，引起自身免疫疾病的B细胞将试图攻击工程改造的T细胞，后者将把其杀伤以做出反应。
在一些实施方案中，细胞可用于治疗传染病，诸如HIV和结核病。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞可以经历稳健的体内T细胞扩增并且可以持续延长量的时间。
在一些实施方案中，用本公开的CAR-T细胞治疗患者可以是改善、治愈或预防性的。它可以是自体免疫疗法的一部分，也可以是同种异体免疫疗法的一部分。自体是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群均来源于所述患者或来源于人白细胞抗原(HLA)相容的供体。同种异体是指用于治疗患者的细胞或细胞群不来源于患者，而是来源于供体。
用本公开的CAR-T细胞治疗癌症可与选自以下的一种或多种疗法组合：抗体疗法、化学疗法、细胞因子疗法、树突状细胞疗法、基因疗法、激素疗法、放射疗法、激光疗法以及放射疗法。
本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群的施用通过气雾剂吸入、注射、摄取、输液、植入或移植进行。本文所述的CAR-T细胞组合物，即单CAR、双CAR、串联CAR，可皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内或淋巴管内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本公开的细胞组合物优选通过静脉内注射施用。
CAR-T细胞或CAR-T细胞群的施用可以由以下组成：施用10
在另一个实施方案中，肠胃外施用有效量的CAR-T细胞或CAR-T细胞群或包含那些CAR-T细胞的组合物。施用可以是静脉内施用。可以通过在肿瘤内注射直接进行CAR-T细胞或CAR-T细胞群或包含那些CAR-T细胞的组合物的施用。
在本公开的一个实施方案中，将CAR-T细胞或CAR-T细胞群与任何数量的相关治疗方式结合(例如，在其之前、与其同时或在其之后)施用给患者，所述相关治疗方式包括但不限于使用细胞因子进行治疗，或从CAR-T内表达细胞因子，所述细胞因子增强T细胞增殖和持久性并且包括但不限于IL-2、IL-7和IL-15或其类似物。
在一些实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与抑制免疫抑制途径的剂组合使用，所述剂包括但不限于TGFβ的抑制剂、白介素10(IL-10)、腺苷、VEGF、吲哚胺2,3双加氧酶1(IDO1)、吲哚胺2,3-双加氧酶2(IDO2)、色氨酸2-3-双加氧酶(TDO)、乳酸盐、低氧、精氨酸酶以及前列腺素E2。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与T细胞检查点抑制剂组合使用，所述T细胞检查点抑制剂包括但不限于抗CTLA4(依匹木单抗(Ipilimumab))、抗PD1(派姆单抗(Pembrolizumab)、纳武单抗(Nivolumab)、塞普利单抗(Cemiplimab))、抗PDL1(阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿维单抗(Avelumab)、德瓦鲁单抗(Durvalumab))、抗PDL2、抗BTLA、抗LAG3、抗TIM3、抗VISTA、抗TIGIT和抗KIR。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与T细胞激动剂组合使用，所述T细胞激动剂包括但不限于刺激CD28、ICOS、OX-40、CD27、4-1BB、CD137、GITR和HVEM的抗体。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与治疗性溶瘤病毒组合使用，所述溶瘤病毒包括但不限于逆转录病毒、小核糖核酸病毒、弹状病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与免疫刺激疗法组合使用，所述免疫刺激疗法诸如toll样受体激动剂，包括但不限于TLR3、TLR4、TLR7和TLR9激动剂。
在另一个实施方案中，本公开的CAR-T细胞或CAR-T细胞群可与干扰素基因(STING)激动剂的刺激物，诸如环GMP-AMP合酶(cGAS)组合使用。
在过继性细胞转移疗法后，免疫效应细胞发育不全，特别是T细胞发育不全也是一个问题。当所治疗的恶性肿瘤是T细胞恶性肿瘤，并且CAR-T细胞靶向T细胞抗原时，正常T细胞及其表达抗原的前体将耗尽，并且免疫系统将受损。因此，用于管理这些副作用的方法是伴随着疗法的。此类方法包括选择并保留非恶性T细胞或前体，无论是自体的还是同种异体的(任选地被工程改造成不引起排斥或不被排斥)，以便随后在CAR-T细胞耗竭或失活后进行扩增并重新输注到患者体内。可替代地，识别并杀伤携带TCR的细胞的子集，诸如正常和恶性TRBC1
定义
除非本文具体定义，否则所使用的所有科技术语具有与基因疗法、生物化学、遗传学和分子生物学领域的技术人员通常所理解的相同的含义。与本文所描述的那些类似或等同的所有所公开的组合物和方法可以用于实践或测试本公开。
如本文所用，以下术语具有所指定的含义。当公开值的范围并使用“从n
如本文所用，术语“约”旨在限定其修饰的数值，表明所述值是误差幅度内的变量。当没有详述特别的误差幅度，诸如在数据图或表中给定的平均值的标准偏差时，术语“约”应理解为表示将涵盖所述值的范围，和考虑到有效数字，可以被所述数字的上下舍入(rounding up or down)所包括的范围。
关于细胞的术语“激活”(及其其他词形变化)通常被理解为与“刺激”同义，并且如本文所用，是指导致细胞群扩增的细胞处理。在T细胞中，激活通常通过暴露于CD2和CD28(有时还包括CD2)激动剂来实现的，所述激动剂通常是抗体，任选地包被在磁珠上或与胶体聚合物基质缀合。
如本文所用，术语“抗原”是由T细胞受体或嵌合抗原受体识别(即，是其靶标)的细胞表面蛋白。在传统意义上，抗原是由抗体识别的物质，通常是蛋白质，但就CAR包含抗体衍生的结构域，诸如识别一个或多个抗原的轻链(V
术语“癌症”是指细胞在体内的恶性或异常生长。许多不同的癌症可以通过特定的细胞表面蛋白或分子进行表征或鉴定。因此，总体来说，根据本公开的癌症可指可用免疫效应细胞诸如如本文所述的CAR-T细胞治疗的任何恶性肿瘤，其中免疫效应细胞识别并结合癌细胞上的细胞表面蛋白。如本文所用，癌症可指血液系统恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤、T细胞恶性肿瘤或B细胞恶性肿瘤。T细胞恶性肿瘤可包括但不限于T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)或非霍奇金淋巴瘤。癌症也可指实体肿瘤，诸如包括但不限于宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤和肺癌。
如本文所用，“细胞表面蛋白”是由细胞至少部分地在细胞表面上表达的蛋白质(或蛋白质复合物)。细胞表面蛋白的实例包括TCR(及其亚基)和CD7。
如本文所用且通常在本领域中使用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指具有细胞外配体结合结构域、跨膜结构域以及在细胞外配体结合结构域与靶细胞上存在的组分结合时指导细胞执行特化功能的信号转导结构域的重组融合蛋白。例如，CAR可以对具有激活T细胞受体的细胞内结构域的期望抗原(例如，肿瘤抗原)具有基于抗体的特异性，以产生表现出特异性抗靶标细胞免疫活性的嵌合蛋白。第一代CAR包括细胞外配体结合结构域和信号转导结构域，通常为CD3ζ或FcεRIγ。通过包括细胞内共刺激结构域(通常为4-1BB或CD28)，在第一代CAR构建体的基础上构建第二代CAR。与第一代CAR相比，这些共刺激结构域有助于增强CAR-T细胞的细胞毒性和增殖。第三代CAR包括多个共刺激结构域，主要用以增加CAR-T细胞的增殖和持久性。嵌合抗原受体与其他抗原结合剂的区别在于它们结合MHC非依赖性抗原并通过其细胞内结构域转导激活信号的能力。
“携带CAR的免疫效应细胞”是已经用至少一种CAR转导的免疫效应细胞。“CAR-T细胞”是已经用至少一种CAR转导的T细胞；CAR-T细胞可以是单、双或串联CAR-T细胞。CAR-T细胞可以是自体的，这意味着它们是从受试者自身的细胞工程改造而来的，或是同种异体的，这意味着所述细胞都来源于健康供体，并且在许多情况下，经过工程改造以免引起宿主抗移植物或移植物抗宿主反应。供体细胞也可来源于脐带血或由诱导多能干细胞产生。
双CAR-T细胞(dCAR-T)可以定义为这样的T细胞，其具有对在同一效应细胞内表达的不同靶抗原具有亲和力的两种不同的嵌合抗原受体多肽，其中各CAR独立发挥作用。CAR可从单个或多个多核苷酸序列表达。
串联CAR-T细胞(tCAR-T)可以定义为具有单个嵌合抗原多肽的T细胞，所述多肽包含对不同靶标具有亲和力的两个不同的细胞外配体结合结构域，其中细胞外配体结合结构域通过肽接头连接并共享一个或多个共同的共刺激结构域，其中任一细胞外配体结合结构域的结合将通过一个或多个共同的共刺激结构域和信号转导结构域进行信号传导。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂，以治疗在本公开描述的治疗性病状或病症。此类施用涵盖以基本同时的方式共同施用这些治疗剂，诸如以具有固定比例的活性成分的单个胶囊，或以每种活性成分的多个、分离的胶囊。此外，此类施用也涵盖以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将在治疗本文所述病状或病症方面提供药物组合的有益作用。
如本文所用，术语“组合物”是指与一种或多种治疗上可接受的载剂组合的免疫治疗性细胞群。
如本文所用，术语“疾病”意思通常与术语“病症”、“综合征”和“病状”(如在医学病状中)同义，并且与其可互换使用，因为其均反应人或动物身体或身体的一个部分的异常情况，所述异常情况损害正常的功能，通常通过有区别的病征和症状表现出来，并引起人或动物的寿命期缩短或生活质量降低。
如本文所用，术语“自相残杀”是指在CAR-T细胞成为包含与CAR-T细胞的靶标相同的嵌合抗原受体的另一CAR-T细胞的靶标并被其杀伤时发生的过程，这是由于靶向细胞表达被在这两个细胞上的嵌合抗原受体特异性识别的抗原。缺乏嵌合抗原受体所特异性结合的抗原的包含嵌合抗原受体的CAR-T细胞将是“具有自相残杀抗性的”。
如本文所用，术语“基因组编辑的”是指对基因进行添加、缺失或修饰以使其无功能。因此，在某些实施方案中，“基因编辑的CAR-T细胞”是这样的CAR-T细胞：其添加了识别至少一种抗原的基因，诸如CAR；和/或缺失了诸如由CAR识别的抗原基因的基因，和/或诸如TCR或其亚基(例如，α或β链)的基因缺失或被修饰以使其无功能，或缔合的CD3信号转导复合物的亚基或其亚基(例如，γ、δ、ε或ζ链)缺失或被修饰以使其无功能。
如本文所用，“自杀基因”是指通过本领域已知的标准方法引入CAR-T细胞的核酸序列，其在被激活时导致CAR-T细胞的死亡。如果需要，自杀基因可有助于在体内追踪和消除(即，杀伤)CAR-T细胞。通过激活自杀基因促进CAR-T细胞杀伤可以通过本领域已知的标准方法实现。本领域已知的自杀基因系统包括但不限于(a)单纯疱疹病毒(HSV)-tk，其将无毒前药更昔洛韦(GCV)转变为GCV-三磷酸，通过停止DNA复制而导致细胞死亡，(b)iCasp9可以与小分子AP1903结合并导致二聚化，从而激活固有的细胞凋亡途径，以及(c)在转导的T细胞中表达的可靶向表面抗原(例如，CD20和截短的EGFR)，其允许在施用相关单克隆抗体后，通过补体/抗体依赖性细胞毒性(CDC/ADCC)有效地消除经修饰细胞。
“癌细胞”例如是恶性T细胞、恶性B细胞或恶性浆细胞。
“恶性B细胞”是源自B细胞恶性肿瘤的B细胞。B细胞恶性肿瘤包括但不限于(DLBCL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，以及B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。
“恶性T细胞”是源自T细胞恶性肿瘤的T细胞。
术语“T细胞恶性肿瘤”是指源自T细胞前体、成熟T细胞或自然杀伤细胞的恶性肿瘤的广泛、高度异质性的分组。T细胞恶性肿瘤的非限制性实例包括T细胞急性成淋巴细胞性白血病/淋巴瘤(T-ALL)、人T细胞白血病病毒1型阳性(HTLV-1+)成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、成人T细胞淋巴瘤/白血病(HTLV-1相关)、侵袭性NK细胞白血病、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、ALK阳性、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、ALK阴性、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)、乳房植入物相关的间变性大细胞淋巴瘤、NK细胞的慢性淋巴增生性病症、鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、滤泡性T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、胃肠道惰性T细胞淋巴增生性病症、单形性亲上皮性肠道T细胞淋巴瘤(Monomorphic epitheliotrophic intestinal T-cell lymphoma)、蕈样肉芽肿、具有TFH表型的结内外周T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、NOS、原发性皮肤γδT细胞淋巴瘤、原发性皮肤CD8+侵袭性亲表皮细胞毒性T细胞淋巴瘤、原发性皮肤肢端CD8+T细胞淋巴瘤(Primary cutaneous acral CD8+T-cell lymphoma)、原发性皮肤CD4+小/中T细胞淋巴增生性病症[原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(C-ALCL)、淋巴样丘疹(lymphoidpapulosis)]、塞萨里综合征(Sezary syndrome)，皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、儿童系统性EBV+T细胞淋巴瘤，以及T细胞大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL)。
如本文所用，“健康供体”是不具有血液系统恶性肿瘤(例如T细胞恶性肿瘤)的供体。
术语“治疗可接受的”是指适于被用于接触患者组织且不产生不当的毒性、刺激和过敏反应，与合理的益处/风险比相当且对它们的预期用途而言有效的物质。
术语“治疗有效的”旨在限定用于治疗疾病或病症或实现临床终点的活性成分的量。
如本文所用，“可分泌蛋白”是由细胞分泌的对其他细胞有影响的蛋白质。例如，可分泌蛋白包括细胞因子、趋化因子和转录因子。
术语“供体模板”是指细胞用作模板以通过同源定向修复(HDR)DNA修复途径修复双链断裂的参考基因组材料。供体模板包含待插入基因组的DNA片段(包含待表达的基因、CAR或标志物)，其两个同源臂处于双链断裂位点的两侧。在一些实施方案中，供体模板可以是腺相关病毒、单链DNA或双链DNA。
在使物质组合物(诸如抗体)与其他物质组合物(诸如细胞)紧密接触的上下文中，如本文所用，术语“暴露于”旨在和“与...一起孵育”同义，并且使用一个术语代替另一个术语并不意味着需要更长的接触时间段。
术语“患者”通常与术语“受试者”同义，并且包括了包括人在内的所有哺乳动物。
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1-通过将CAR插入CD3e基因座中来制备和测试基因组编辑的CAR-T细胞的方法
可采取以下步骤来提供基因组编辑的CAR-T细胞，其中car由本文公开的基因编辑的基因座(CAR-T)表达。此实施例描述了CD7CARTΔCD7ΔCD3ε细胞的制备。如本领域技术人员将认识到的，尽管可能导致不同的效率，但是某些步骤可顺序进行或不按下面列出的顺序进行。
表12.用于除去免疫效应细胞上的表面抗原的指导RNA序列。
RNA；(ps)指示硫代磷酸酯。加下划线的碱基表示靶序列。
步骤1-T细胞激活(第0天)。
使用Miltenyi人泛T分离试剂盒从白细胞分离术腔室中纯化T细胞。重悬在培养基中。对细胞计数。确定获得3:1的珠粒:细胞比所需的人T细胞活化CD3/CD28珠粒的数目。用T细胞培养基洗涤珠粒2x。将细胞以1.256个细胞/mL稀释于hXcyte培养基中。添加人T细胞活化CD3/CD28珠粒。将4mL/孔的1.256个细胞/mL溶液等分到6孔板中。在37C下孵育细胞。
步骤2-CRISPR(第2天)。
通常使靶基因缺失并且将CAR插入基因编辑的基因座中。可以使用供体模板，使用同源定向修复来修复DNA双链断裂，以修复断裂并将期望序列插入编辑的基因座中。可使用Cas9 mRNA和针对靶标的gRNA，通过电穿孔实现靶标缺失。供体模板可以是DNA质粒，或与用Cas9/gRNA电穿孔的双链断裂周围的DNA具有同源性的双链线性DNA。另外，诸如AAV的病毒载体可用作供体模板的来源。然而，可以使用其他技术来诱导DNA双链断裂。这些包括其他基因组编辑技术，诸如TALEN和大范围核酸酶。
表13.CRISPR方案
方案–使用核转染仪4D(nucleofector 4D)进行核转染-每个反应4x10
步骤3-用包含HDR修复构建体的AAV载体转导T细胞。
在以1e4与1e6之间的MOI进行电穿孔后2-4h，将重组AAV6供体载体添加到细胞培养物中。
步骤4-评估CRISPR活性和Td效率(第10天)。
从每个样品中取出5x10
CAR-T细胞的纯化。在Miltenyi Automacs上使用CD34+细胞的阳性选择，可以在单个步骤中纯化CD34+(CAR+)和TCR阴性的细胞。这富集CAR+细胞，并除去TCR+细胞(因为CAR插入破坏TCR信号传导)。
步骤5-评估体内CAR-T活性
如果执行体内成像实验，则在NSG小鼠中注射肿瘤(5e5 MOLT3或HH：包含荧光素酶)。(第7天)
使用生物发光成像对小鼠的肿瘤负荷进行成像。通过尾静脉向每只小鼠I.V.注射2x10
实施例2-制备基因组编辑的串联tCAR-T细胞的方法
在实施例1中的方案的变型中，可以制备识别两种抗原的串联CAR-T细胞。在步骤2中，可以如上所述使两种抗原从细胞表面缺失或受抑制，这通过用针对两个靶标中的每一个的gRNA和Cas9mRNA进行电穿孔来实现。然后在步骤3中，用识别两个靶标的CAR转导此CAR-T细胞。串联CAR-T细胞的变型在图2中的示意图中示出。tCAR-T细胞的另外实例在表6中示出。
实施例3-基因组编辑的双CAR-T细胞或基因组编辑的串联CAR-T细胞
使用上述方法可制备几种类型的基因组编辑的双或串联CAR-T细胞。图1和图2示出串联和双CAR-T细胞的实例。所述图说明了待靶向的抗原，并且未指示串联CAR构建体中scFv表达的顺序。下文在表6-11中提供了另外的实例。
本文提供了串联和双CAR-T细胞的另外实例，其具有或不具有作为CAR的靶抗原并在CAR-T细胞上表达的一种或多种表面蛋白的缺失或抑制。一般来说，对于这些CAR-T细胞，具有多于一种抗原的缺失或抑制的实例将更可能具有更大的自相残杀抗性的益处。还应该注意的是，scFv在串联CAR中被定向的顺序在表6-11中列出，并且不是限制性的。例如，CD2*CD3ε包括具有取向CD2*CD3ε或取向CD3ε*CD2的tCAR。
本文提供了靶向在多发性骨髓瘤细胞上表达的抗原的单、串联和双CAR-T细胞的另外实例，其不具有或具有作为CAR的靶抗原并在CAR-T细胞上表达的一种或多种表面蛋白的缺失或抑制。一般来说，对于这些CAR-T细胞，具有多于一种抗原的缺失或抑制的实例将更可能具有更大的自相残杀抗性的益处。
实施例4-用基因组编辑的双或串联CAR-T细胞治疗患者
可使用通过如图1和图2所示的以上方法制备的细胞治疗患者。例如，可将扩增的双或串联CAR-T细胞群输注到患者体内。
双或串联CAR-T细胞靶向癌细胞而不诱发同种异体反应性。例如，CD2*CD3ε-dCARTΔCD2ΔCD3ε细胞将靶向携带CD2和CDε表面抗原的癌细胞(和其他非癌细胞)。
实施例5-在T-ALL的异种模型中测试CD2*CD3Δ-dCARTΔCD2ΔCD3ε的功效
在T-ALL的异种模型中测试CD2*CD3Δ-dCARTΔCD2ΔCD3ε的功效：将5x10
实施例6–基因组编辑的单CAR-T细胞
下文提供了靶向在血液系统恶性肿瘤上表达的抗原的基因组编辑的单CAR-T细胞的实例，其不具有或具有作为CAR的靶抗原并在CAR-T细胞上表达的一种或多种表面蛋白的缺失或抑制。一般来说，对于这些CAR-T细胞，具有多于一种抗原的缺失或抑制的实例将更可能具有更大的自相残杀抗性的益处。
实施例7-在激活前通过编辑制备的基因组编辑的UCART2/3细胞
在第0天，将细胞在解冻缓冲液中解冻。此后，将细胞重悬于培养基中并使其静息两个小时。收获细胞并计数。将所需数量的细胞在室温下以100xg离心10分钟。完全除去上清液，将细胞重悬于PBS(1ml)中并转移到微量离心管中，并在室温下以100xg离心10分钟。完全除去上清液，然后将细胞重悬于缓冲液P3中，计数，并将计数调整为5x10
在第1天，用T细胞TransAct
表14.T细胞TransAct
在第2天，每毫升培养基(8mg/ml储备液)中添加1μl的聚凝胺。添加所需量的病毒以得到所需的M.O.I(感染复数)。将细胞和病毒混合并放回37℃培养箱中。
在第3天，洗涤活化的细胞以除去刺激。
在第12天，FACS分析显示出CD3
实施例8-BCMA-CAR-T细胞的肿瘤细胞杀伤
首先使用51Cr标记的MM.1S靶细胞，使用标准的四小时铬释放(51Cr)测定在体外测试BCMA CAR-T的功效。为了能够进行体内追踪，对人骨髓瘤细胞系(BCMA+/CD19-)进行修饰，以表达与GFP融合的磕头虫红色荧光素酶(MM.1S-CG)。将CAR-T细胞与51Cr标记的MM.1S-CG细胞在一定范围的效应子(CAR-T)与靶标(MM.1S-CG)比率下一起孵育四小时，并且测量所释放的51Cr作为MM.1S-CG细胞死亡的标志物(图10B)。在多个效应子与靶标(E:T)比率下观察到有效杀伤。未转导的活化T细胞和CD19-CAR-T用作阴性对照并且不引起MM.1S-CG细胞的杀伤。接下来，通过向NSG小鼠中植入500,000个MM.1S-CG人骨髓瘤细胞(i.v.)来测试体内功效。二十八天后，当肿瘤负荷高时，不对小鼠进行治疗或用进行2X106个CD19-CAR-T或BCMA CAR-T进行治疗。与在第50天左右死亡的对照相比，用BCMA CAR-T治疗的所有七只小鼠都存活将近150天或更长(图10C)。BCMA CAR-T小组中死亡的一只小鼠的死因未知。流式细胞术分析揭示，在该小鼠中不存在GFP+肿瘤细胞。连续生物发光成像(BLI)揭示出在整个实验的持续时间内从未增加的背景信号水平的稳健降低(图10D)。
实施例9-CS1-CAR-T细胞的肿瘤细胞杀伤
通过将5x10
实施例10–靶向BCMA和CS1的串联(tCAR)的功效和细胞杀伤
在靶向BCMA和CS1的串联(tCAR)中表达两种scFv的双靶向的CAR-T经过设计，以试图改善骨髓瘤CAR-T细胞的功效和杀伤力。作为对照，串联CAR与单靶向的BCMA-CAR-T细胞和单靶向的CS1-CAR-T细胞一起测试。CD19-CAR-T细胞用作阴性对照。首先，确认每种scFv在tCAR中表达。为了实现这一点，如图12A所示，用表达各CAR构建体的慢病毒感染Jurkat细胞。将CAR-T细胞与各自用单独的荧光荧光团标记的人重组BCMA和CS1蛋白一起孵育。对阴性对照CAR-T细胞进行门控(蓝色)，并且实验性CAR-T细胞被覆盖(红色)。如所预期的，表达CD19 CAR的Jurkat细胞不结合BCMA或CS1蛋白(左下象限，图12B)。表达BCMA CAR蛋白的Jurkat细胞结合BCMA蛋白(左上象限，图12B)。表达CS1 CAR蛋白的Jurkat细胞结合CS1蛋白(右下象限，图12B)。表达串联BCMA-CS1 CAR蛋白的Jurkat细胞结合两种重组蛋白(右上象限，图12B)，表明两种scFv均有表达。
使用标准的四小时铬释放(
实施例11–用于gRNA选择的脱靶分析
指导RNA是由Washington University Genome Engineering&iPSC设计并验证活性的。指导RNA是由Washington University Genome Engineering&iPSC设计并验证活性的。与给定gRNA互补的序列可存在于整个基因组中，包括但不限于靶基因座。短序列脱靶杂交的可能性更大。类似地，gRNA内的一些长序列在整个基因组中可具有精确匹配(long_0)或近似匹配(long_1、long_2，分别代表单个或两个核苷酸差异)。这些也可脱靶杂交，从而实际上导致错误基因的编辑并降低编辑效率。
针对hCD2的2个外显子(CF58和CF59)进行选定gRNA的脱靶分析，以确定人基因组中为精确匹配或包含最多至1或2个错配的位点的数量，其可包括靶位点。结果在表15(对于外显子CF58)和表16(对于外显子CF59)中列出。
表15.hCD2(外显子CF58)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
表16.hCD2(CF59)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
通过下一代测序(NGS)针对gRNA活性对表15和表16中的gRNA序列进行归一化(相对于NHEJ的％归一化)。GFP用作对照。在测序分析后，基于脱靶谱，推荐以下gRNA：CF58.CD2.g1(41.2％)、CF58.CD2.g23(13.2％)、CF59.CD2.g20(26.6％)、CF59.CD2.g13(66.2％)、CF59.CD2.g17(17.5％)。归一化的NHEJ频率等于或大于15％的指导RNA(gRNA)是细胞系和动物模型创建项目的良好候选者。
针对hCD3E进行选定gRNA的脱靶分析，以确定人基因组中为精确匹配或包含最多至1或2个错配的位点的数量，其可包括靶位点。hCD3E的结果在表17中列出。
表17.hCD3E的指导RNA(gRNA)脱靶分析
通过下一代测序(NGS)针对gRNA活性对表17中的gRNA序列进行归一化(相对于NHEJ的％归一化)。GFP用作对照。在测序分析后，基于脱靶谱，推荐以下gRNA：MS1044.CD3E.sp28(>15％)和MS1044.CD3E.sp12(>15％)。归一化的NHEJ频率等于或大于15％的指导RNA(gRNA)是细胞系和动物模型创建项目的良好候选者。
针对hCD5的3个外显子(外显子3、外显子4和外显子5)进行选定gRNA的脱靶分析，以确定人基因组中为精确匹配或包含最多至1或2个错配的位点的数量，其可包括靶位点。结果在表18(对于外显子3)、表19(对于外显子4)和表20(对于外显子5)中列出。
表18.hCD5(外显子3)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
表19.hCD5(外显子4)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
表20.hCD5(外显子5)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
通过下一代测序(NGS)针对gRNA活性对表18、表19和表20中的gRNA序列进行归一化(相对于NHEJ的％归一化)。GFP用作对照。在测序分析后，基于脱靶谱，推荐以下gRNA：外显子3：SP597.hCD5.g2(76.5％)、SP597.hCD5.g22(36.3％)、SP597.hCD5.g39(16.0％)、SP597.hCD5.g46。外显子4：SP598.hCD5.g7、SP598.hCD5.g10(58.5％)。外显子5：SP599.hCD5.g5(51.0％)、SP599.hCD5.g30、SP599.hCD5.g42、SP599.hCD5.g58(41.0％)
针对hCSF2进行选定gRNA的脱靶分析，以确定人基因组中为精确匹配或包含最多至1或2个错配的位点的数量，其可包括靶位点。hCSF2的结果在表21中列出。
表21.hCSF2的指导RNA(gRNA)脱靶分析
通过下一代测序(NGS)针对gRNA活性对表21中的gRNA序列进行归一化(相对于NHEJ的％归一化)。GFP用作对照。在测序分析后，基于脱靶谱，推荐以下gRNA：MS1086.CSF2.sp8(>15％)和MS1086.CSF2.sp10(>15％)。
针对hCTLA4的2个外显子(外显子1和外显子2)进行选定gRNA的脱靶分析，以确定人基因组中为精确匹配或包含最多至1或2个错配的位点的数量，其可包括靶位点。hCTLA4的结果在表22(对于外显子1)和表23(对于外显子2)中列出。
表22.hCTLA4(外显子1)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
表23.hCTLA4(外显子2)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
通过下一代测序(NGS)针对gRNA活性对表22和表23中的gRNA序列进行归一化(相对于NHEJ的％归一化)。GFP用作对照。在测序分析后，基于脱靶谱，推荐以下gRNA：外显子1：SP621.hCTLA4.g2(>15％)和SP621.hCTLA4.g12(>15％)。外显子2：SP622.hCTLA4.g2(>15％)、SP622.hCTLA4.g9(>15％)和SP622.hCTLA4.g33(>15％)。
针对hPDCD1的2个外显子(CF60和CF61)进行选定gRNA的脱靶分析，以确定人基因组中为精确匹配或包含最多至1或2个错配的位点的数量，其可包括靶位点。结果在表24(对于外显子CF60)和表25(对于外显子CF61)中列出。
表24.hPDCD1(外显子CF60)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
表25.hPDCD1(CF61)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
通过下一代测序(NGS)针对gRNA活性对表24和表25中的gRNA序列进行归一化(相对于NHEJ的％归一化)。GFP用作对照。在测序分析后，基于脱靶谱，推荐以下gRNA：CF60.PDCD1.g12(65.6％)、CF60.PDCD1.g3(69.2％)、CF61.PDCD1.g6、CF61.PDCD1.g2(72.7％)和CF61.PDCD1.g35(24.0％)。
针对hTIM3的2个外显子(外显子2和外显子3)进行选定gRNA的脱靶分析，以确定人基因组中为精确匹配或包含最多至1或2个错配的位点的数量，其可包括靶位点。结果在表26(对于外显子2)和表27(对于外显子3)中列出。
表26.hTIM3(外显子2)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
表27.hTIM3(外显子3)的指导RNA(gRNA)脱靶分析
通过下一代测序(NGS)针对gRNA活性对表26和表27中的gRNA序列进行归一化(相对于NHEJ的％归一化)。GFP用作对照。在测序分析后，基于脱靶谱，推荐以下gRNA：外显子2：SP619.hTIM3.g12(45.0％)、SP619.hTIM3.g20(60.9％)和SP619.hTIM3.g49(45.4％)。外显子3：SP620.hTIM3.g5(58.0％)和SP620.hTIM3.g7(2.9％)。
本领域技术人员可以适当地改变以上公开的方法，以制备并确认本文公开的其他单、双和串联CAR-T细胞的活性。
虽然已参考以上实施例中的某些实施方案的具体细节描述了本发明，但应理解，修改和变型涵盖在本发明的精神和范围内。
机译： 用于治疗癌症的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）
机译： 用于治疗癌症的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）
机译： 嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗癌症
