一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用，该磁性印迹材料包括磁性颗粒基体，磁性颗粒基体表面具有细胞外囊泡印记；该磁性印迹材料的制备方法包括以下步骤：(1)制备磁性颗粒并进行表面官能团修饰；(2)将模板细胞外囊泡连接在磁性颗粒表面；(3)在磁性颗粒表面沿着细胞外囊泡生长出聚合物识别层；(4)超声清洗除去模板囊泡，得到表面具有细胞外囊泡印记的磁性印迹材料；该磁性印迹材料能够应用在体外分离细胞外囊泡。该磁性印迹材料能够高效地从细胞培养基、血浆及其他体液中捕获分离细胞外囊泡，捕获效率高，制备过程简单、产量大、成本低，使用方便、易于保存、无需大型仪器辅助，能够回收重复利用，可进一步降低成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种印迹材料及其制备方法与应用，更具体地，涉及一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用。

背景技术

细胞外囊泡(EVs)是一种由磷脂双分子层膜包裹的，直径介于30-200nm的细胞外囊泡，包括肿瘤细胞、内皮细胞、免疫细胞、血小板等多种细胞均可分泌。近年来，越来越多的研究表明，细胞外囊泡作为体内细胞间远程通信的一种手段，内包含丰富的DNA、RNA和蛋白质等物质。尤其对肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡而言，其中包含多种癌症特异性的蛋白质及核苷酸(mRNA，microRNA，以及DNA片段)，可作为癌症诊断、预测和治疗监测的循环生物标志物。然而，目前还没有标准有效的方法可以获得高纯度、高产量的细胞外囊泡。现有的获取方法有超速离心法、超滤和尺寸排阻色谱法、聚乙二醇沉淀法和免疫磁珠分离法，其中超速离心法是目前最常用的细胞外囊泡分离方法，可以处理较大量的样本并获得相对纯净的细胞外囊泡，但其耗时较长、仪器要求较高和较低的回收率，使得超高速离心法的使用范围得到限制；超滤和尺寸排阻色谱法处理样品体积过大，不适用于小体积样本(血清、血浆)中细胞外囊泡的收集；聚乙二醇沉淀法处理所获得细胞外囊泡成分不单一、杂质较多；免疫磁珠分离法虽然可以分离出到较为纯净的细胞外囊泡，但抗体价格昂贵、不易保存，这极大的限制了免疫分离法的广泛使用应用。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种能够高效地捕获分离细胞外囊泡、制备过程简单、易于储存、成本低的细胞外囊泡磁性印迹材料的制备方法；本发明的另一目的是提供该细胞外囊泡磁性印迹材料的应用。

技术方案：本发明所述的细胞外囊泡磁性印迹材料，包括磁性颗粒，磁性颗粒表面具有细胞外囊泡印记。

其中，磁性颗粒为Fe

本发明所述的细胞外囊泡磁性印迹材料的制备方法包括以下步骤：

(1)制备磁性颗粒并进行表面官能团化；

(2)将模板细胞外囊泡连接在磁性颗粒表面；

(3)利用分子印记反应，通过硅氧烷聚合反应，在磁性颗粒表面沿着胞外囊泡生长出聚合物识别层；

(4)超声清洗除去磁性颗粒表面的模板细胞外囊泡，得到具有细胞外囊泡印记的细胞外囊泡磁性印迹材料。

其中，步骤1中对磁性颗粒进行表面功能化时先将磁性颗粒在水中分散为1～2mg/mL的溶液，再加入体积分数为1％～5％的功能化硅烷试剂得到混合溶液，使其在室温下反应，其中功能化硅烷试剂为含有氨基的硅烷试剂或者含有羧基的硅烷化试剂。

其中，步骤2中通过共价键将模板细胞外囊泡连接在磁性颗粒表面，包括以下步骤：

(21)通过活化磁珠表面氨基或者磁性颗粒表面羧基，得到活化后的磁性颗粒；

(22)超速离心纯化得到模板细胞外囊泡，将细胞外囊泡与活化后的磁性颗粒在磷酸缓冲溶液中反应，得到表面连接有细胞外囊泡的磁性颗粒复合物。其中，细胞外囊泡和活化后的磁性颗粒质量比为0.5～5μg：1mg。

其中，步骤2中通过非共价键将模板细胞外囊泡连接在磁性颗粒表面，包括以下步骤：

(21)利用戊二醛活化磁性颗粒表面氨基，得到醛基化的磁性颗粒；

(22)在醛基化磁性颗粒内加入氨基化适配体或者抗体在室温条件下反应，得到适配体或抗体修饰的磁性颗粒；

(23)将超速离心纯化的细胞外囊泡与适配体或抗体修饰的磁性颗粒在缓冲溶液中混合，通过抗原-抗体结合或者适配体-蛋白特异性结合，得到表面连接有细胞外囊泡的磁性颗粒复合物；其中，细胞外囊泡和活化后的磁性颗粒质量比为0.5～5μg：1mg，抗体为CD63抗体、CD81抗体或CD9抗体，适配体为CD63、CD81、CD9、EpCAM、PTK7、PSA、LZH8、Lib所对应的适配体。

其中，步骤3包括以下步骤：

(31)将磁性颗粒复合物分散到缓冲溶液中，加入正硅酸乙酯，室温反应，磁性颗粒复合物与正硅酸乙酯的质量比为1mg：1～10μg；

(32)在反应产物中加入硅烷化试剂，通过水解反应在磁性颗粒复合物表面沿着细胞外囊泡表面聚合生长，形成识别层，水解反应温度为10～25℃，其中磁性颗粒复合物与硅烷化试剂的质量比为1mg：1～10μg，硅烷化试剂体积分数为0.5％～10％，识别层形成所需要的时间为8～72h，其中硅烷化试剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、羟甲基三乙氧基硅烷、丙基三乙氧基硅烷或苄基三乙氧基硅烷其中的至少一种。

其中，步骤4中超声清洗除去模板细胞外囊泡的功率为25～45Hz，超声的时间为2～10min。

本发明所述的细胞外囊泡磁性印迹材料应用在体外分离细胞外囊泡中。

制备原理：本发明通过表面印记的方法，利用磁性颗粒作为载体，有机硅烷作为构建模块，以细胞外囊泡作为模板，制备出带有细胞外囊泡印记的细胞外囊泡磁性印迹材料，制备时利用硅氧烷聚合水解使有机硅层可继续生长的特性，使硅氧烷单体混合物在磁性颗粒表面沿着模板细胞外囊泡继续生长出一层二氧化硅识别层，通过超声清洗除去模板细胞外囊泡模板，在磁性颗粒表面留下具有特异性识别和捕获细胞外囊泡的空穴，本发明提出的细胞外囊泡磁性印迹材料同时具有磁性和细胞外囊泡捕获功能，能够利用磁铁快速分离，且有利于清洗除去多余的杂质，无需额外的设备，即可用于细胞外囊泡的快速捕获、收集和分析。

有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是：1、本发明提出的细胞外囊泡磁性印迹材料能够高效地从细胞培养基、血浆及其他体液中捕获分离细胞外囊泡，捕获效率高；2、制备过程简单、产量大、成本低；3、本发明提出的细胞外囊泡磁性印迹材料能够应用于体外分离细胞外囊泡，使用方便、易于保存、无需大型仪器辅助；4、能够回收重复利用，进一步降低成本。

附图说明

图1是细胞外囊泡磁性印迹材料制备过程示意图；

图2是Fe

图3是EVs-Fe

图4是生长有细胞外囊泡识别层的磁性颗粒扫描电镜图；

图5是表面有细胞外囊泡印记的磁性印迹材料扫描电镜图；

图6是捕获有细胞外囊泡的磁性印迹材料扫描电镜图；

图7是细胞外囊泡磁性胶体循环使用5次的捕获效率。

具体实施方式

制备细胞外囊泡磁性印迹材料过程如图1所示，将模板细胞外囊泡通过氨基连接在磁性颗粒表面，通过硅氧烷聚合反应，在磁性颗粒表面沿着胞外囊泡生长出聚合物识别层，最后超声清洗除去磁性颗粒表面的模板细胞外囊泡，得到具有细胞外囊泡印记的细胞外囊泡磁性印迹材料，具体过程如下：

(1)制备Fe

取2.70g六水合三氯化铁、7.20g醋酸钠溶于100mL乙二醇中，搅拌均匀，至于烘箱中以240℃反应12小时，形成Fe

将所制备得到的Fe

(2)氨基化Fe

将30mg氨基化Fe

取超速离心纯化的细胞外囊泡25μg，将细胞外囊泡和10mg表面活化的Fe

(3)在EVs-Fe

将24mgEVs-Fe

(4)除去生长有细胞外囊泡识别层的磁性颗粒的模板细胞外囊泡

将生长有细胞外囊泡识别层的磁性颗粒置于洗脱液中水浴超声30min除去模板细胞外囊泡，洗脱液为含有0.1mol/L HCl+0.01％Txiton X-100的水溶液，超声功率为45HZ；将产物继续超声20min，利用去离子水清洗，干燥，即得到表面有细胞外囊泡印记的磁性印迹材料，其扫描电镜图如图5所示：左侧为较大范围图，右侧为局部放大图。

实施例2

制备细胞外囊泡磁性印迹材料过程如图1所示，利用羧基化磁性纳米颗粒，将模板细胞外囊泡连接在磁性颗粒表面，然后利用分子印记反应，通过硅氧烷聚合反应，在磁性颗粒表面沿着胞外囊泡生长出聚合物识别层，最后超声清洗除去磁性颗粒表面的模板细胞外囊泡，得到具有细胞外囊泡印记的细胞外囊泡磁性印迹材料具体过程如下：

(1)制备Fe

取2.70g六水合三氯化铁、7.20g醋酸钠溶于100mL乙二醇中，搅拌均匀，至于烘箱中以240℃反应12小时，形成Fe

将所制备得到的Fe

(2)羧基化Fe

将Fe

取超速离心纯化的细胞外囊泡25μg，将细胞外囊泡和10mg表面活化的Fe

(3)在EVs-Fe

将24mgEVs-Fe

(4)除去生长有细胞外囊泡识别层的磁性颗粒的模板细胞外囊泡

将生长有细胞外囊泡识别层的磁性颗粒置于洗脱液中水浴超声30min除去模板细胞外囊泡，洗脱液为含有0.1mol/L HCl+0.01％Txiton X-100的水溶液，超声功率为45HZ；将产物继续超声20min，利用去离子水清洗，干燥，即得到表面有细胞外囊泡印记的磁性印迹材料。

实施例3

制备细胞外囊泡磁性印迹材料过程如图1所示，通过利用适配体-囊泡特异性结合，将模板细胞外囊泡连接在磁性颗粒表面，通过硅氧烷聚合反应，在磁性颗粒表面沿着胞外囊泡生长出聚合物识别层，最后超声清洗除去磁性颗粒表面的模板细胞外囊泡，得到具有细胞外囊泡印记的细胞外囊泡磁性印迹材料，具体过程如下：

(1)制备Fe

取2.70g六水合三氯化铁、7.20g醋酸钠溶于100mL乙二醇中，搅拌均匀，至于烘箱中以240℃反应12小时，形成Fe

将所制备得到的Fe

(2)磁性颗粒通过适配体-靶标特异性结合连接细胞外囊泡

将30mg氨基化Fe

100μL浓度为10μM的氨基化CD63适配体加入到20mL浓度为1mg/mL的醛基化磁性颗粒溶液当中，通过醛胺缩合反应，连接在磁性颗粒的表面；

Fe

适配体的序列为5'-CAC CCC ACC TCG CTC CCG TGA CAC TAA TGC TA-3'。

(3)在EVs-Fe

将24mgEVs-Fe

(4)除去生长有细胞外囊泡识别层的磁性颗粒的模板细胞外囊泡

将生长有细胞外囊泡识别层的磁性颗粒置于洗脱液中水浴超声30min除去模板细胞外囊泡，洗脱液为含有0.1mol/L HCl+0.01％Txiton X-100的水溶液，超声功率为45HZ；将产物继续超声20min，利用去离子水清洗，干燥，即得到表面有细胞外囊泡印记的磁性印迹材料。

实施例4

本实施例与实施例3相比，区别在于：将步骤3中所用适配体为EpCAM蛋白适配体，所用适配体序列为5'-CAC TAC AGA GGT TGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGG GTTGGC CTG-3'。

实施例5

本实施例与实施例3相比，区别在于：将步骤3中所用适配体为CA125蛋白适配体，所用适配体序列为5'-TAT CAA TTA CTT ACC CTA GTG GTG TGA TGT CGT ATG GAT G-3'。

实施例6

本实施例与实施例3相比，区别在于：将步骤3中所用适配体为HER2蛋白适配体，所用适配体序列为5'-GGG CCG TCG AAC ACG AGC ATG GTG CGT GGA CCT AGG ATG ACC TGAGTA CTG TCC-3'。

实施例7

本实施例与实施例3相比，区别在于：将步骤3中所用适配体为PTK7蛋白适配体，所用适配体序列为5'-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3'。

实施例8

本实施例与实施例3相比，区别在于：将步骤3中所用适配体为PSA蛋白适配体，所用适配体序列为5'-AAT TAA AGC TCG CCA TCA AAT AGC-3'。

实施例9

本实施例与实施例3相比，区别在于：将步骤3中所用适配体为LZH8蛋白适配体，所用适配体序列为5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA TAT TAG TAC GGC TTA ACC CPC ATG GTGGAC ACG GTG GCT TAG T-3'。

实施例10

本实施例与实施例3相比，区别在于：将步骤3中所用适配体为Lib蛋白适配体，所用适配体序列为5'-CAC CCC ACC TAA AAA AAA AAA CAC TAA TGC TA-3'。

实施例11

制备细胞外囊泡磁性印迹材料过程如图1所示，通过利用抗原-抗体特异性结合，将模板细胞外囊泡连接在磁性颗粒表面，然后利用分子印记反应，通过硅氧烷聚合反应，在磁性颗粒表面沿着胞外囊泡生长出聚合物识别层，最后超声清洗除去磁性颗粒表面的模板细胞外囊泡，得到具有细胞外囊泡印记的细胞外囊泡磁性印迹材料，具体过程如下：

(1)制备Fe

取2.70g六水合三氯化铁、7.20g醋酸钠溶于100mL乙二醇中，搅拌均匀，至于烘箱中以240℃反应12小时，形成Fe

将所制备得到的Fe

(2)磁性颗粒通过抗原-抗体特异性结合连接细胞外囊泡

将30mg氨基化Fe

100μL浓度为1mg/mL的CD63抗体加入到10mL浓度为1mg/mL的醛基化磁性颗粒，通过醛胺缩合反应，连接在磁性颗粒的表面；

通过抗原-抗体特异性结合，将EVs连接到磁性颗粒的表面，得到EVs-Fe

(3)在EVs-Fe

将24mgEVs-Fe

(4)除去生长有细胞外囊泡识别层的磁性颗粒的模板细胞外囊泡

将生长有细胞外囊泡识别层的磁性颗粒置于洗脱液中水浴超声30min除去模板细胞外囊泡，洗脱液为含有0.1mol/L HCl+0.01％Txiton X-100的水溶液，超声功率为45HZ；将产物继续超声20min，利用去离子水清洗，干燥，即得到表面有细胞外囊泡印记的磁性印迹材料。

实施例12

本实施例与实施例11相比，区别在于：将步骤3中所用抗体为CD9蛋白抗体。

实施例13

本实施例与实施例11相比，区别在于：将步骤3中所用抗体为CD81蛋白抗体。

实施例14

验证该细胞外囊泡磁性印迹材料的捕获能力，方法如下：

将健康人血浆使用PBS稀释1000倍，取1mL与2mg细胞外囊泡磁性印迹材料均匀混合，室温震荡反应20min，反应结束后，通过磁分离除去上清液，并使用磷酸缓冲溶液清洗两次，最终沉淀放置在含有2.5％戊二醛的磷酸缓冲溶液中4℃孵育过夜固定，后经过30％，50％，70％，80％，90％，95％及100％的乙醇梯度脱水、干燥。所得最终产物的扫描电子显微镜图见图6，可见磁性印迹材料的表面的印记消失，并出现很多细胞外囊泡颗粒，说明该细胞外囊泡磁性印迹材料可从血浆中快速的捕获并收集细胞外囊泡。

实施例15

验证该细胞外囊泡磁性印迹材料的重复捕获胞外囊泡的能力，方法如下：

将健康人血浆使用PBS稀释1000倍，取5mL与10mg细胞外囊泡磁性印迹材料均匀混合，室温震荡反应20min，反应结束后，通过磁分离收集沉淀。利用酶联免疫吸附法测定捕获前后溶液中细胞外囊泡的浓度，计算捕获效率。之后，利用洗脱液清洗所得沉淀，除去细胞外囊泡，之后分别使用乙醇和水清洗三遍，可用于下一轮捕获，洗脱液为含有0.1mol/L HCl+0.01％Txiton X-100的水溶液。整个过程共进行5遍，实验结果表明，在反复使用5次之后，该磁性印迹材料依然保留较高的捕获效率，所计算得到的循环5次的捕获效率见图7。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种细胞外囊泡磁性印迹材料及其制备方法与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caccccacct cgctcccgtg acactaatgc ta 32

<210> 2

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctg 48

<210> 3

<211> 40

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tatcaattac ttaccctagt ggtgtgatgt cgtatggatg 40

<210> 4

<211> 54

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggccgtcga acacgagcat ggtgcgtgga cctaggatga cctgagtact gtcc 54

<210> 5

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41

<210> 6

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aattaaagct cgccatcaaa tagc 24

<210> 7

<211> 60

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atccagagtg acgcagcata ttagtacggc ttaaccccat ggtggacacg gtggcttagt 60

<210> 8

<211> 32

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

caccccacct aaaaaaaaaa acactaatgc ta 32